Name: Respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את הפונקציה מיטוכונדריאלי של תאי הבטא תקין בנוכחות תרכובות טבעיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: למדו להעריך את פונקציית הנשימה המיטוכונדריאלית של תאי בטא בלבלב באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של השפעת תרכובות טבעיות על מטבוליזם התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצה להודות חברים של מעבדות Tessem, הנקוק העוזרת, דיון מדעי. המחברים מודים אנדרו Neilson, PhD (וירג'יניה טק) על מתן השבר מונומר קקאו epicatechin נגזרת. מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר פעולה סוכרת, קרן חינוך JST.

1. תרבית תאים
<ol><li>התרבות הארצי-1 נגזר תאי ביתא 832/13 RPMI 1640 בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 10 מ מ HEPES, 2 מ מ גלוטמין 1 מ"מ נתרן פירובט, מ מ 0.05 מרקפטואתנול9,10,11 12, ,13.</li>
	<li>הסר 832/13 תאים מבקבוק T75 באמצעות 2 מ של 0.25% טריפסין, המקננת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות נטרול טריפסין על-ידי הוספת 8 מ של מדיה RPMI 1640 מלאה.</li>
	<li>לספור תאים באמצעות hemocytometer ו לדלל µL 100 של נפח התאים של שלב µL 1.2 ב- 900 ל- PBS.</li>
	<li>צלחת 832/13 תאים על צפיפות של 2 x 106 תאים/מ ל 6 טוב מגישים.</li>
	<li>התרבות התאים עבור 48 ש ח בחודש חממה humidified-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לפני תחילת הניסויים נשימה.</li>
</ol>2. הכנה של תאים Respirometry ברזולוציה גבוהה
<ol><li>
טיפול 832/13 תאים עם קקאו epicatechin נגזר מונומר.
	<ol>
<li>תרבות 832/13 תאים עבור 24 שעות לאחר ציפוי ב חממה humidified-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
		<li>לשנות את המדיה 24 שעות לאחר ציפוי, ולטיפול 832/13 תאים עם בקרת הרכב (3 בארות) או מונומר nM קקאו 100 (3 בארות), ואחריו תרבות עבור h 24 נוספים (סה כ 48 שעות) ב חממה humidified-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
		<li>לשטוף 832/13 תאים 1 x נמוך הגלוקוז הפרשת Assay מאגר (SAB) עבור מאגר וביופסיה 5 דק, דגירה 832/13 תאים 1 x גלוקוז נמוך SAB עבור h 3, שינוי 1 x גלוקוז נמוך SAB בכל שעה.<ol>
<li>להפוך 10 x SAB עם g 33.32 של NaCl, 1.73 g של אשלגן כלורי, 0.82 גר'2פו ח'4, 0.7 גר' MgSO4 ולהוסיף H2O נפח סופי של 500 מ"ל. מסנן סטרילי הפתרון הסופי.</li>
			<li>דגם 1 x גלוקוז נמוך SAB עם 10 מ"ל של 10 x SAB, 100 µL של 45% גלוקוז, 2 מ של 1 מ' HEPES, 1 מ"ל של 0.25M CaCl2, מ 0.57 ל 35% BSA פתרון, 0.21 גר' NaHCO3 ולהוסיף H2O לאמצעי הסופי של 100 מ ל. מסנן סטרילי הפתרון הסופי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
טיפול 832/13 תאים עם כורכומין.
	<ol>
<li>תרבות 832/13 תאים עבור 48 שעות לאחר ציפוי ב חממה humidified-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
		<li>לשטוף 832/13 תאים 1 x גלוקוז נמוך SAB עבור מאגר וביופסיה 5 דק, דגירה 832/13 תאים 1 x גלוקוז נמוך SAB עבור h 3, שינוי 1 x גלוקוז נמוך SAB בכל שעה.</li>
		<li>אחרי h 2.5 של הדגירה 3 h ב- 1 x גלוקוז נמוך SAB, תשאף מאגר של דגירה תאים 1 x SAB גלוקוז נמוך עם בקרת הרכב או 40 µM כורכומין למשך 30 דקות. בעקבות דגירה, וארוקן את המאגר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קציר תאים עם טריפסין עבור respirometry ברזולוציה גבוהה
	<ol>
<li>לאחר הדגירה 3 h ב- 1 x גלוקוז נמוך SAB, להסיר התאים לצלחת עם 250 µL של 0.25% טריפסין לכל טוב.</li>
		<li>לשלב את התאים טריפסין מבארות 3 מטופלים עם בקרת הרכב או תרכובת של עניין עם 4 מיליליטר SAB צינור חרוטי 15 מ"ל.</li>
		<li>לספור תאים באמצעות hemocytometer ו לדלל µL 100 של נפח התאים של שלב µL 2.3.2 בשנת 900 ל- PBS.</li>
		<li>לדלל את מספר התאים ב- 1 x גלוקוז נמוך SAB כדי 3 מ"ל-הריכוז המתאים עבור כל חדר המתאים. הנתונים מדגים כי ריכוז עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל הוא היעיל ביותר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קציר תאים עם דיסוציאציה מכני עבור respirometry ברזולוציה גבוהה
	<ol>
<li>לאחר הדגירה 3 h ב- 1 x גלוקוז נמוך SAB, להוסיף 1 מ"ל של x 1 SAB גלוקוז נמוך לכל היטב ובעדינות לפוצץ תאים מחוץ לצלחת עם דיסוציאציה מכני על-ידי pipetting עם טיפ פיפטה 1000 µL.</li>
		<li>לשלב את התאים מבארות 3 מטופלים עם בקרת הרכב או תרכובת עניין סך של 3 מ ל SAB צינור חרוטי 15 מ"ל על הנשימה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Respirometry ברזולוציה גבוהה
<ol><li>הכנת respirometer ברזולוציה גבוהה.
	<ol>
<li>הפעל את respirometer ברזולוציה גבוהה ולאחר להתחבר אל שולחן העבודה על-ידי השקת התוכנית ניתוח respirometer.</li>
		<li>האחות אתנול 70% מן התאים שניכם. משרים את התאים האלה אתנול 70% למשך תקופה מינימלית של 45 דקות.</li>
		<li>לשטוף את צ'יימברס פעמיים עם אתנול 70%, כ רפה בעברית לאחר כל שלב.</li>
		<li>לשטוף את צ'יימברס שלוש פעמים עם ddH2O, כ רפה בעברית לאחר כל שלב.</li>
		<li>לשטוף את בוכנות קאמרית ב- ddH2O. זה מנקה את אתנול שיורית של בוכנות ומן הנמל טיטניום.</li>
	</ol></li>
	<li>כיול של חיישני חמצן polarographic.
	<ol>
<li>להוסיף 2.4 מ ל 1 x SAB גלוקוז נמוך מאגר כל תא oxygraph, זע המאגר באופן רציף באמצעות מערבבים מגנטי ברים בבית הבליעה-750 סל ד ו- 37 ° C עם מרווח לצריבת נתונים ב 2.0 s על-ידי לחיצה על כפתור F7 ופתיחה הכרטיסיה שכותרתו "מערכות". לדחוף בוכנות כל הדרך פנימה, ומשכו אז אל ההגדרה לערבב ברגים. תן את מכונת equilibrate למשך תקופה מינימלית של שעה עד חמצן יציב השטף מתקבל.</li>
		<li>הגדר את המכונה ב 37 מעלות צלזיוס משך זמן הניסוי. הגדר קיטוב מתח 800 mV, עם רווח של 2 על ידי ללחוץ על הכפתור F7 ולאחר פתיחת הכרטיסיה בשם "חמצן, O2". Equilibrate את ריכוז החמצן המאגר SAB במשך לפחות 30 דקות, ואילו השינוי בריכוז חמצן הוא יציב (פחות מ-2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>לאחר ייצוב ריכוז חמצן, בחר אזור שבו השינוי של ריכוז חמצן יציב כדי ליצור רקע מדידות של שינוי בריכוז החמצן.<ol>
<li>בחר אזור על ידי לחיצה על מקש shift, לחיצה שמאלה על העכבר גרירת העכבר ברחבי האזור הנבחר. לחץ על האות המשויכים לשינוי "R1" והאזור שנבחר עבור כל עקבות, עם כל אחד שני תאים.</li>
			<li>לחץ פעמיים על תיבת "O2 כיול" בפינה השמאלית התחתונה, נכון הפינות של המסך, לחץ על הלחצן "בחר מארק" עבור "הכיול אוויר" כמו R1 ולאחר מכן בחר "לכייל, העתק ללוח" עבור שניהם צ'יימברס.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>הערכה של הנשימה של תאי הבטא 832/13 שהוכנו בשלבים 2.1.5 או 2.2.5.
	<ol>
<li>טען 2.4 מ של דגימה בכל אחד (אחד קאמרית עם בקרת רכב מטופל תאים, תא אחד עם מתחם תאים שטופלו) ב 1 x SAB. גלוקוז נמוך שומרים על 0.5 מ של דגימות התאים עבור כימות חלבונים על ידי assay BCA (חומצה Bicinchoninic) אם באמצעות גישה דיסוציאציה מכני (קיפאון ב-20 ° C למדידה מאוחר יותר).<ol>
<li>לדחוף את הבוכנה פנימה עד הסוף, תשאף האחסון שיורית. מערבבים את התאים באופן רציף לאורך כל הניסוי-750 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס במשך כל השלבים הבאים. להפוך סימן על-ידי לחיצה על F4, תיוג כמו "תאים" כאשר דגימות נטענים.</li>
			<li>למדוד דגימות למשך 30 דקות. לאחר ייצוב האות, בחר אזור של השינוי בריכוז חמצן המתאימים לתנאים גלוקוז נמוך (2.5 מ"מ גלוקוז) כפי שמתואר 3.2.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לאחר ייצוב האות מתמלאת, להוסיף 12.5 µL של פתרון גלוקוז סטרילי 45% (הריכוז הסופי 16.7 מ מ) לתא בכל דרך טיטניום טעינת יציאה באמצעות מזרק. להפוך שסימן נמדד "גלוקוזה" כפי שמתואר 3.3.1 כאשר טיפול נוסף. האות ניתן לייצב ולהקליט נשימה תאית עד זרימה יציבה חמצן מושגת. בחר אזור זה של השינוי בריכוז חמצן, כפי שמתואר 3.2.3. זוהי קריאת גלוקוז 16.7 מ מ, והיא מתכתבת עם תנאים מופחתים7.</li>
		<li>לאחר ייצוב האות מתמלאת להוסיף 1 µL של 5 מ מ oligomycin (2.5 מיקרומטר הסופי ריכוז) לתא בכל דרך יציאת הטעינה. להפוך שסימן נמדד "OligoA" כפי שמתואר 3.3.1 כאשר טיפול נוסף. האות ניתן לייצב ולהקליט נשימה תאית עד זרימה יציבה חמצן מושגת. בחר את האזור הזה של העקומה כפי שמתואר 3.2.3. Oligomycin A מעכב ATP סינתאז, ובכך המתרחשים חמצן השטף היחידה היא באמצעות דליפה של אלקטרונים ולא זרחון חמצוני7.</li>
		<li>לאחר ייצוב האות מתמלאת מוסיפים 1 מ"מ FCCP במרווחים של 1 µL עד קצב הנשימה המרבי הוא הוקם. זה מייצג נשימה חשיפות מקסימלי. בין 3-4 µL FCCP הוא מספיק (1.5-2.0 מיקרומטר הסופי ריכוז) לזירוז נשימה חשיפות מקסימלי של תוספות-1 832/13 תאים. הפוך סימון עם התווית "FCCP" כפי שמתואר 3.3.1 כאשר טיפול נוסף. האות ניתן לייצב ולהקליט נשימה תאית עד זרימה יציבה חמצן מושגת. בחר את האזור הזה של העקומה כפי שמתואר 3.2.3. FCCP הוא סוכן uncoupling. זה מאפשר לנו למדוד נשימה חשיפות7.</li>
		<li>לאחר ייצוב האות מתמלאת להוסיף 1 µL של 5 מ מ Antimycin A (ריכוז סופי 2.5 מיקרומטר) לתא בכל דרך יציאת הטעינה. להפוך סימן שכותרתו "אנטיה" כפי שמתואר 3.3.1 כאשר טיפול נוסף. האות ניתן לייצב ולהקליט נשימה תאית עד זרימה יציבה חמצן מושגת. בחר את האזור הזה של העקומה כפי שמתואר 3.2.3. הערה: Antimycin A נקשר ציטוכרום C reductase, מעכב חמצון ubiquinone ו חוסם כל נשימה. זה מאפשר לנו להפסיק לחלוטין את הנשימה7.</li>
	</ol></li>
	<li>מדידת 832/13 בתאי בטא עבור חלבונים ריכוז ונשימה נורמליזציה.
	<ol>
<li>באמצעות 0.5 mL מדגם נשמר-טעינה, למדוד חלבון לדוגמה באמצעות שיטת BCA13.</li>
		<li>הפעל כל מדגם שהפקידים, ללא דילול, ההוראות של היצרן.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 תאי בטא נשימה חישובים מתאי trypsinized.<ol>
<li>הזן את מספר התאים לכל שימוש mL וזמינותו על-ידי לחיצה על לחצן F3 של התוכנית ניתוח respirometer. לשנות את היחידות תאים למ"ל, הזן את הריכוז הסלולר ולשנות בינוני עד SAB.</li>
		<li>בחר רקע קריאות כדי לנרמל את הנתונים על-ידי בחירת ולחתימה על O2 טופס כיול כפי שמתואר 3.2.3.</li>
		<li>לבצע בחירות של קריאות מכל 2.5 מ"מ גלוקוז, 16.7 מ מ גלוקוז, Oligomycin A, FCCP ו- Antimycin A כמתואר 3.3.1.</li>
		<li>בתוך התוכנית ניתוח respirometer, לייצא את קריאות אחד לאחר הזנת ריכוז חלבון ובחירה את הערך הממוצע עבור כל טיפול במהלך המדידה נשימה. פעולה זו מתבצעת על-ידי לחיצה על F2, ודחף את "העותק לפונקציה הלוח". זה מייצא את הנתונים לשימוש בתוכניות אחרות ניתוח. השתמש בערכים "O2 שיפוע שלילי" עבור חישובים.</li>
		<li>בצע הידור נתונים עבור 3-5 ריצות עצמאית של הרכב מטופלים פקדים טבעי תרכובות תאים שטופלו כדי לקבוע את ההשפעה על נשימה תאית תקין של תאי הבטא 832 הארצי-1/13.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 תאי בטא נשימה חישובים מן מכנית הפומבית תאים.<ol>
<li>הזן את החישובים חלבון וזמינותו BCA על-ידי לחיצה על לחצן F3 של התוכנית ניתוח respirometer. לשנות את היחידות מ ג, הזן את הריכוז BCA ולשנות בינוני עד SAB.</li>
		<li>בחר רקע קריאות כדי לנרמל את הנתונים על-ידי בחירת ולחתימה על O2 טופס כיול כפי שמתואר 3.2.3.</li>
		<li>לבצע בחירות של קריאות מכל 2.5 מ"מ גלוקוז, 16.7 מ מ גלוקוז, Oligomycin A, FCCP ו- Antimycin A כמתואר 3.3.1.</li>
		<li>בתוך התוכנית ניתוח respirometer, לייצא את קריאות אחד לאחר הזנת ריכוז חלבון ובחירה את הערך הממוצע עבור כל טיפול במהלך המדידה נשימה. פעולה זו מתבצעת על-ידי לחיצה על F2, ודחף את "העותק לפונקציה הלוח". זה מייצא את הנתונים לשימוש בתוכניות אחרות ניתוח. השתמש בערכים "O2 שיפוע שלילי" עבור חישובים.</li>
		<li>בצע הידור נתונים עבור 3-5 ריצות עצמאית של הרכב מטופלים פקדים טבעי תרכובות תאים שטופלו כדי לקבוע את ההשפעה על נשימה תאית תקין של תאי הבטא 832 הארצי-1/13.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Mueckler, M., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SLC2+%28GLUT%29+family+of+membrane+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).</li>
<li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).</li>
<li>Strat, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+by+which+cocoa+flavanols+improve+metabolic+syndrome+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders.</a> J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).</li>
<li>Rowley, T. J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+cocoa+catechins+enhance+%CE%B2-cell+function+by+increasing+mitochondrial+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration.</a> J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).</li>
<li>Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+Respirometry+to+Assess+Mitochondrial+Function+in+Permeabilized+and+Intact+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li>
<li>Reynolds, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Cell+deletion+of+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors+impedes+mitochondrial+respiration+and+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).</li>
<li>Hals, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Respiration+in+Insulin-Producing+beta-Cells%3A+General+Characteristics+and+Adaptive+Effects+of+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia.</a> PLoS One. 10 (9), e0138558(2015).</li>
<li>Ray, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6.1-mediated+insulin+secretion+and+beta-cell+proliferation+is+dependent+on+upregulation+of+c-Fos%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos.</a> FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).</li>
<li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li>
<li>Tessem, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6.1+regulates+islet+beta-cell+proliferation+via+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).</li>
<li>Hobson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+Kinase+A+is+critical+for+the+Nkx6.1+mediated+beta-cell+proliferation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway.</a> Islets. 7 (1), e1027854(2015).</li>
<li>Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5r1+Overexpression+Induces+Primary+beta-Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation.</a> J Diabetes Res. 2016, 6375804(2016).</li>
<li>Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+and+curcumin+enhance+pancreatic+beta-cell+function+by+inhibiting+phosphodiesterase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity.</a> J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+reduces+beta-cell+mitochondria+and+induces+distinct+morphological+abnormalities%2C+which+are+reproducible+by+high+glucose+in+vitro+with+attendant+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction.</a> Islets. 4 (3), 233-242 (2012).</li>
<li>Chavanelle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high-intensity+interval+training+and+moderate-intensity+continuous+training+on+glycaemic+control+and+skeletal+muscle+mitochondrial+function+in+db%2Fdb+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice.</a> Sci Rep. 7 (1), 204(2017).</li>
<li>Jelenik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Insulin+Resistance+in+Primary+and+Secondary+Nonalcoholic+Fatty+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver.</a> Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).</li>
<li>Spacek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+insulin+secretion+of+insulinoma+INS-1E+cells+is+associated+with+elevation+of+both+respiration+and+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).</li>
<li>Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4623989/">H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).</li>
<li>Johnson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressed+insulin+signaling+and+increased+apoptosis+in+CD38-null+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets.</a> Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את הנשימה בבתי שלם בתאי בטא בלבלב. שיטה זו מאפשרת מדידת תגובת תאי בטא רמות גלוקוז מוגברת. הפרוטוקול מאפשר גם רעלני עם תרכובות שונות, כפי שמתואר ב פרוטוקול זה עם המתרחשים באופן טבעי monomeric epicatechin או כורכומין4,5. פרוטוקול זה, עם רעלני (כפי שמוצג כאן), או על ידי טיפול בתוך התאים הנשימה עם שינויים מינימליים פרוטוקול בסיסי יכול לשמש טיפול עם תרכובות שונות אח...

המטרה העיקרית של תאי בטא בלבלב היא לשמור על המערכת normoglycemia באמצעות הפרשת האינסולין מגורה-גלוקוז. תאי הבטא לחוש שינויים פיזיולוגיים במחזור גלוקוז בעיקר בשל בזיקה נמוכה, קיבולת גבוהה גלוקוז טרנספורטר GLUT2 (גלוקוז המשלח 2, Km 16.7 מ מ)1. לעלות רמות הגלוקוז במחזור הדם, טרנספורטר נמוך-זיקה זו בקיבולת גבוהה מקלה על גידול יחסי של גלוקוז תאיים בתוך התא בטא. גלוקוז עובר מטבוליזם דרך גליקוליזה, מחזור TCA (מחזור חומצה tricarboxylic) מיטוכונדריאלי הנשימה וכתוצאה מכך רמות גבוהות של ATP (אדנוזין טריפוספט) הסלולר. ריכוז ATP מוגברות חוסם ATP רגיש K+ הערוצים, וכתוצאה מכך ממברנה דפולריזציה. דפולריזציה הממברנה גורם הפתיחה של מתח מגודרת Ca2 + ערוצי וכרוכים שחרור עוקבות של שלפוחית אינסולין בגרגרים2. תפקוד לקוי של תאי בטא מהווה סימן היכר של סוכרת מסוג 2 (T2D), ותוצאות הפרשת האינסולין ירדה ומבוקר לקוי ובסופו של דבר למוות תאי בטא3- מנגנונים לשמור או לשפר את תפקוד תאי בטא יכול לשמש כטיפול עבור T2D.
מחקרים הראו את ההשפעות המיטיבות של באופן טבעי המבוסס על צמח תרכובות תאי בטא בלבלב4. תרכובות אלו ייתכן השפעתם באמצעות הגדלת התפשטות תאי בטא, הישרדות או הפרשת האינסולין מגורה-גלוקוז. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי monomeric epicatechin מגבירה את הפרשת האינסולין מגורה-גלוקוז ע י הגברת הנשימה מיטוכונדריאלי, הגדלת הסלולר ATP רמות5. לכן, להבין איך תרכובות אלו יכולים להגדיל את תאי בטא פונקציונלי מסה חשוב למנף תרכובות אלו כמו הרפוי פוטנציאליים.
נשימה תאית ניתן למדוד באמצעות מספר כלים. השימוש respirometer ברזולוציה גבוהה מאפשר טיטור של מאפננים כימי אוכלוסיית תאים permeabilized או שלם6. כלי זה מאפשר התוספת של תרכובות שונות, בריכוזים שונים, ובכך נותן מגוון רחב של מידע.
לאור הקשר האינטימי בין מטבוליזם הגלוקוז ותפקוד תאי בטא, מדידות של נשימה תאית הם קריטיים. מדידות של נשימה תאית יכול להיעשות באמצעות תאי הבטא או permeabilized או שלם, עם כל בעל קבוצה נפרדת של היתרונות והחסרונות7,8. בעוד permeabilization של תאי הבטא מאפשרת למדוד היבטים שונים של רשת התחבורה אלקטרון, היא עושה זאת מבלי בתועלת מנגנון להשראת הנשימה תאי בטא, ספיגת הגלוקוז ואת חילוף החומרים. לכן, השימוש של תאי בטא unpermeabilized נשימה היא טכניקה מאוד שימושי כדי לקבוע את תאי הבטא בתגובה רמות גלוקוז שונות, באמצעות צריכת חמצן כמו המדידה.
מטרת טכניקה זו היא למדוד את צריכת החמצן של תוספות ללא פגע-1 נגזר בתאי בטא 832/13. טכניקה זו מאפשרת לנו לקבוע את התגובה של תאי הבטא לתנאים גלוקוז unstimulatory (גלוקוז 2.5 מ מ) כמו גם תנאים מופחתים גלוקוז (מ מ 16.7 גלוקוז). בעוד unpermeabilized התאים אינם מאפשרים לנו לבחון באופן אינדיבידואלי את מתחם הראשון, השני או השלישי של האלקטרון הובלה שרשרת, הטכניקה מתירה מדידות התמודדות עם מורכבות הרביעי עיכוב (Oligomycin א), חשיפות נשימה (FCCP-קרבוניל ציאניד- 4- phenylhydrazone (trifluoromethoxy)), ואת לגמרי עכבות נשימה (Antimycin א). מחקר זה מדגים את היעילות של מדידת נשימה ללא פגע בתאי בטא בלבלב unpermeabilized, כמו גם ההשפעה של שתי תרכובות המתרחשים באופן טבעי, monomeric epicatechin, כורכומין, על הנשימה תאי בטא.

<table><tbody><tr><td>ליבת O2k: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>מכשיר לרספיריומטריה ברזולוציה גבוהה</td></tr><tr><td>DatLab 6 Program</td><td>Oroboros Instruments</td><td>27141-01</td><td>תוכנת מחשב לניתוח רספירומטריה בראולוציה גבוהה</td></tr><tr><td>INS-1 832/13 קו תאים במרכז</td><td>הרפואי של אוניברסיטת דיוק</td> קו <td>תאי בטא NONE, מתנה מד"ר כריסטופר ניוגארד</td><td></td></tr><tr><td>כורכומין</td><td>Sigma</td><td>C7727</td><td>טיפול מקדים בתאי בטא</td></tr><tr><td>מונומר קקאו אפיקטכין המכון</td><td>הפוליטכני של וירג'יניה ואוניברסיטת המדינה</td><td>NONE</td><td>טיפול מקדים בתאי בטא, מתנת ד"ר אנדרו נילסון</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>סיגמא</td><td>T4049</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>סיגמא</td><td>R8758</td><td>832/13 מדיה תאי בטא</td></tr><tr><td>סרום בקר</td><td>עוברי Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>832/13 רכיב מדיה של תאי בטא</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td>832/13 רכיב מדיה של תאי</td></tr><tr><td>בטא HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3662</td><td>832/13 רכיב מדיה של תאי בטא/ 1x SAB Buffer</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Caisson</td><td>GLL01</td><td>832/13 רכיב מדיה של תאי בטא</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא</td><td>S8636</td><td>832/13 רכיב מדיה של תאי בטא</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>832/13 רכיב מדיה של תאי בטא</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td>רכיב של 10x מאגר SAB</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>רכיב של 10x מאגר SAB</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>רכיב של 10x מאגר SAB</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>רכיב של 10x מאגר SAB</td></tr><tr><td>D-(+)-תמיסת גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>רכיב של 1x מאגר SAB, כימיקל לבדיקת נשימה</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>רכיב של 1x מאגר SAB</td></tr><tr><td>35% תמיסת BSA</td><td>Sigma</td><td>A7979</td><td>רכיב של 1x מאגר SAB</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>רכיב של 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>200 הוכחה אתנול</td><td>סיגמא</td><td>459844</td><td>כביסה אוקסיגרף O2k תאים</td></tr><tr><td>אוליגומיצין A</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>כימיקלים לבדיקת נשימה</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>כימיקלים לבדיקת נשימה</td></tr><tr><td>Anitmycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>כימיקלים לבדיקת נשימה</td></tr><tr><td>ערכת חלבון BCA</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td>לקביעת ריכוז חלבון</td></tr></tbody></table>

respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את הפונקציה מיטוכונדריאלי של תאי הבטא תקין בנוכחות תרכובות טבעיות

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Respirometry ברזולוציה גבוהה מאפשרת מדידת צריכת החמצן של המיטוכונדריה מבודד, תאים ורקמות. תאי הבטא תפקיד חיוני בגוף על ידי השליטה רמות הגלוקוז בדם באמצעות הפרשת האינסולין בתגובה ריכוזי גלוקוז גבוהות. הפרשת האינסולין נשלטת על ידי נשימה מיטוכונדריאלי מטבוליזם של גלוקוז. לכן, מדידת נשימה תאי בטא שלם הוא חיוני יוכל לשפר את תפקוד תאי בטא כטיפול בסוכרת. באמצעות תוספות ללא פגע 832/13-1 נגזר בתאי בטא אנו יכולים למדוד את ההשפעה של הגדלת ריכוז הגלוקוז על נשימה תאית. פרוטוקול זה מאפשר לנו למדוד את הנשימה תאי בטא, נוכחות או היעדרות של תרכובות שונות, המאפשרת לקבוע את ההשפעה של נתון תרכובות על נשימה תא שלם. כאן אנחנו מדגימים את ההשפעה של שתי תרכובות המתרחשים באופן טבעי, monomeric epicatechin, כורכומין, על הנשימה תאי בטא תחת הנוכחות של נמוך (2.5 מ מ) או תנאים גלוקוז גבוהות (16.7 מ מ). ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקבוע את ההשפעה של תרכובות שונות על תאי בטא ללא פגע הנשימה בנוכחות שונות ריכוזי גלוקוז.

תאי הבטא 832 הארצי-1/13, כי הם מוכנים שנקטפו כמפורט בפרוטוקול תדגים אפנון בצריכת החמצן בהתבסס על ההתערבות כימיים שונים (איור 1 א'). עלייה נשימה יתקיימו כאשר ריכוז הגלוקוז הוא גדל עד 16.7 מ"מ גלוקוז (איור 1B). נשימה יקטן כאשר התאים ללא פגע מטופלים עם Oligomycin א נשימה זו ידועה בשם דליפה, אשר מוגדרת בתור המדינה בדרכי הנשימה הבזליים, nonphosphorylating. נשימה מקסימלי תושג כאשר תאי הבטא מטופלים עם הסוכן uncoupling FCCP, אשר מוגדר ETS נשימה, או אלקטרון התחבורה מערכת...

המטרה של פרוטוקול זה היא כדי למדוד את ההשפעה של שינויים בתיווך גלוקוז נשימה מיטוכונדריאלי בנוכחות תרכובות טבעיות על תאי הבטא תקינה 832/13 באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה.

Respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את הפונקציה מיטוכונדריאלי של תאי הבטא תקין בנוכחות תרכובות טבעיות

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

המטרה הכוללת של גישה זו היא להעריך ישירות את תפקוד הנשימה של תאי בטא בלבלב, בתנאים מעוררי אינסולין. זה יכול לשמש גם כדי להתבונן בהשפעה של תרכובות שונות על תפקוד הנשימה של תאי בטא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של תאי בטא בלבלב, כגון האם תרכובת מסוימת משפיעה על תפקוד תאי הבטא של הלבלב באמצעות שינויים בנשימה.היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שניתן להשתמש בה כדי להעריך ישירות את תפקוד הנשימה בתאי בטא בלבלב, בתנאים מעוררים בסיסיים ואינסולין. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הכנת התאים והשימוש במכונה, בשל הדיוק הנדרש בהכנת התאים ומדידת הנשימה. כדי להתחיל, תרבית תאי בטא 832/13 שמקורם ב-INS-1 בתוספת RPMI 1640.הוציאו את התאים מבקבוק T75, על ידי הוספת שני מיליליטר של 0.25% טריפסין, ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, נטרל את הטריפסין על ידי הוספת שמונה מיליליטר של מדיה RPMI 1640 מלאה. יש לדלל 100 מיקרוליטר מנפח התא ב-900 מיקרוליטר PBS, ולספור את התאים באמצעות המוציטומטר.לאחר מכן, צלחו את התאים בצפיפות של מיליון תאים למיליליטר, בצלחת של 10 סנטימטרים. תרבו את התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, לפני תחילת ניסויי הנשימה. החלף את המדיה 24 שעות לאחר הציפוי והתרבות של תאי 832/13 באינקובטור לח ב-37

high-resolution-respirometry-to-measure-mitochondrial-function-intact

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

respirometry ברזולוציה גבוהה משמש לקביעת צריכת חמצן המיטוכונדריה. זוהי טכניקה פשוטה כדי לקבוע מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה '(I-IV) מחירי נשימה, קיבולת מערכת תחבורת אלקטרון מקסימלי המיטוכונדריה, ויושרת הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה.

ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

כאן, דגימת שריר ארבע ראשי נלקחת מחזיר מורדם והמיטוכונדריה מבודדת על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית. לאחר מכן, קצב הנשימה של מתחמי שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית I, II ו-IV נקבעים באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

הערכת זרחון חמצוני באמצעות מד נשימה ברזולוציה גבוהה הפכה לחלק בלתי נפרד מהניתוח הפונקציונלי של מיטוכונדריה ומטבוליזם של אנרגיה תאית. כאן אנו מציגים פרוטוקולים לניתוח חילוף החומרים של אנרגיה תאית באמצעות מדים מבוססי תאים ומיקרו-פלטות ברזולוציה גבוהה ודנים ביתרונות העיקריים של כל מכשיר.

Respirometry ברזולוציה גבוהה להערכת ביו-אנרגיה בתאים וברקמות באמצעות מדים מבוססי תאים ולוחות

נשימה ברזולוציה גבוהה המוצמדת לחיישנים פלואורסצנטיים קובעת את צריכת החמצן המיטוכונדריה ואת ייצור מיני החמצן הריאקטיבי (ROS). הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת שיעורי הנשימה המיטוכונדריאליים וייצור ROS בעצב הסיאטי החודר.

הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

המצב המטבולי של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית האנושית (H-RPE) משקף את בריאותם ותפקודם. מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לבחינת שטף מטבולי בזמן אמת של H-RPE באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

ניתוח בזמן אמת של ביואנרגטיקה בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים בבני אדם באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

ניתוח תפקוד המיטוכונדריה של הזרע על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשר למדוד את צריכת החמצן של זרעונים הנעים בחופשיות במערכת תא סגור. ניתן ליישם את הטכניקה למדידת נשימה בזרעונים אנושיים, המספקת מידע על מאפייני המיטוכונדריה של הזרע ושלמותו.

רספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת תפקוד המיטוכונדריה בזרעונים אנושיים

במאמר זה אנו מתארים שיטה מקיפה למדידת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי בסיבי שריר שלד טריים משריר אדם או עכבר. שיטה זו מאפשרת כימות בזמן אמת של נשימה מיטוכונדריאלית והערכת העדפת דלק וגמישות מטבולית תוך שמירה על רשתות מיטוכונדריאליות קיימות ושלמות הממברנה.

מדידת נשימה מיטוכונדריאלית בסיבי שרירי שלד של בני אדם ועכבר על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה

השיטות לחקר ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית תחת ריכוזי מצע רלוונטיים פיזיולוגית בתאי מערכת החיסון מוגבלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט המשתמש בפלואורספירומטריה ברזולוציה גבוהה כדי להעריך שינויים בתגובה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית לדרישת אנרגיה בתאי T אנושיים, מונוציטים ותאים חד-גרעיניים היקפיים.

פלואורספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת שינויים דינמיים בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בתאי מערכת החיסון האנושית

כאן, אנו מראים כי תא ה-0.5 מ"ל לרספריומטריה ברזולוציה גבוהה מציג תוצאות העולות בקנה אחד עם תא ה-2.0 מ"ל אם מיושם תיקון רקע O2 אינסטרומנטלי מתאים. זה דורש פחות דגימה, וזה יתרון למחקרים עם זמינות מוגבלת או יכולות נשימה נמוכות.

רספירומטריה ברזולוציה גבוהה בתא בנפח קטן

אנו מציגים שיטה לא פולשנית בזמן אמת למעקב אחר בריאות המיטוכונדריה באמצעות ספקטרוסקופיית ראמן תהודה (RRS). השתמשנו ב-RRS לכימות מצבי רדוקושן במיטוכונדריה ופיתחנו מדד לבריאות המיטוכונדריה, יחס המיטוכונדריה המופחת של רזוננס ראמן (3RMR), שמראה תגובה מהירה יותר לשינויים בחמצון מאשר אנליטים מסורתיים של גזי דם.

הערכה בזמן אמת, לא פולשני, של תפקוד מיטוכונדריה באמצעות ספקטרוסקופיית רמאן תהודה

למדו להעריך את פונקציית הנשימה המיטוכונדריאלית של תאי בטא בלבלב באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת מדידה מדויקת של השפעת תרכובות טבעיות על מטבוליזם התאים.

Respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את הפונקציה מיטוכונדריאלי של תאי הבטא תקין בנוכחות תרכובות טבעיות

גלה סרטונים נוספים