Respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את הפונקציה מיטוכונדריאלי של תאי הבטא תקין בנוכחות תרכובות טבעיות

המטרה הכוללת של גישה זו היא להעריך ישירות את תפקוד הנשימה של תאי בטא בלבלב, בתנאים מעוררי אינסולין. זה יכול לשמש גם כדי להתבונן בהשפעה של תרכובות שונות על תפקוד הנשימה של תאי בטא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של תאי בטא בלבלב, כגון האם תרכובת מסוימת משפיעה על תפקוד תאי הבטא של הלבלב באמצעות שינויים בנשימה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שניתן להשתמש בה כדי להעריך ישירות את תפקוד הנשימה בתאי בטא בלבלב, בתנאים מעוררים בסיסיים ואינסולין. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הכנת התאים והשימוש במכונה, בשל הדיוק הנדרש בהכנת התאים ומדידת הנשימה. כדי להתחיל, תרבית תאי בטא 832/13 שמקורם ב-INS-1 בתוספת RPMI 1640.

הוציאו את התאים מבקבוק T75, על ידי הוספת שני מיליליטר של 0.25% טריפסין, ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, נטרל את הטריפסין על ידי הוספת שמונה מיליליטר של מדיה RPMI 1640 מלאה. יש לדלל 100 מיקרוליטר מנפח התא ב-900 מיקרוליטר PBS, ולספור את התאים באמצעות המוציטומטר.

לאחר מכן, צלחו את התאים בצפיפות של מיליון תאים למיליליטר, בצלחת של 10 סנטימטרים. תרבו את התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, לפני תחילת ניסויי הנשימה. החלף את המדיה 24 שעות לאחר הציפוי והתרבות של תאי 832/13 באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

לאחר מכן, טפל בתאים עם בקרת רכב או נגזרת קקאו, מונומר אפיקטכין, לריכוז סופי של 100 ננו-מולר. יש לעקוב אחר תוספת הטיפול בתרבית למשך 24 שעות נוספות באינקובטור לח, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. לאחר מכן, שטפו את התאים במאגר הפרשת גלוקוז נמוך פי 1, או SAB למשך חמש דקות.

שאפו את המאגר ודגרו את התאים ב-SAB נמוך פי 1 למשך שלוש שעות, והחליפו את המאגר כל שעה. לאחר הדגירה מוציאים את התאים מהצלחת עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין. שלב את התאים בטריפסין מהצלחת שטופלה בבקרת רכב, עם ארבעה מיליליטר SAB בצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

באופן דומה, שלבו את המנה שטופלה עם תרכובת העניין, עם חיץ. יש לדלל 100 מיקרוליטר מנפח התא ב-900 מיקרוליטר PBS, ולספור את התאים באמצעות המוציטומטר. יש לדלל 100 מיקרוליטר מנפח התא ב-900 מיקרוליטר PBS, ולספור את התאים באמצעות המוציטומטר.

הנתונים מוכיחים, כי ריכוז של מיליון תאים למיליליטר הוא היעיל ביותר. לאחר הכנת מד הנשימה ברזולוציה גבוהה כמפורט בפרוטוקול הטקסט, הוסף 2.4 מיליליטר של מאגר SAB נמוך פי 1 לכל תא אוקסיגרף. מערבבים את המאגר ברציפות באמצעות מוטות ערבוב מגנטיים בתא ב-750 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס, עם מרווח הקלטת נתונים של 2.0 שניות.

לשם כך, בחר בלחצן F7 ופתח את הכרטיסייה שכותרתה, מערכות. דחוף את הבוכנות עד הסוף ואז החזר אותן להגדרת אוורור מפתח הברגים. תן למכונה להתאזן למשך שעה לפחות עד לקבלת שטף חמצן יציב.

לאחר מכן, הגדר את המכונה על 37 מעלות צלזיוס למשך הניסוי. לחץ על כפתור F7 ופתח את הלשונית שכותרתה, חמצן O2, כדי להגדיר את מתח הקיטוב ל-800 מילי-וולט עם רווח של שניים. אזנו את ריכוז החמצן של מאגר ה-SAB למשך 30 דקות לפחות, עד שהשינוי בריכוז החמצן יציב.

לאחר מכן, בחר אזור שבו השינוי בריכוז החמצן יציב כדי לבסס מדידת רקע של שינוי בריכוז החמצן, על ידי לחיצה על מקש Shift, לחיצה שמאלית על העכבר וגרירת העכבר על פני האזור שנבחר. לחץ על האות המשויכת לאזור שנבחר ושנה אותה ל-R1 עבור כל עקבה המתאימה לכל אחד משני החדרים. לחץ פעמיים על תיבת הכיול O2 בפינה השמאלית והימנית התחתונה של המסך.

לחץ על כפתור בחר סימון עבור כיול האוויר כ-R1, ולאחר מכן בחר כיול והעתק ללוח עבור שני החדרים. לאחר מכן, טען 2.4 מיליליטר של דגימה בכל תא, העמיס תא אחד עם תאים שטופלו ברכב הבקרה ותא אחד עם תאים שטופלו בתרכובת ב-SAB נמוך פי 1. דחף את הבוכנה פנימה עד הסוף ושאף את הנפח הנותר.

מערבבים את התאים ברציפות לאורך כל הניסוי ב-750 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס לכל השלבים הבאים. צור סימן על ידי לחיצה על F4 ותיוג הסימון כתאים בעת טעינת דגימות. מדוד את הדגימות למשך 30 דקות.

לאחר ייצוב האות, בחר אזור של השינוי בריכוז החמצן המתאים לתנאי הגלוקוז הנמוך. לאחר מכן, הוסף 12.5 מיקרוליטר של תמיסת גלוקוז סטרילית של 45% לכל תא דרך יציאת הטעינה של טיטניום באמצעות מזרק. סמן את הכיתוב גלוקוז, כאשר מוסיפים את הטיפול.

תן לאות להתייצב ולהקליט את הנשימה התאית עד להשגת שטף חמצן יציב. בשלב זה, בחר את אזור השינוי בריכוז החמצן כדי לייצג את קריאת הגלוקוז של 16.7 מילי-מולרי, התואמת לתנאים מעוררים. לאחר הגעה לייצוב האות, הוסף מיקרוליטר אחד של חמישה מילי-מולרית אוליגומיצין A לכל תא דרך יציאת הטעינה.

סמן סימן עם התווית, OligoA, כאשר הטיפול מתווסף. תן לאות להתייצב ולהקליט את הנשימה התאית עד להשגת שטף חמצן יציב. לאחר השגת שטף חמצן יציב, בחר אזור זה של העקומה.

אוליגומיצין A מעכב ATP סינתאז ולכן שטף החמצן היחיד המתרחש הוא באמצעות דליפת אלקטרונים ולא זרחון חמצוני. לאחר מכן, הוסף FCCP מילי-מולרי אחד במרווחים של מיקרוליטר אחד עד לקביעת קצב נשימה מקסימלי. זה מייצג נשימה מקסימלית לא מצומדת.

בין שלושה לארבעה מיקרוליטרים של FCCP, מספיק כדי לגרום לנשימה מקסימלית לא מצומדת של תאי בטא 832/13 שמקורם ב-INS-1. סמן את הכיתוב FCCP בעת הוספת הטיפול. תן לאות להתייצב ולהקליט את הנשימה התאית עד להשגת שטף חמצן יציב.

לאחר מכן, בחר אזור זה של העקומה. FCCP הוא חומר ניתוק, המאפשר מדידה של נשימה לא מצומדת. לאחר הגעה לייצוב האות, הוסף מיקרוליטר אחד של חמישה מילי-מולרי אנטימיצין A לכל תא דרך יציאת הטעינה.

סמן סימן שכותרתו AntiA, כאשר מוסיפים טיפול וחזור על הליך בחירת העקומה. הזן את מספר התאים למיליליטר המשמשים בבדיקה, על ידי לחיצה על כפתור F3 של תוכנית ניתוח הנשימה. שנה את היחידות לתאים למיליליטר, הזן את ריכוז התאים ושנה את המדיום ל- SAB.

בחר את קריאות הרקע כדי לנרמל את הנתונים על ידי בחירה וכניסה לטופס כיול החמצן. בצע בחירות של קריאות מ-2.5 מילי-מולרי גלוקוז, 16.7 מילי-מולרי גלוקוז, אוליגומיצין A, FCCP ואנטימיצין A.בתוך תוכנית ניתוח הנשימה, הזן את ריכוז החלבון ובחר את הערכים הממוצעים המתאימים לכל טיפול במהלך מדידת הנשימה. לאחר מכן, לחץ על F2 ולחץ על העתק ללוח פונקציה.

פעולה זו מייצאת את הנתונים לשימוש בתוכניות ניתוח אחרות. השתמש בערכים השליליים של שיפוע O2 לחישובים. אסוף את הנתונים עבור שלוש עד חמש ריצות עצמאיות של בקרות שטופלו ברכב ותאים שטופלו בתרכובות טבעיות כדי לקבוע את ההשפעה על הנשימה התאית השלמה של תאי בטא 832/13 שמקורם ב-INS-1.

תאי בטא 832/13 שלמים שמקורם ב-INS-1 מדגימים עלייה בניצול החמצן הנגרמת על ידי גלוקוז. זה קריטי להשתמש במספר התאים המתאים. התוצאות שנאספו בניסוי זה מוכיחות כי מיליון תאים למיליליטר היא הכמות האופטימלית.

תאי בטא 832/13 שמקורם ב-INS-1 שטופלו בכורכומין לא הראו שינוי בנשימה הכללית. לעומת זאת, תאי בטא 832/13 שמקורם ב-INS-1 שטופלו באפיקטכינים של קקאו מונומריים היו בעלי נשימה מוגברת ב-2.5 מילי-מולרי גלוקוז ו-16.7 מילי-מולרי גלוקוז. נשימה מוגברת נצפית גם במצב הדליפה שהוא מצב הנשימה הבסיסי שאינו זרחני, כמו גם הנשימה של מערכת הובלת האלקטרונים או מצב ETS, שהוא נשימה מקסימלית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך ישירות את תפקוד הנשימה של תאי בטא בלבלב בתנאים מעוררי אינסולין. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בתאים עם מאגר SAB נמוך של גלוקוז, ולקבל ספירת תאים מדויקת לבדיקה.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו להשיג את הכמות הנכונה של תאים למדידות יעילות. עם יותר מדי תאים, קשה להעריך את האות ועם מעט מדי, האות אינו גבוה מספיק כדי למדוד באופן עקבי. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחון של סוכרת וכל מצב המושפע משינויים בתפקוד תאי הבטא בלבלב, מכיוון שהנשימה המיטוכונדריאלית היא מרכיב קריטי באופן שבו הפרשת אינסולין פועלת.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו, מה ההשפעה של תרכובות אלו על הפרשת אינסולין? למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד תאי בטא, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון שרירים, כבד, שומן וניתוחי נשימה מיטוכונדריאלים אחרים.