פרוטוקול עבור המעבדה דיור של טורקיז דגים גמבוזיים (Nothobranchius furzeri)

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לגדל בהצלחה מושבת מעבדה של דגי קיליפיש בצבע טורקיז כדי לחקור הזדקנות ומחלות הקשורות לגיל בצורה מהירה ותפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההזדקנות, כגון האם מוטציות בגן בודד או התערבויות סביבתיות יכולות לווסת את תהליך ההזדקנות במינים של בעלי חוליות. היתרון העיקרי של השיטה הזו הוא שעל ידי ביצוע הפרוטוקולים הבסיסיים שלנו, מספר מעבדות יכולות כעת לבצע ניסויים באמצעות דגי קיליפיש בצבע טורקיז.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שלגידול דגי קילי יש כמה מאפיינים ייחודיים. לדוגמה, עוברים גדלים על מצע יבש לפני הבקיעה, השונה מאוד מדגמי דגים קנוניים כמו דג הזברה. כדי להתחיל, הקימו מיכלי רבייה של 9.5 ליטר כל אחד עם זכר בן חמישה שבועות ושתי נקבות בנות שישה עד שבעה שבועות.

לאחר מכן מלאו מיכל פלסטיק בחול חיטוי בעומק של כ-2-3 סנטימטרים והניחו את ארגז החול במרכז מיכל הרבייה. אפשר לדג הטורקיז להתרבות ברציפות ולקצור עוברים פעם בשבוע לדגירת העוברים. כדי לקצור עוברים בשלב תא אחד לשימוש להזרקה ויצירת קווים טרנסגניים, הקימו מיכל רבייה עם דג זכר אחד ושתי נקבות כפי שהודגם זה עתה.

יומיים לפני איסוף העוברים, העבירו את הזכר למיכל בודד ושמרו אותו בקשר חזותי עם הנקבות הבוגרות. ביום האיסוף, הוסיפו את הזכר וארגז חול למיכל הרבייה ותנו לדגים להשריץ במשך שעתיים. לאחר ההטלה והוצאת ארגז החול מהמיכל, רוקנו את ארגז החול למסננת והשתמשו במי מערכת כדי לשטוף אותו.

לאחר מכן טבלו חלקית את המסננת במי המערכת וסובבו אותה בעדינות כך שהעוברים יתקבצו יחד במרכז. בעזרת פיפטה פסטר של שני מיליליטר, אספו את העוברים והעבירו אותם לצלחת פטרי של 90 מילימטר עם כ-40 מיליליטר מי מערכת. תחת מיקרוסקופ אור, בדוק את העוברים בצלחת הפטרי והסר את אלה המציגים קרע בכוריון וסימני נזק.

לאחר הלבנת העוברים על פי פרוטוקול הטקסט, בדוק והסר את כל העוברים המתים שהיו מוכתמים בכחול. לאחר שהעוברים הורשו לדגור בתמיסת מתילן כחולה טרייה, בדוק שלעוברים המפותחים יש עיניים שחורות גלויות. לאחר מכן בעזרת פיפטה חד פעמית של פסטר או פינצטה מעוקלת עדינה, העבירו עוברים על צלחת נייר פילטר.

שמור על כל העוברים הלא מפותחים במתילן כחול ופקח עליהם מדי יום. לאחר התפתחות עיניים שחורות, העבירו אותן למדיום מצע מוצק. בעזרת מלקחיים יש לפזר את העוברים במרחק של כחמישה מילימטרים זה מזה עד 100 עוברים לכל צלחת של 90 מילימטר.

לאחר מכן השתמש בפרפין כדי לאטום את המנה ולדגור על העוברים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך שבועיים-שלושה עד שהם פיתחו קשתית זהובה מלאה ומוכנים לבקיעה. לאחסון לטווח ארוך עד שנה, לאחר הדגירה בתמיסת מתילן כחולה למשך שלושה ימים, העבירו את העוברים על צלחות בינוניות עם מצע מוצק כפי שהודגם זה עתה ודגרו אותם בטמפרטורה של 17 מעלות צלזיוס. כדי לבקוע את הדגים, השתמשו בפינצטה מעוקלת עדינה כדי להעביר בזהירות 50 עד 100 עוברים מפותחים לתוך קופסת הבקיעה ולטבול אותם במלואם בתמיסת חומצה הומית בעומק של לא יותר משני סנטימטרים בארבע מעלות צלזיוס.

שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא בקיעת עוברי דג קיליפי, המושגת על ידי העברת עוברים שהודגרו על מצע יבש לתמיסת בקיעה המכילה חומצה הומית המסופקת עם אוורור מספק. מכסים את קופסת הבקיעה במכסה ומדגרים אותה בחום של 28 מעלות צלזיוס בחממת בקיעה. כדי לספק אוורור מספיק, חבר את התיבה לאספקת אוויר עם צינורות.

כדי לשמור על איכות מים נאותה בתיבת הבקיעה, פעם ביום מהיום שלאחר הבקיעה, יש לחדש את הקופסה ביחס אחד לאחד של מי מערכת חיטוי תוך שמירה על עומק סופי של שני סנטימטרים. העבירו את כל העוברים שלא בקעו בחזרה למצע המוצק ונסו לבקוע שבוע לאחר מכן. כדי לגדל דגים צעירים ובוגרים חמישה ימים לאחר הבקיעה, העבירו את הצעירים למערכת מחזור המים באמצעות פיפטות פלסטיק חד פעמיות או כף פלסטיק כדי להעביר בזהירות חמישה צעירים לכל מיכל של 0.8 ליטר המצויד ברשת טיגון של 400 מיקרומטר.

בגיל 14 יום מעבירים דגים צעירים למיכל 2.8 ליטר המצויד במסך טיגון של 850 מיקרומטר. מנקודה זו ואילך, סמן כל מיכל עם מזהה דג.למבחני הישרדות, אחסן בנפרד כל דג במיכל יחיד. דגים שגודלו לבדיקות הישרדות שוכנים גם בנפרד במיכל של 2.8 ליטר.

במשך שבעת הימים הבאים, האכילו את הצעירים פעמיים ביום בחמישה מיליליטר של שרימפס מלח בתוספת אחת עד שלוש תולעי דם חיות. בגיל ארבעה שבועות, האכילו כל דג פעמיים ביום בשרימפס מלח ובמיליליטר אחד של תולעי דם. בשלב זה, ודא שהדג מגיע להתבגרות מינית מלאה על ידי בדיקת נוכחות של סנפירי גב, פי הטבעת והזנב גדולים עם סימני צבע אצל הזכרים ובטן עגולה מלאה בביצים אצל נקבות.

מוצגת כאן עקומת הישרדות מייצגת עבור 70 דגי קיליפיש טורקיז זכרים. גידול נכון מביא להישרדות חציונית הנעה בין 12 ל-28 שבועות בזן GRZ. שינויים בהישרדות החציונית תלויים בתזונה, בתדירות ההאכלה ובתנאי טמפרטורת הדיור.

עקומת ההישרדות של דגים שגדלו תחת גידול לקוי מגלה עלייה בתמותה מוקדמת וירידות פתאומיות חוזרות ונשנות בהישרדות לאורך זמן בהשוואה לדגים שגדלו בתנאי גידול אופטימליים. תוך כדי ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לעקוב מקרוב אחר מצב המים ועודפי מזון מדגיגים טריים שבקעו מכיוון שחיוני שהם יישמרו בסביבה נקייה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור מניפולציות ניסיוניות בדג טורקיז כולל טרנסגנזה, עריכת גנום ומניפולציות תזונתיות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לגדל בהצלחה דגי קיליפיש בצבע טורקיז במעבדה, ולהשתמש במודל זה כדי לחקור את הביולוגיה של ההזדקנות בבעלי החוליות הקצרים ביותר שניתן לגדל בשבי.