פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

פרוטוקול זה דורש שימוש שיפוע צפיפות אחת מה שהופך אותו באופן משמעותי פחות עבודה אינטנסיבית וחסכונית יותר בהשוואה לשיטות בידוד איון קונבנציונליות מורכבות יותר. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא כי האנזים מועבר ישירות ללבלב וכתוצאה מכך עיכול רקמות משופרת ותפוקת איון מוגברת. התחל על ידי הקשה על הגפיים של העכבר בתמקמת supine ו ריסוס הגוף עם 70% אתנול.

באמצעות ממטרות coverglass ומספריים כירורגיים מעוקל, לעשות חתך עור בטן אופקי כשלושה סנטימטרים ולמשוך לפתוח את העור כדי לחשוף את דופן הבטן. בצע חתך אנכי של שלושה עד ארבעה סנטימטרים על צפק הבטן כדי לחשוף באופן מלא את הלבלב ולמקם את העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח. לדחוף את האונה הכבד מעולה לחשוף את צינור המרה המופיע צינור ורוד חיוור בעדינות להזיז את המעיים מאזור המותני הימני iliac מימין לחלל הבטן כדי לחשוף את צינור המרה ואת עורק הכבד.

השתמשו ב-Schwartz micro serrefines כדי להדק בזהירות את צינור המרה המשותף קרוב ככל האפשר לכבד ולזהות את האמפולה של ואגר הממוקמת בבית האפיפיורות ונוצרת על ידי איחוד צינור הלבלב וצינור המרה המשותף. באמצעות מטחות מיקרו אדסון כדי למשוך את צינור המרה המשותף לימד, להכניס מחט 30 מד חצי אינץ', מחובר מזרק שלושה מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של פתרון P קולגנס מוכן טרי לתוך אמפולה של ויטר דוחף את המחט לתוך הצינור במקביל לכלי במשך כרבע אורך הכלי. ברגע המחט היא במקום, לייצב את המחט עם מטח מיקרו אדסון לאט ובהתמדה להזריק שלושה מיליליטר של פתרון קולגנס P לתוך הצינור.

הזריקה נחשבת מוצלחת אם אזורי הראש, הצוואר, הגוף והזנב של הלבלב מנופחים לחלוטין. כניסה נכונה לתוך אמפולה ו cannulation של צינור המרה המשותף הם קריטיים עבור קציר עיכול מוצלח. פירסינג הקירות צינורית מפחית את היעילות של הבידוד.

באמצעות מדפים מעוגלים ומיקרו אדסון, בזהירות לשלוף את הלבלב מנופח החל הטחול וממשיך לכיוון הבטן לאורך התריסיון. לאחר מכן מניחים את הלבלב בצינור עיכול 50 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של תוסף קולגנס P קר כקרח. כדי לקצור את האיים, ראשית להשתמש מספריים כירורגיים עדין לקצוץ את הלבלב במשך שלוש עד חמש שניות לפני הצבת הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ב 100 עד 120 סיבובים לדקה במשך 12 עד 13 דקות.

בסוף הדגירה, בעדינות לנער את הצינור במשך כ 30 שניות כדי לשבש את הרקמה עד הפתרון הוא הומוגני כפי שאושר על ידי חלקיקי רקמת הלבלב דמוי חול בסדר. ברגע שהרקמות מתעכלות, מניחים את הצינור על קרח ומוסיפים 40 מיליליטר של פתרון עצירה קרה כקרח כדי לסיים את התגובה האנזימטית. לאחר שיבוש עדין של גלולה, לסובב את הרקמה מתעכל צנטריפוגה דלי מתנדנד ואחריו שני צנטריפוגות עם 20 מיליליטר של פתרון עצירה טרי לכל לשטוף.

לאחר הכביסה האחרונה, תן שימוש חוזר את גלולה ב 40 מיליליטר של HBSS קר כקרח עבור שלוש שטיפות נוספות, resuspending את גלולה בחמישה מיליליטר של פתרון שיפוע טמפרטורת החדר לאחר הכביסה האחרונה. Vortex הצינור לזמן קצר במהירות נמוכה עד הפתרון הוא homogenized לפני הוספת עוד חמישה מיליליטר של שיפוע טמפרטורת החדר לצינור. עכשיו להשתמש פיפטה 10 מיליליטר בעדינות ולאט לאט להוסיף 10 מיליליטר של טמפרטורת החדר HBSS לצינור בצורה טיפה חכם כדי לאפשר היווצרות של שיפוע ולהשתמש צנטריפוגה דלי מתנדנד לבודד את אוכלוסיות התאים על ידי הפרדת שיפוע צפיפות.

בסוף הצנטריפוגה, השתמש פיפט 10 מיליליטר רטוב מראש עם HBSS קר לאסוף חמישה עד 10 מיליליטר של שכבת האיון בין שיפוע הצפיפות HBSS. להעביר את האיים לתוך צינור חדש 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של HBSS קר קרח טרי ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה דלי מתנדנד. בזהירות שאפו את כל אבל שלושת המיליליטרים האחרונים של supernatant מבלי להפריע גלולה ולשטוף את האיים לפחות שלוש פעמים נוספות עם 20 מיליליטר של HBSS טרי לכל לשטוף.

לאחר הכביסה האחרונה, להחליף את supernatant עם ארבעה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס RMPI 1640 בינוני בעדינות מערבל את הצינור כדי לסלק את גלולה. מיד לשפוך את האיים לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר ולשטוף את הצינור עם חמישה מיליליטר של מדיום RPMI טרי 1640 כדי לאסוף את כל האיים הנותרים אוסף את הכביסה עם האיים האחרים. לאחר מכן השתמשו במיקרוסקופ ניתוח ובטיפ פיפט של 20 מיקרוליטר כדי לבחור איונים חומים כדוריים או מלבניים בריאים עם משטח חלק מצלחת פטרי להעברה לצלחת פטרי חדשה המכילה 10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 שלם.

כאשר כל האיים נאספו, מניחים את האיים באיים באינקובטור סטרילי ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באוויר לח לילה. נראה כי לאיים בריאים וטובים יש צורה עגולה חלקה ואילו איונים פגומים רעים מפגינים קצוות מחוספסים. רקמה אקסוקרינית מעוכלת היא שקופה במראה ומדגימה צורה לא סדירה.

קנולציה נכונה והפצה של אנזים קולגנס P יכול להיות מאושר על ידי אינפלציה של החלק הטחול של הלבלב. דגירה לילה במדיה גלוקוז נמוכה יכולה לגרום לאיים להערכה של הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז למחרת ומאפשרת תובנה לגבי יכולת הפרשת האינסולין של איונים.