Name: פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: למד פרוטוקול פשוט לבידוד איוני לבלב מעכברים באמצעות הזרקת קולגנז ישירות ללבלב. השיטה מייצרת 250-350 איונים איכותיים לכל עכבר ומפשטת את תהליך הפרדת השכבות לעומת שיטות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו אסירי תודה לגברת ג'ניפר Munguia להמחשה האמנותית של התרשים הסכימטי. אנו מודים למר מייקל ר. הוניג בתחנת הרדיו הציבורית של יוסטון, KPFT לקבלת סיוע מערכתי. מחקר זה נתמך על ידי האגודה האמריקנית לסוכרת #1 -15-BS-177 (YS), ו-NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). עבודה זו נתמכת גם על ידי המכון הלאומי של משרד החקלאות של מזון וחקלאות, הצוהר פרויקט 1010840 (YS) ו R01 DK095118 (SG).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (ACUC) של אוניברסיטת טקסס A & M. הכלים המנתחים צריכים מוצגים באיור 1 והתרשים הסכמטי של השגרה מוצג באיור 2.
1. פתרונות
<ol><li>להכין את הפתרון מאוזנת מלח של האנק (HBSS) על ידי הוספת 100 mL של 10X HBSS (מהמלאי) כדי 900 מ ל של מים מזוקקים לעשות 1 L HBSS (1X).</li>
	<li>הכנת פתרון STOP (חייב להיות טרי ויש להשתמש בו בתוך 1 h) על ידי הוספת 50 mL של סרום העוברי 100X (FBS) כדי 450 mL של קרח קר 1X HBSS; זה הופך את הפתרון 500 mL להפסיק. שמור על פתרון ה-STOP ב-4 ° c.</li>
	<li>הכנת קולגן הפתרון P (חייב להיות טרי בתוך 1 h של להיות בשימוש) על ידי הוספת 1 מ"ג/mL של הקולגנראז P כדי קרח קר 1X HBSS; להשתמש 6 מ ל/עכבר.<ol>
<li>להוסיף 0.05% (w/v) סרום שור אלבומין (BSA) כדי לפתור את הפתרון הקולגן (זה מספק חומרים מזינים את איונים מבודדים). לדוגמה, השתמש ב-3 מ"ג BSA ב 6 מ ל בתמיסה P. לשמור על קרח</li>
		<li>לחשב ולהכין את כמות הקולגנאז P הדרושים עבור כל העכברים בצינור 1 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין להשלים RPMI 1640 בינוני על ידי הוספת 10% fbs, 100 U/mL פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין, INS-1 מוסף תא (10 מ"מ hepes, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 mm נתרן פירובט, ו 0.05 mm 2-mercaptoethanol) כדי 500 mL RPMI 1640 מדיה המכילה את הגלוקוז של 5.5 mm ל לתרבות הלילה ולדגירה.</li>
</ol>2. הכנה
<ol><li>מילוי 3 50 mL של 25 מ"ל RNase פתרון מעכב, 70% אתנול או מזוקק H2O. פתרונות אלה ישמשו לניקוי כלי ניתוח לפני ובמהלך ההליך.</li>
	<li>משרים את קצות הכלים בפתרון מעכב RNase למשך 30 דקות לפני התחלת הפרוטוקול; פעולה זו מבטלת את כל RNase פוטנציאלי על הכלים.</li>
	<li>רפידות ספיגה מראש כדי 6 ב x 6 בגודל לשימוש במהלך הניתוח.</li>
	<li>הכינו פתרון HBSS של 1X מראש ואחסן ב-4 ° c. הכינו את פתרון העצירה לפני הניתוח. חנות ב -4 ° c.</li>
	<li>הכינו את התמיסה באופן מיידי לפני הניתוח והחנות על הקרח. הערה: יש להשתמש בפעולה זו בתוך 2 שעות של הכנה.</li>
	<li>לייבל 50 mL לעיכול ולטיהור; להכין 2 צינורות עבור כל עכבר, אחד לעיכול והשני עבור טיהור איון. ודא שמזהה בעל החיים ממוקם על שני הצינורות.</li>
	<li>הוסף 3 מ ל של התמיסה הקולגן P לתוך הצינור הראשון 50 mL. הנותרים 3 מ ל של הקוליוראז P הוזרק.</li>
	<li>לצייר את הנותרים 3 mL של הפתרון הקולגן לתוך מזרק ל 3 מ ל רכוב עם 30 G 1/2 במחט. . הנח את המזרק על הקרח</li>
</ol>3. נוהל
<ol><li>הסר את כל הכלים מ RNase פתרון מעכב, ולאחר מכן לטבול אותם הראשון בצינור עם 70% אתנול, ואז בצינור המכיל H2O מזוקקים, ואז האוויר יבש על מגבת נייר נקי.</li>
	<li>מניחים את העכבר בחדר המכיל 0.5 mL של isofרדימים ane עד העכבר הוא עמוק.</li>
	<li>להסיר את העכבר מתא ולבדוק את מצב ההרדמה על ידי צובט משטח כף רגל עם מלקחיים. ההרדמה עמוקה מבוססת על ההתבוננות כי הנשימה הופכת איטית בהתמדה ועכבר הוא בלתי מגיב לצביטה ברגל. לאחר אישור כי העכבר הוא עמוק רדימים, המתת החסד העכבר עם נקע בצוואר הרחם, ולאחר מכן למקם את העכבר על הלוח סופג.<ol>
<li>מניחים את העכבר רדימים על הבטן, הפעלת לחץ על הצוואר לפירוק עמוד השדרה מהמוח על ידי משיכת הזנב.</li>
	</ol></li>
	<li>להקליט את הגפיים של העכבר במיקום פרקדן אל הלוח סופג, לרסס את הגוף עם 70% אתנול, ולנגב עודף אתנול עודף.</li>
	<li>השתמש כיסוי מלקחיים זכוכית מספריים כירורגית מעוקל כדי ליצור חתכים. ראשית לעשות חתך אופקי על העור של אזור הבטן (~ 3 ס מ), למשוך את העור פתוח לרווחה כדי לחשוף את קיר הבטן. ואז לעשות חתך אנכי (~ 3 – 4 ס מ) על צפק הבטן כדי לחשוף במלואו את הלבלב בחלל הבטן (איור 3).</li>
	<li>לדחוף את האונות של הכבד מראש כדי לחשוף את צינור המרה, זה יופיע כצינור ורוד חיוור (איור 3).</li>
	<li>הזיזו בזהירות את המעיים מאזור המותניים/אילאק הימני של חלל הבטן ימינה, תוך חשיפת צינור המרה ועורק הכבד (איור 3).</li>
	<li>בזהירות להדק את צינור המרה המשותף באמצעות שוורץ מיקרו סרזקק (איור 1) קרוב לכבד ככל האפשר.</li>
	<li>זיהוי ampulla של Vater, אשר ממוקם ב papdenal התריסריון, נוצר על ידי האיחוד של צינור הלבלב ואת צינור המרה המשותף. Ampulla של Vater נראה נפוח כאשר מוצג תחת מיקרוסקופ לנתיחה שהוא נקודת הכניסה לצינור המרה המשותף (איור 4). הערה: התאמת העוצמה/זווית האור של מיקרוסקופ החיתוך יכולה להקל על האיתור.</li>
	<li>הכנס את המזרק עם 3 מ ל של פתרון הקולגן של התמיסה לתוך ampulla של Vater. לדחוף את המחט לתוך תעלת האוורור על 1/4 של אורך צינור המרה המשותף (ampulla מוביל צינור האוורור) כפי שמוצג באיור 5.</li>
	<li>לאחר המחט היא בתוך ampulla, לוודא כי הכיוון של המחט הוא כזה שהוא מקביל עם צינור.</li>
	<li>ייצוב המחט על ידי הדפון עם מלקחיים מיקרו Adson כדי למנוע את הצינור (איור 5).</li>
	<li>לאט ובהתמדה להזריק 3 מ ל של פתרון הקולגן בתמיסה מן המזרק לתוך צינור המרה המשותף (מספיק כדי להרגיש התנגדות) כפי שמוצג באיור 6. המטרה היא ליצור לחץ על הזרימה האחורית כדי לאלץ את הקולגנאז להיכנס תעלת הלבלב. ההזרקה נחשבת מוצלחת אם הראש, הצוואר, הגוף והזנב של הלבלב הם מנופחים לחלוטין. הערה: יבול האיון יהיה נמוך אם הלבלב אינו מנופח לגמרי, או האזור הטחול אינו מנופח לגמרי. אזור הטחול מכיל את המספר הגבוה ביותר של איונים6. האינפלציה יכולה להיות מאושרת על ידי המראה של חללים פתוחים בין רקמת הלבלב כי הם מלאים פתרון.</li>
	<li>בזהירות לנתח את הלבלב מנופח ולמקם אותו בצינור העיכול 50 mL המכיל 3 מ ל של הקרח קר הקולגן הפתרון P.<ol>
<li>הסר את הלבלב באמצעות 2 מלקחיים (מעוקל ו מיקרו Adson; ראה איור 1): (החל מן הטחול, למשוך את הלבלב הרחק הטחול ולהמשיך להסיר מן הקיבה ולאורך התריסריון. הערה: אין צורך בחתכים.</li>
		<li>קוצצים הלבלב עבור 3 – 5 s בצינור העיכול עם 3 מ ל של קרח קר הקולגן התמיסה הפתרון באמצעות מספריים כירורגי משובח (איור 7A).</li>
	</ol></li>
	<li>אבטחו את הצינורית לארון תקשורת ב37 המים של ° c ונענעי במהירות של 100 – 120 סל ד במשך כ -12 – 13 דקות.</li>
	<li>לאחר הדגירה, בעדינות לנער את הצינורות ביד כדי לשבש את הרקמה עד הקולגן בתמיסה העיכול P הופך הומוגנית (איור 7B). הומוגניות מאושרת על-ידי המראה הדומה לחול של חלקיקים עדינים של הלבלב. כ -30 ס מ עדין מספיק. החזיקו את השפופרת עד לאור כדי לבדוק אם הרקמה הינה הומוגניים היטב; ללחוץ על עוד ~ 15 s אם יש צורך.</li>
	<li>לאחר מתעכל, מיד למקם את הצינורות על הקרח ולהוסיף 40 mL של תמיסת קרח קר להפסיק לסיים את העיכול אנזימטי. הערה: בשלב זה צינורות העיכול יכול להיות שמאל על הקרח עד 2 h, אם עובד על עכברים מרובים.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגה מנופף דלי ב 300 x g עבור 30 s (הטמפרטורה של צנטריפוגה היא גמישה). הערה: השתמש צנטריפוגה דלי מנופף כך את הגלולה הרקמה נוצרת בתחתית שפופרת 50 mL ולא על הקיר של הצינור; זה קריטי לתשואה טובה יותר של איון.</li>
	<li>Decant ולחזור על הצנטריפוגה עם פתרון STOP 2 פעמים יותר, בקבוקי את הפתרון לאחר כל ספין. השתמש ב -20 מ ל של פתרון STOP עבור כל שטיפת הבאים.<ol>
<li>לפני כל ספין, לשבש את הגלולה על ידי טלטול בעדינות את הגלולה בצינור 50 mL ב 20 mL להפסיק פתרון.</li>
	</ol></li>
	<li>מחדש להשעות את הגלולה הרקמה עם 40 mL של HBSS קר קרח ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 30 s.</li>
	<li>Decant ולחזור על הצנטריפוגה באמצעות צנטריפוגה דלי מנופף עם פתרון HBSS פעמיים יותר, בקבוקי את הפתרון לאחר כל ספין. השתמש ב-20 מ ל של HBSS עבור כל כביסה.<ol>
<li>לפני כל ספין, לשבש את הגלולה, כדי לנתק אותו מהחלק התחתון של הצינור על ידי לטלטל בעדינות את הצינור המכיל 20 mL HBSS פתרון.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר הצנטריפוגה האחרון להסיר את כל HBSS.</li>
	<li>ואז להוסיף 5 מ ל של צפיפות טמפרטורת החדר הדרגתי לצינור 50 mL המכיל את הגלולה. מערבולת בקצרה במהירות נמוכה עד הומוגניים.</li>
	<li>הוסיפו עוד 5 מ ל של צפיפות טמפרטורת החדר מעבר לצינור 50 mL. אל תעשה מערבולת/מיקס. הערה: קריטי להישאר יציב ועדיין כדי לאפשר מעבר צבע טוב יותר לטופס ללא הפרעה.</li>
	<li>פיפטה 10 מ ל של טמפרטורת החדר HBSS מאגר לתוך הצינור (המכיל את הדרגתי צפיפות), ירידה באמצעות ירידה בעדינות ובאיטיות כדי לאפשר הדרגתי לטופס. השתמש באקדח הפיפטה עם הפיפטה 10 מ"ל כדי להוסיף HBSS dropwise.</li>
	<li>באמצעות צנטריפוגה מנופף בדלי, שפופרות ספין ב 1700 x g עבור 15 דקות. הקפד לשנות את המהירות של הן האצה/האטה להגדרה הנמוכה ביותר כדי לשמור על מעבר הצבע (איור 7c).</li>
	<li>לאחר הספין, בזהירות להסיר את הצינורות מבלי להפריע את מעבר הצבע. באמצעות אקדח הצינורות מראש עם HBSS קר (הצינור HBSS למעלה ולמטה), פיפטה את השכבה של איונים (5-10 mL) נוצר בין הדרגתי צפיפות HBSS לתוך הצינור החדש 50 mL איון האוסף. הערה: מומלץ להרטיב את הפיפטה עם HBSS הקר לפני שהוא מלטף את האיים כדי למנוע מהאיים לדבוק בקירות הפנימיים של הפיפטה.<ol>
<li>במקרה ההפרדה אינה מלאה, איונים יהיה גלוי בשכבה מעבר הצפיפות, פיפטה את כל 10 מ ל של הצפיפות הדרגתי (השכבה התחתונה) יחד עם שכבת איון שנוצר בממשק (רק לעזוב על 8-10 מ ל של השכבה העליונה HBSS מאחורי). הערה: איסוף הן שכבת איון ואת מעבר הצבע שכבת הצפיפות (השכבה התחתונה) יכול לגרום לאוסף של פסולת אשר עשוי להאריך את זמן הקטיף איון, אך לא לשנות שלבים אחרים. איסוף שתי שכבות אלה אינו הכרחי כאשר שכבת איון היא בנויה היטב.</li>
	</ol></li>
	<li>הוסף 20 מ ל של קרח קר HBSS לצינור חדש 50 mL המכיל איונים, אז צנטריפוגה ב 350 x g עבור 3 דקות ב צנטריפוגה מנופף דלי.</li>
	<li>לאחר הספין, פיפטה בזהירות (לא decant) החוצה supernatant (לעזוב את ~ 3 מ ל בתחתית) מבלי להפריע את הגלולה המכילה את איונים בתחתית. . מחק את הסופרנטאנט</li>
	<li>חזרו על הכביסה והתפרידו לפחות 3 פעמים. הוסף 20 מ ל של HBSS בכל פעם, ולהיות בטוח להשעות את הגלולה לפני כל ספין.</li>
	<li>חמם את RPMI-1640 בקבוק מדיה מלא באמבט מים ב 37 ° c לפני השימוש. לאחר הצנטריפוגה האחרון, להסיר את כל HBSS ולהוסיף 4 מ ל של הוכנו בעבר RPMI-1640 מדיה (המכיל FBS, INS-1 מוסף תא פניצילין/סטרפטומיצין) אל הגלולה.</li>
	<li>להוציא את הגלולה על ידי מתערבל בעדינות את הצינור ומיד לשפוך את RPMI-1640 מדיה לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ. הוסף עוד 5 מ ל של RPMI-1640 מדיה לצינור ומערבולת בעדינות כדי לשטוף את כל האיים הנותרים, אז גם לשפוך את המדיה לתוך אותה צלחת פטרי.<ol>
<li>תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לקטוף איונים בריאים מן צלחת פטרי באמצעות הצינורות 20 μL, ולשים אותם בצלחת פטרי חדשה המכילה 10 מ ל RPMI 1640 מלאה מדיה. כאשר מתבוננים תחת מיקרוסקופ לנתיחה, איונים צריכים להופיע בצבע כדורי/מלבני וחום זהוב עם משטח חלק לעומת הרקמה השקופה באופן יחסי, ווירגל אקסוקרינית. הערה: הגדלה של מיקרוסקופ הניתוח מוגדרת בדרך כלל בשעה 12.5 – 16x. תשואה איון ישתנה בהתאם לגורמים שונים כולל זן, גיל ומין של העכבר. פרוטוקול זה בדרך כלל מניב 250 – 350 איונים בריאים מן העכבר C57BL/6J גיל 4 – 10 חודשים.</li>
	</ol></li>
	<li>מודחלת האיים בחממה סטרילית ב 37 ° c עם 5% CO2 אינפוזיה ו 95% מחולל אוויר לילה לניסויים למחרת, או להקפיא את איונים לניתוח הרצוי במועד מאוחר יותר.<ol>
<li>ברגע שהאיים קפואים, לא ניתן להשתמש בהם לפרשת הפרשה, רק RNA או קוונפיקציה של חלבון. כדי לאסוף את התאים כדי להקפיא, למקם אותם במאגר HBSS, לאסוף את כל איונים ב 200 – 500 μL של מאגר, העברה לצינור 1.5 mL, צנטריפוגה 350 x g עבור 1 – 2 דקות, להסיר את הסופרנטנט עוזב לא יותר מ 30-40 מענה μl, מקום ב-20 ° c עבור אחסון כמה ימים) או-80 ° c לאחסון ארוך טווח.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li>
<li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lepr%28db%29+mouse+model+of+type+2+diabetes%3A+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632(2015).</li>
<li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374(2014).</li>
<li>Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374(1987).</li>
<li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+filtration%3A+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li>
<li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li>
<li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979(2017).</li>
<li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול זה כולל קולגן הפרזיה ועיכול, ואחריו טיהור של איונים. הצעדים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם הזרקה יעילה זלוף השלם של הלבלב1,4,7. שיטת המסירה של פרוטוקול זה מאפשרת לאנזים לחצות את המסלולים האנטומיים כדי לעכל טוב יותר את רקמת אקסוקרינית המקיפים את איונים1. בנוסף, טכניקה זו מתאימה היטב לעיכול מוחלט של אזור הטחול, אשר הריכוז הגבוה ביותר של איונים4,<sup class="xref"...

ישנן שתי שיטות נפוצות בספרות עבור בידוד איון הלבלב. האדם דורש לנצל את הלבלב ולהכניס אותו לחתיכות קטנות באמצעות מספריים כירורגיים, ולאחר מכן לעכל אותו בתמיסה הקולגן1,2,3. עוד שיטה מדויקת יותר היא להשתמש ברשת של צינורות הנמצאים בלבלב כדי להחדיר אנזים העיכול. האתרים הבאים שימשו עבור הזרקת אנזים העיכול: הצומת של צינור המרה פיברוזיס, המרה לתוך צינור המרה המשותף, או צינור מרה משותף עצמו1,4,5. ידוע כי איונים אינם מופצים באופן שווה בלבלב; אזור הטחול מכיל את מרבית האיים6. בעוד השיטה השנייה באמצעות נתיבי אנטומי לספק אנזימי העיכול מאפשר להשלים מלאה יותר של הלבלב, כולל האזור הטחול, הליך זה דורש לעתים קרובות לולאה או מעבר ampulla של Vater כי הוא מבחינה טכנית מאתגר. מבחינת הטיהור של איון, מעברי צפיפות מרובים, כמו גם שפכים סלולריים והנסיגה המגנטית שימשו כדי לטהר את איונים3,7. הניצול של מעברי הצבע האלה יכול לגזול זמן ומעברי הצבע של פיקדול עלולים לגרום לנזק רעיל של איונים8.
הפרוטוקול הנוכחי בנוי על השיטה המתוארת על ידי Li et al.7, עם שינויים נוספים שנוספו על בסיס החוויה של עצמנו ואחרים1,4. הצעדים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול שלנו הם לסדר את צינור המרה המשותף ליד סוף הכבד, הזרקת הקוליואז P דרך ampulla של Vater לעכל את רקמת אקסוקרינית, ולאחר מכן באמצעות אמבט מים לרעוד כדי לזרז את העיכול מכנית1, 4,7. לאחר מכן, הפתרון ' STOP ' מיושם על מנת לעכב את העיכול של איונים; HBSS משמש כדי לשטוף את שאר הקולגן בתמיסה ו STOP פתרון. כאשר שימש השיטה לטיהור האיים האנושיים, התשואה דווחה כפליים מהאיונים בעלי יכולת תפקודית גדולה יותר (למשל, הפרשת אינסולין) לעומת השימוש במעברי הצבע של חלחול9. עם זאת, מחקרים חקרו את השימוש בהדרגה בעקבות ההשפעה הרעילה שלה על איונים1,10. זה דווח כי הדרגתי Histopaque מספק קינטיקה טיהור אופטימלי עבור בידוד איון העכבר, אשר מייצרת תשואה טובה של איונים באיכות גבוהה עם צעדים פשוטים יותר ועלות נמוכה1. בפרוטוקול שלנו, Histopaque-1077 משמש לטיהור איונים משאר רקמות שיורית8,11. איונים שנקטפו יכול להיות תרבותי בRPMI מלאה-1640 מדיה, או מנוצל ישירות ב-RNA/חלבון כימות.
הפרוטוקול שלנו, באמצעות שילוב של העיכול הקולגן P וצעד טיהור יחיד מעבר צבע, הוא פשוט יותר מאשר פרוטוקולים שפורסמו אחרים. השיטה שלנו לא דורשת הליכים כירורגיים תובעניים ויש לו רק כמה צעדים פשוטים. חשוב מכך, פרוטוקול זה מייצר בעקביות תשואה טובה של איונים פונקציונליים באיכות גבוהה (250-350/עכבר) כפי שדווחו12.

<table><tbody><tr><td>מזרק 3 מ"ל</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Hoding קולגנאז P</td></tr><tr><td>Coverglass מלקחיים</td><td>VWR</td><td>82027-396</td><td>החזקת עור העכבר כדי לסייע בהליך החתך</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z168696</td><td>החזקת רקמות במהלך הסרת הלבלב</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>פיראמל</td><td>B13B16A</td><td>להרדמת עכברים לפני ניתוח</td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחות פטרי</td><td>VWR</td><td>30-2041</td><td>משמש לתרבית איים</td></tr><tr><td>30 G. &frac12; מחט אינץ'</td><td>BD</td><td>305106</td><td>לחדירת אמפולה של וטר כדי לספק קולגנאז P - מדד זה משמש מכיוון שהוא מתאים היטב לרוב ה- CBDs</td></tr><tr><td>צינור 50 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>מחזיק רקמת לבלב מעוכלת, קולגנאז P ואיים מטוהרים</td></tr><tr><td>רפידות סופגות עם מחסום לחות עמיד למים</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td>כדי לספוג דם מתהליכים סיורגיים</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810R עם דלי נדנדה ויכולת האטה</td><td>Eppendorf</td><td>5811FJ478114</td><td>השתמש ברקמות גלולה, גלולה נוצרת בתחתית הצינור החרוטי - יש צורך בצנטריפוגה של דלי נדנדה. כמו כן, תכונת ההאטה חשובה ליצירת שכבות השיפוע.</td></tr><tr><td>קולגנאז P- 1g</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11249002001</td><td>לעיכול לבלב אקסוקריני</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיות מעוקלות</td><td>Fisher-Scientific</td><td>13-804-21</td><td>לחיתוך בטן עכבר פתוחה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>אולימפוס</td><td>SZX16</td><td>משמש לזיהוי מבנים אנטומיים מרכזיים להעברת קולגנאז במדויק ללבלב</td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק 10x</td><td>Corning</td><td>20-023-CV</td><td>תאי כביסה</td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>RNBF5100</td><td>להיווצרות שיפוע</td></tr><tr><td>מקור אור</td><td>לידס</td><td>LR92240</td><td>שיפור הנראות של המיקרוסקופ</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Fisher-Scientific</td><td>AM9780</td><td>להסרת RNase</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td>איי תרבות</td></tr><tr><td>שוורץ מיקרו סרפינס (מהדק מיקרו-וסקולרי)</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>18052-01</td><td>הידוק צינור מרה משותף ועורק</td></tr> כבד <tr><td>רועד אמבט מים</td><td>Boekel/Grant</td><td>8R0534008</td><td>חשוב לעיכול מכני של רקמה אקסוקרינית</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיות קטנות</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td>רקמת Cuttitng שהתחברה ללבלב</td></tr></tbody></table>

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

איולי הלבלב, הנקרא גם איי לנגרהנס, הם אשכול של תאים אנדוקריניים המייצרת הורמונים עבור רגולציה של גלוקוז ופונקציות ביולוגיות חשובות אחרות. איונים בעיקר מורכב מחמישה סוגים של הורמון הפרשת תאים: α תאים להפריש glucagon, תאים β להפריש אינסולין, δ תאים להפריש סוסטטין, ε תאים להפריש ghrelin, ו PP תאים להפריש polypeptide הלבלב. 60 עד 80% התאים באיים הם β תאים, שהם אוכלוסיית התאים החשובים ביותר ללמוד הפרשת אינסולין. איי הלבלב הם מערכת מודל חיונית כדי ללמוד לשעבר הפרשת אינסולין vivo. הקניית איים באיכות גבוהה היא בעלת חשיבות רבה לחקר הסוכרת. רוב הליכי בידוד של איון דורשים מבחינה טכנית קשה לגשת לאתר של הזרקת קולגן, הליכי עיכול קשים ומורכבים, ושלבי הדרגתי דחיסות מרובים. נייר זה כולל פשוט תשואה גבוהה העכבר איון בידוד שיטה עם תיאורים מפורטים והפגנות מציאותי, מראה את הצעדים הבאים ספציפיים: 1) הזרקה של הקולגן בתוך ampulla של vater, אזור קטן הצטרפות תעלת הלבלב ו צינור המרה המשותף, 2) העיכול אנזימטי והפרדה מכנית של הלבלב אקסוקרינית ו 3) צעד אחד טיהור הדרגתי. היתרונות של שיטה זו הם הזרקה של אנזים העיכול באמצעות ampulla נגיש יותר של Vater, העיכול מלאה יותר באמצעות שילוב של גישות אנזימטיות ומכני, ופשוט צעד טיהור יחיד הדרגתי. פרוטוקול זה מייצר כ-250-350 איים לכל עכבר; ו איונים מתאימים למחקרים שונים vivo ex. האזהרות האפשריות של הליך זה עלולות להינזק איונים בגלל עיכול אנזימטי ו/או דגירה ממושכת של הדרגתי, אשר כולם יכולים להימנע במידה רבה על ידי הצדקת מודעות לזמן הדגירה.

השלמת נאותה של הליך זה דורשת הבנה מסוימת של אנטומיה של העכבר בחלל הבטן. זה מאפשר זיהוי הנכון של ampulla של Vater ולסדר את צינור המרה המשותף. ההליך כולו בדרך כלל לוקח 1 – 2 h. זה יעיל יותר לבודד איונים מ 4-6 עכברים באותו זמן, כך כמה דגימות יכול להיות centrifuged יחד. הזמן עבור הקטיף איון משתנה, בהתאם למספר איונים ויעילות העיכול; זה יכול לקחת בערך שעה כדי לאסוף 250 – 350 איונים מ 1 עכבר.
במאמר זה, מספר תמונות מציאותיות מאוד כלולים: איור 3 מראה את חלל הבטן של העכבר, ...

זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

פרוטוקול זה דורש שימוש שיפוע צפיפות אחת מה שהופך אותו באופן משמעותי פחות עבודה אינטנסיבית וחסכונית יותר בהשוואה לשיטות בידוד איון קונבנציונליות מורכבות יותר. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא כי האנזים מועבר ישירות ללבלב וכתוצאה מכך עיכול רקמות משופרת ותפוקת איון מוגברת. התחל על ידי הקשה על הגפיים של העכבר בתמקמת supine ו ריסוס הגוף עם 70% אתנול.באמצעות ממטרות coverglass ומספריים כירורגיים מעוקל, לעשות חתך עור בטן אופקי כשלושה סנטימטרים ולמשוך לפתוח את העור כדי לחשוף את דופן הבטן. בצע חתך אנכי של שלושה עד ארבעה סנטימטרים על צפק הבטן כדי לחשוף באופן מלא את הלבלב ולמקם את העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח. לדחוף את האונה הכבד מעולה לחשוף את צינור המרה המופיע צינור ורוד חיוור בעדינות להזיז את המעיים מאזור המותני הימני iliac מימין לחלל הבטן כדי לחשוף את צינור המרה ואת עורק הכבד.השתמשו ב-Schwartz micro serrefines כדי להדק בזהירות את צינור המרה המשותף קרוב ככל האפשר לכבד ולזהות את האמפולה של ואגר הממוקמת בבית האפיפיורות ונוצרת על ידי איחוד צינור הלבלב וצינור המרה המשותף. באמצעות מטחות מיקרו אדסון כדי למשוך את צינור המרה המשותף לימד, להכניס מחט 30 מד חצי אינץ', מחובר מזרק שלושה מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של פתרון P קולגנס מוכן טרי לתוך אמפולה של ויטר דוחף את המחט לתוך הצינור במקביל לכלי במשך כרבע אורך הכלי. ברגע המחט היא במקום, לייצב את המחט עם מטח מיקרו אדסון לאט ובהתמדה להזריק שלושה מיליליטר של פתרון קולגנס P לתוך הצינור.הזריקה נחשבת מוצלחת אם אזורי הראש, הצוואר, הגוף והזנב של הלבלב מנופחים לחלוטין. כניסה נכונה לתוך אמפולה ו cannulation של צינור המרה המשותף הם קריטיים עבור קציר עיכול מוצלח. פירסינג הקירות צינורית מפחית את היעילות של הבידוד.באמצעות מדפים מעוגלים ומיקרו אדסון, בזהירות לשלוף את הלבלב מנופח החל הטחול וממשיך לכיוון הבטן לאורך התריסיון. לאחר מכן מניחים את הלבלב בצינור עיכול 50 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של תוסף קולגנס P קר כקרח. כדי לקצור את האיים, ראשית להשתמש מספריים כירורגיים עדין לקצוץ את הלבלב במשך שלוש עד חמש שניות לפני הצבת הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ב 100 עד 120 סיבובים לדקה במשך 12 עד 13 דקות.בסוף הדגירה, בעדינות לנער את הצינור במשך כ 30 שניות כדי לשבש את הרקמה עד הפתרון הוא הומוגני כפי שאושר על ידי חלקיקי רקמת הלבלב דמוי חול בסדר. ברגע שהרקמות מתעכלות, מניחים את הצינור על קרח ומוסיפים 40 מיליליטר של פתרון עצירה קרה כקרח כדי לסיים את התגובה האנזימטית. לאחר שיבוש עדין של גלולה, לסובב את הרקמה מתעכל צנטריפוגה דלי מתנדנד ואחריו שני צנטריפוגות עם 20 מיליליטר של פתרון עצירה טרי לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, תן שימוש חוזר את גלולה ב 40 מיליליטר של HBSS קר כקרח עבור שלוש שטיפות נוספות, resuspending את גלולה בחמישה מיליליטר של פתרון שיפוע טמפרטורת החדר לאחר הכביסה האחרונה. Vortex הצינור לזמן קצר במהירות נמוכה עד הפתרון הוא homogenized לפני הוספת עוד חמישה מיליליטר של שיפוע טמפרטורת החדר לצינור. עכשיו להשתמש פיפטה 10 מיליליטר בעדינות ולאט לאט להוסיף 10 מיליליטר של טמפרטורת החדר HBSS לצינור בצורה טיפה חכם כדי לאפשר היווצרות של שיפוע ולהשתמש צנטריפוגה דלי מתנדנד לבודד את אוכלוסיות התאים על ידי הפרדת שיפוע צפיפות.בסוף הצנטריפוגה, השתמש פיפט 10 מיליליטר רטוב מראש עם HBSS קר לאסוף חמישה עד 10 מיליליטר של שכבת האיון בין שיפוע הצפיפות HBSS. להעביר את האיים לתוך צינור חדש 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של HBSS קר קרח טרי ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה דלי מתנדנד. בזהירות שאפו את כל אבל שלושת המיליליטרים האחרונים של supernatant מבלי להפריע גלולה ולשטוף את האיים לפחות שלוש פעמים נוספות עם 20 מיליליטר של HBSS טרי לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, להחליף את supernatant עם ארבעה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס RMPI 1640 בינוני בעדינות מערבל את הצינור כדי לסלק את גלולה. מיד לשפוך את האיים לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר ולשטוף את הצינור עם חמישה מיליליטר של מדיום RPMI טרי 1640 כדי לאסוף את כל האיים הנותרים אוסף את הכביסה עם האיים האחרים. לאחר מכן השתמשו במיקרוסקופ ניתוח ובטיפ פיפט של 20 מיקרוליטר כדי לבחור איונים חומים כדוריים או מלבניים בריאים עם משטח חלק מצלחת פטרי להעברה לצלחת פטרי חדשה המכילה 10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 שלם.כאשר כל האיים נאספו, מניחים את האיים באיים באינקובטור סטרילי ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באוויר לח לילה. נראה כי לאיים בריאים וטובים יש צורה עגולה חלקה ואילו איונים פגומים רעים מפגינים קצוות מחוספסים. רקמה אקסוקרינית מעוכלת היא שקופה במראה ומדגימה צורה לא סדירה.קנולציה נכונה והפצה של אנזים קולגנס P יכול להיות מאושר על ידי אינפלציה של החלק הטחול של הלבלב. דגירה לילה במדיה גלוקוז נמוכה יכולה לגרום לאיים להערכה של הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז למחרת ומאפשרת תובנה לגבי יכולת הפרשת האינסולין של איונים.

a-simple-high-efficiency-protocol-for-pancreatic-islet-isolation-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תיאור מפורט של בידוד איון עכבר מתואר באמצעות הטכניקה של cannulation באתר הלבלב ductal וטפטוף של שילוב של מטוהר collagenase ופרוטאז הניטראלי.

העכבר איילט בידוד נגרהנס באמצעות שילוב של collagenase המטוהר ופרוטאז הניטראלי

איי הלבלב, המכונים גם איי לנגרהנס, הם אשכול של תאים אנדוקריניים המייצר הורמונים לוויסות גלוקוז ופונקציות ביולוגיות חשובות אחרות. פרוטוקול זה מסביר שיטה לבידוד איי הלבלב על ידי החדרת קולגנאז תחילה דרך אמפולה של Vater כדי לעכל את רקמת הלבלב האקסוקרינית וצנטריפוגה הדרגתית צפיפות פשוטה כדי לטהר את האיים מעכברים.

בידוד איי הלבלב באמצעות זילוח Collagenase: שיטה אנזימטית לבידוד תאי איון הלבלב

מנסה לאמוד בתפקוד β-תאי מבחנה באמצעות עכבר איים מבודדים לנגרהנס הוא מרכיב חשוב במחקר של הפתופיזיולוגיה סוכרת ותרופות. בעוד רבים יישומים במורד הזרם זמינים, פרוטוקול זה מתאר במפורש המדידה של monophosphate אדנוזין המחזורי תאיים (cAMP) כפרמטר חיוני קביעת פונקצית β-תאים.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבידוד איים ממודל העכבר של סוכרת מסוג 2, Leprdb ופרטים על בדיקת תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין מאיים שלמים המשתמשת במיקרוסקופ 2 פוטונים.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

אתגרים קריטיים לתחום מחקר הסוכר מעוניינים להבין את המנגנונים המולקולריים מווסת שכפול β-cell איון לפתח שיטות מגרה התחדשות תאי β. בזאת שיטה גבוהה ההקרנה תוכן לזהות ולהעריך את הפעילות β-cell לקידום שכפול של מולקולות קטנות מוצג.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

אנו מתארים פרוטוקול בזאת לבידוד איים שלמים מעכברים בילוד. Pancreata היו מעוכל חלקית עם collagenase, ואחריו כביסה בחירה ידנית. 20 - 80 אשכולות איון ניתן להשיג לכל לבלב מעכברים שזה עתה נולדו, אשר מתאימים מספר מחקרי איון.

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

השתלת הלבלב איון היא דרך להשיג normoglycemia על סוכרת מסוג 1. מאמר זה מתמקד בטכניקה השתלת מהנתיב intraportal כדי לשמור על רמות גלוקוז נורמלי בעכברים סוכרתיים.

השתלת intraportal של לנגרהנס במודל עכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור דימות וכימות הדינמיקה סידן באוכלוסיות תאים הטרוגנית, כגון תאים איון הלבלב. כתבים פלורסנט מועברים לתוך שכבת היקפי של תאים בתוך איון, אשר לאחר מכן מאויית והתמונה, ועל ניתוח לתאים של הדינמיקה של עוצמת הניאון מבוצעת.

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי אנדותל עכבר מלבלב שלם.

בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר

מחקר זה פיתח שיטה פשוטה לחילוץ יעיל של איים ראשוניים תפקודיים ותאי אקינר מהלבלב בעכבר, ומציע כלי חשוב לחקר תקשורת בין-תאית בפתוגנזה של סוכרת מונעת מדלקת לבלב חריפה.

שיטה פשוטה ומהירה לבידוד סימולטני של איים ראשוניים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב מעכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית לקציר כירורגי, עיכול אנזימטי וטיהור גרדיאנט צפיפות של איי הלבלב של עכברוש לואיס, המאפשר הכנות בעלות תפוקה גבוהה וטוהר לשימוש ישיר בהשתלות או במחקרים במבחנה .

בידוד וטיהור איי הלבלב מחולדות לואיס באמצעות עיכול אנזימטי והפרדה בין צפיפות לגרדיאנט

למד פרוטוקול פשוט לבידוד איוני לבלב מעכברים באמצעות הזרקת קולגנז ישירות ללבלב. השיטה מייצרת 250-350 איונים איכותיים לכל עכבר ומפשטת את תהליך הפרדת השכבות לעומת שיטות מסורתיות.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

גלה סרטונים נוספים