שיטה פשוטה ויעילה In Vivo מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב באמצעות הזרקת Intramyocardial בעכברים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג מניפולציה גנטית ספציפית ללב in vivo, על ידי הזרקת אדנו-וירוס תוך-שריר הלב בעכברים בוגרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר הקרדיווסקולרי על המנגנונים המולקולריים וליישר את הפגיעה הלבבית, ואת היעילות של ריפוי גנטי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא נקייה מאוורור, שהעכברים מתאוששים במהירות מהניתוח ושהיא ניתנת לשחזור וקלה לביצוע.

אז עכשיו, בואו נתחיל. ביום ההליך, יש לחמם את תמיסת וקטור האדנווירוס המטוהר מ-80 מעלות צלזיוס שליליות, אחסון על קרח. כאשר נגיף האדנווירוס הפשיר, לבש מסכת פנים, חלוק סטרילי וכפפות סטריליות.

ורססו את צינור האדנווירוס באתנול 75%. העבירו את הנגיף למכסה זרימה למינרי סטרילי, ושאבו 50 מיקרוליטר מתמיסת הנגיף למזרק המילטון מעוקר בנפח 50 מיקרוליטר. חבר מחט בגודל 30 למזרק.

סובב את המזרק למצב זקוף. לחץ בעדינות על הבוכנה, עד שטיפת תמיסה נראית בקצה המחט, כדי למלא את קצה המחט בווירוס. לאחר מכן, שאפו בזהירות עוד 30 מיקרוליטר של תמיסת אדנו-וירוס לתוך המזרק, והניחו את המזרק על קרח.

כדי להזריק את האדנווירוס ללב עכבר, יש לאשר את רמת ההרגעה המתאימה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן, ולמרוח משחה על עיני החיה. לגלח את החזה העליון והבטן של החיה. מרחו קרם הסרת שיער מסחרי על העור החשוף.

השתמש בגזה רטובה כדי להסיר את הקרם ואת כל השיער שנותר לאחר דקה אחת. בעזרת שלושה קרצוף אנטיספטי על בסיס יוד כלורהקסידין, סטרילי את הצד השמאלי התחתון של החזה. לאחר מכן, כסו את החיה בווילון כירורגי, עם חור שנחתך מעל אזור הניתוח, ולבשו זוג כפפות סטריליות חדשות.

לאחר מכן, באמצעות טכניקה ומכשירים סטריליים, בצע חתך עור של 0.5 סנטימטר מהקסיפואיד לבית השחי, והשתמש במלקחיים ובהמוסטט מיקרו מוסקיטו כדי לנתח בצורה בוטה את שרירי החזה הגדולים והקטנים. החזר את שרירי החזה העיקריים והקטנים כדי לחשוף את החלל הבין-צלעי. והשתמש בהמוסטט המיקרו מוסקיטו כדי לחדור ולפתוח את החלל הבין-צלעי הרביעי.

לחץ בעדינות על הצד הימני של דופן בית החזה עם האצבע המורה של היד הלא דומיננטית כדי להזיז את הלב לכיוון החתך. לאחר מכן אבטח בזהירות את הלב המוחצן עם האצבע המורה והאגודל של אותה יד, והשתמש ביד הדומיננטית כדי להזריק 10 מיקרוליטר של תמיסת אדנו-וירוס לשריר הלב של כל דפנות הגחון, הגב והרוחב של החדר השמאלי. לאחר הזריקה האחרונה, החזירו מיד את הלב לחלל התוך-חזה.

ולחץ בעדינות על דופן בית החזה לכיוון מקום החתך, כדי לפנות ידנית כל אוויר מהחלל התוך-חזה. סגור את העור עם תפר משי של חמישה אוט, בתבנית מזרן אופקית, והנח את העכבר על כרית חום של 37 מעלות צלזיוס עם ניטור עד להתאוששות מלאה. לאחר מכן, עקרו את מזרק המילטון המשומש ומחט 30 מד במעקר בטמפרטורה גבוהה ובלחץ גבוה, והשליכו את המחט המעוקרת במיכל חד מתאים.

חמישה ימים לאחר הזרקה תוך-קרדיוקרדיאלית של אדנו-וירוס הסוגר על לוציפראז, הדמיה in vivo מצביעה על ביטוי יתר חזק של לוציפראז, במיוחד בלב, שניתן לאשר על ידי ניתוח כתמים מערביים, מה שמרמז על היעדר התמרה של איברים שאינם מטרה. ניתוח כתמים מערביים מצביע גם על עלייה משמעותית בביטוי קולטני ויטמין D. והחדר השמאלי של עכברים שהוזרקו להם אדנו-וירוס המקודד לקולטן ויטמין D.

עם ביטוי מופחת של הקולטן הניכר בבעלי חיים שהוזרקו להם אדנו-וירוס המקודד סיכת שיער קצרה המכוונת לקולטן RNA ויטמין D. לעומת זאת, ביטוי קולטני ויטמין D אינו משתנה באופן משמעותי בחדר הימני של אף אחד מבעלי החיים שהוזרקו לחדר השמאלי. לאחר שליטה, ניתן לסיים שיטה זו תוך שתי דקות, אם היא מבוצעת כראוי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון הזרקת תאי לב כדי לענות על שאלות נוספות, כגון היעילות של טיפולים תאיים ספציפיים באוטם שריר הלב.