הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי
6 במרץ 2018
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים קבוע
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא ליצור את תנאי הניסוי האופטימליים מהכנת הדגימה ועד לרכישת ושחזור תמונה על מנת לבצע הדמיית D-STORM דו-ממדית דו-ממדית של מיקרו-צינורות וחוטי ביניים בתאים קבועים. שיטה זו יכולה לעזור לאפיין את האינטראקציות הפיזיקליות בין רשתות שלד ציטו צפופות ומורכבות כגון חוטי ביניים ומיקרו-צינורות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת התבוננות במבנים תאיים, שאינם נפתרים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהבקרה על הכנת הדגימה ורכישת נתוני קישור החלוקים היא חיונית על מנת להגביל את יצירת החפצים. לאחר גידול תאי U373 על פי פרוטוקול הטקסט, תקן את התאים על ידי שימוש תחילה ב-PBS כדי לשטוף אותם פעם אחת. לאחר מכן, הסר את ה-PBS והוסף מיליליטר אחד לבאר של תמיסת קיבוע מיצוי שחוממה מראש.
דגרו על התאים בטמפרטורת החדר למשך 60 שניות. לאחר מכן הסר את התמיסה והוסף מיליליטר אחד לבאר של 4% PFA טרי שהוכן וחומם מראש מדולל במאגר שלד התא. מניחים את צלחת 12 הבארות בחזרה לחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
לאחר מכן הסר את ה- PFA והוסף שלושה מיליליטר PBS לבאר. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן הסר את ה-PBS והוסף 10 מילי-טוחנות טריות נתרן בורוהידריד מדולל ב-PBS על מנת להרוות את האוטו-פלואורסצנטי מהגלוטראלדהיד.
דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך שבע דקות והעבירו את הנתרן בורוהידריד הממוחזר לפח ספציפי. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הבארות שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת. לאחר מכן הסר את ה-PSB והוסף 5%BSA ב-PBS כפתרון חסימה.
לאחר צביעה חיסונית של דגימות והכנת תמיסות במאגרים על פי פרוטוקול הטקסט, הרכיב את הכיסוי המכיל את התאים המסומנים על מחזיק דגימה מגנטית. והוסף את מאגר ההדמיה כדי למלא לחלוטין את החדר. החל את המכסה וודא שאין בועות אוויר בין מאגר ההדמיה למכסה.
בעזרת אתנול מוחלט, נקו את תחתית הדגימה וודאו שאין נזילות. לאחר מכן, במידת הצורך, השתמש בגריז כדי לאטום כראוי את אחיזת הדגימה. כדי לבצע הדמיה, הפעל את המיקרוסקופ ואת תוכנת הרכישה.
הגדר את פרמטרי הרכישה בהתאם לפרוטוקול הטקסט, תוך שימוש במטרת NA 1.46 פי 100, עדשת Optivar פי 1.6 ומצב TIRF UHP. צור רצועה 647 כדי לדמות את חוטי הווימנטין המסומנים ב-Alexa Fluor 647. בחר את קווי הלייזר 405 ו-642 ננומטר ואת מסנן הפליטה LP 655.
לאחר מכן, צור רצועה 555 כדי לדמות את המיקרו-צינורות המסומנים ב-Alexa Fluor 555. בחר את קווי הלייזר 561, 488 ו-405 ננומטר כדי לדמות את הפלואורופורים ואת מסנן הפליטה BP 570 עד 650. לאחר מכן, הוסף שמן למטרה והניח את הדגימה על העדשה.
לאחר מכן, בחר בלשונית האיתור ופתח את התריס של מנורת הקרינה. מצא את המוקד והשתמש בעינית כדי לחפש את התאים לתמונה. לאחר מכן השתמש בג'ויסטיק כדי למקם את התאים במרכז השדה.
לחץ על לשונית הרכישה כדי לחזור למצב רכישה. לאחר מכן בחר את מסלול 647 והגדר את עוצמת הלייזר 642 ל-0.2% ואת עוצמת הלייזר 405 לערכו המינימלי. הגדר את זמן החשיפה ל-50 אלפיות השנייה ואת הרווח ל-50.
לאחר מכן בחר במצב רכישה רציפה כדי להתבונן בתא על המסך. ודא שיש לפחות חרוז פלואורסצנטי אחד בשדה הראייה. השתמש במצב קנה מידה אוטומטי עבור התצוגה והתאם את המיקוד.
לאחר מכן, צלם תמונת אפיפלואורסצנציה בשדה רחב של רשת הווימנטין על ידי לחיצה על הצמד ושמור את התמונה. כדי לבדוק את תאורת TIRF, לחץ על TIRF, לחץ על רציף, התאם את פרמטרי הרכישה על מנת לקבל שדה תאורה הומוגני. לאחר מכן לחץ על הצמד ושמור את התמונה.
בדוק את מסלול 555. בטל את הסימון של מסלול 647 ובחר במסלול 555. צלם תמונה אפיפלואורסצנטית של רשת המיקרו-צינורות ושמור אותה.
לאחר מכן צלם תמונת TIRF ושמור אותה. כעת, בדוק את מסלול 647. בטל את הסימון של רצועת 555 ובחר את רצועת 647.
הגדר את הרווח לאפס ואת זמן החשיפה ל-10 אלפיות השנייה. לאחר מכן לחץ על רציף. הגדר את עוצמת הלייזר של 642 ננומטר ל-100% על מנת לשאוב את רוב צבעי Alexa 647 למצב כהה.
ברגע שהפלואורופורים מתחילים להבהב, הגדילו את החשיפה ל-15 אלפיות השנייה ואת הרווח ל-300. השתמש במצב מחוון הטווח כדי לוודא שאותות מולקולה בודדת אינם רווים את המצלמה כפי שמצוין על ידי הצבע האדום. במקרה כזה, הקטן את הרווח עד שהרוויה נעלמת.
החרוזים יישארו רוויים בתחילת הרכישה. לחץ על עצור כדי להפסיק את התצפית על התא. הרחב את כלי העיבוד המקוון ולחץ על עיבוד מקוון PALM כדי לדמיין את תמונת STORM במהלך הרכישה.
השתמשו בתשע לגודל השיא של המסכה ובשש לעוצמת שיא הרעש. כעת, לחץ על התחל רכישה. במהלך הרכישה, התמקד מחדש בתא במידת הצורך.
התאם את זמן החשיפה ובסופו של דבר הפעל את קו הלייזר של 405 ננומטר החל מ-0.001% כדי לשמור על צפיפות בינונית של פלואורופורים עם מרחק מינימלי של מיקרומטר אחד בין מולקולות בודדות. ודא ששיא דיוק הלוקליזציה בהיסטוגרמה מתחת לתמונה המשוחזרת מרוכז סביב או מתחת ל-10 ננומטר. לחץ על עצור כדי לסיים את הסרט כאשר הושגו יותר ממיליון לוקליזציות.
שמור את הנתונים הגולמיים מרכישת STORM בפורמט CZI. לאחר מכן, בכלי הערוצים, סמן את רצועה 555, בטל את הסימון של רצועה 647 ובחר רצועה 555. לאחר מכן, לחץ על כפתור הרציף.
הגדר את זמן החשיפה ל-30 אלפיות השנייה ואת הרווח לאפס. לאחר מכן הגדר את הלייזרים 488 ו-561 ל-100% כדי לשאוב צבעי Alexa 555 למצב הכהה. השתמש במצב תאורה HILO.
לאחר שהפלואורופורים מתרוקנים, לחץ על עצור. הגדר את הרווח ל-250 והקטין את הלייזר 488 ל-50%השתמש במחוון הטווח כדי לבדוק שמולקולות בודדות אינן מרוות את המצלמה. אם זה המקרה, הקטינו את הרווח.
כעת, לחץ על התחל רכישה. במהלך הרכישה, הגדל את הרווח בהדרגה כדי להגיע לגבול הרוויה. הגדל צעד אחר צעד את עוצמת הלייזר של 405 ננומטר כדי להפעיל את המולקולות ולהגיע לצפיפות בינונית בשדה הראייה.
הקטן את עוצמת הלייזר של 488 ננומטר ל-30% כאשר הלייזר 405 הוא כ-15%ואז הקטן בהדרגה את ה-488 תוך הגדלת עוצמת הלייזר 405 על מנת לשמור על הבהוב המולקולות מהר ככל האפשר ובצפיפות בינונית. קו הלייזר 488 יחד עם לייזר העירור 561 בעוצמה מקסימלית מגדיל את שיעורי ההפעלה והכיבוי של הפלואורופורים, בעוד שקו הלייזר 405 רק מגדיל את קצב ההפעלה. עצור את הרכישה כאשר הושגו 500,000 לוקליזציות או יותר או כאשר אין יותר מולקולות מהבהבות.
לאחר מכן שמור את הנתונים הגולמיים מרכישת STORM בפורמט CZI. כדי לבצע שחזור תמונה באמצעות הכלי PAL-Drift, בחר את סוג התיקון מבוסס הדגם עם מקטעים אוטומטיים בגודל מקסימלי של שמונה. לחץ על Apply מספר פעמים ברציפות עד לתיקון הסחף.
תיקון מבוסס מודל זה מיישם אלגוריתם המבוסס על ניתוח מתאם צולב, המתקן את הסחיפה. באמצעות כלי סינון PAL, שפר את המראה של תמונת STORM על ידי בחירת המולקולות שהיו ממוקמות בצורה הטובה ביותר. לדוגמה, הגבל את דיוק הלוקליזציה ל-30 ננומטר ואת ה-PSF ל-120 עד 180 ננומטר.
בעזרת הכלי PAL-Render, השתמש ברזולוציית פיקסלים של חמישה או 10 ננומטר ופרמטרים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. בחר רינדור טווח דינמי אוטומטי HR עם ערך של 95% ורינדור טווח דינמי אוטומטי SWF עם ערך של 90%. לאחר מכן בחר באיכות העיבוד הטובה ביותר.
בתפריט PALM של כרטיסיית העיבוד, בחר PALM convert. לחץ על בחירה ולאחר מכן החל. לבסוף, שמור את התמונה שנוצרה בפורמט LSM ולא CZI.
איור זה מציג דוגמה טיפוסית לתמונת D-STORM של חוטי וימנטין המסומנים במערכת החיסון עם Alexa 647. ניתן לראות בבירור את העלייה ברזולוציה בהשוואה לתמונה שנרכשה במיקרוסקופ סטנדרטי בעל שדה רחב. פרופילי עוצמת הקרינה המוצגים בגרף זה מראים כי הדמיית מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה מאפשרת רזולוציה של צרורות וימנטין.
רזולוציית D-STORM מספיקה כדי לספור את מספר החוטים הקיימים בצרורות. מוצגת כאן דוגמה טיפוסית להדמיית D-STORM בצבע כפול של רשתות וימנטין ומיקרו-צינורות עם תווית חיסונית עם Alexa 647 ו-Alexa 555, בהתאמה. תמונות וימנטין טובות צריכות לכלול לפחות 5,000 לוקליזציות למיקרומטר בריבוע ו-2,500 למיקרומטר בריבוע למיקרו-צינוריות.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים אם היא מתפקדת כראוי. תוך כדי ניסיון הליך זה, חשוב להתאים את שיטות הקיבוע והפרמטריזציה לחלבון שיצולם. לדוגמה, קיבוע עם גלוטרלדהיד בלבד נותן תוצאות גרועות עבור חוטי ביניים, אך הוא הטוב ביותר לקיבוע מיקרו-צינורות.
חשוב לזכור להשתמש בדגימות ובתמיסות טריות, במיוחד MEA, שיש להתאים בקפידה את ה-pH שלהן. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור את המורפולוגיה של מבנים תאיים ננוסקופיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הכנת דגימה, רכישת תמונות ושחזור של תמונות D-STORM דו-ממדיות בצבע כפול של חוטי ביניים ומיקרו-צינורות.
אל תשכח שעבודה עם פתרונות מסוימים, במיוחד PFA, NABH4 עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות, עבודה מתחת למכסה המנוע הכימי ושימוש בפחים ספציפיים בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מתודולוגיה זו שואפת לבסס תנאים ניסיוניים אופטימליים לדימויי dSTORM דו-ממדיים בשני צבעים של מיקרוטובוליים וסיבי ביניים בתאים מקובעים. היא משפרת את אפיון רשתות השלד התאי, שלעיתים קרובות אינן מובחנות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות דימות
רקע
- דימוי בשיטת D-STORM מספק ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של מבנים תאיים.
- מיקרוטובוליים וסיבי ביניים הם מרכיבים קריטיים של השלד התאי.
- ייתכן שמיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונבנציונלית לא תאפשר להבחין באינטראקציות מורכבות ברשתות אלו.
- הכנת הדגימות ורכישת הנתונים הן קריטיות לצמצום ארטיפקטים.
מטרת המחקר
- לאופטימיזציה של התנאים לצילום מיקרוטובוליים וסיבי ביניים.
- לשיפור ההבנה של אינטראקציות בשלד התא.
- למתן הדגמה חזותית של המתודולוגיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תאי U373 בהתאם לפרוטוקול מוגדר.
- שטיפת תאים עם PBS לפני קיבוע.
- שימוש בתמיסת קיבוע ומיצוי שחוממה מראש עבור קיבוע התאים.
- רכישת תמונות dSTORM לניתוח מבני השלד התאי.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של מיקרוטובוליים וסיבי ביניים.
- רזולוציה משופרת של מבנים תאיים בהשוואה לשיטות קונבנציונליות.
- שליטה מוכחת בהכנת הדגימות וברכישת נתונים.
- אפיון של אינטראקציות בתוך רשתות השלד התאי.
מסקנות
- המתודולוגיה מספקת גישה חזקה לחקר הדינמיקה של השלד התאי.
- היא מדגישה את החשיבות של הכנת דגימות קפדנית.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול חקר של מבנים תאיים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הדמיה של רשתות שלד תא דחוסות, כגון פילמנטים בינוניים ומיקרוטובוליים, היא קריטית להבנת תפקודים תאיים מתואמים במודלים של מחלות. הדמיית dSTORM בשני צבעים מספקת רזולוציה בננו-קנה מידה להדמיה של קשרים פיזיים בין רשתות אלו, ובכך מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית עבור מטרות המעורבות בבקרה על שלד התא. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות על ידי חשיפת תלות מבנית המשפיעה על ניידות תאית, קוטביות ותעבורה תוך-תאית — פנוטיפים מרכזיים במחקר של מחלות ניווניות של מערכת העצבים ומחלות סרטן.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של קשרים ישירים בין פילמנטים ביניים לבין מיקרוטובוליים ברזולוציה של <10 nm.
- ערך תפעולי: מספק נתונים כמותיים על צמידת פילמנטים וצפיפות רשת לתמיכה בתיקוף פונקציונלי של מטרה.
- ערך חיזוי: מבהיר קשרים מכניסטיים בין מרכיבי השלד התאי, ובכך מפחית עמימות בפרשנות של מסלולים במהלך בחירת מטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתוני דימוי סטנדרטיים ברזולוציה גבוהה המתאימים לבחינת ביצועים (benchmarking) של בדיקות בסריקות של מודולטורים של השלד התאי.
- ערך תפעולי: מבסס פרוטוקולים הניתנים לשחזור לרכישה ושחזור של dSTORM דו-צבעי, מה שמאפשר עקביות בין מעבדות שונות.
- סקילביליות: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני קווי תאים ומטרות חלבוניות שונות, כאשר תנאי הקיבוע והסימון מותאמים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין ארגון השלד התאי בקנה מידה ננומטרי לבין פנוטיפים תאיים הרלוונטיים למודלים של מחלות, כגון אקטיבציה של תאי גליה או שלמות נוירונלית.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהירה כיצד סיבי ביניים מסוג vimentin משמשים כתבנית ומייצבים את ארגון המיקרוטובוליים, ובכך מספקת מידע למודלים חיזויים של פגמים בתעבורה וסיקולרית.
- רלוונטיות למודל פרה-קליני: משתמשת בתאי גליה מסוג U373 — מערכת הרלוונטית למחלה לצורך חקר נוירו-דלקת והתקדמות גליומה.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), כאשר השלמות של השלד התאי משמשת כקריאה פנוטיפית להשפעות של תרכובות על מבנה ותפקוד התא.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבחינת השערות על ידי קביעה האם תרכובות משבשות או מייצבות את הארגון המשותף של פילמנטים ביניים ומיקרוטובוליים.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של הבדיקה באמצעות פלטיים מדידים כגון צפיפות לוקליזציה (>5,000/µm² עבור vimentin, >2,500/µm² עבור מיקרוטובוליים) ורזולוציית צרורים.
- אנליטיקה: מספקת מדידות מדויקות של המרווחים בין הפילמנטים ושל קו-לוקליזציה, מה שמאפשר לצוותים להשוות פנוטיפים מבניים בין תנאים שונים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין דימוי בננו-קנה מידה לתהליכים תלויים-מיקרוטובוליים כגון תעתוע וסיעור של וסיקולות, דבר הרלוונטי לפיתוח טיפולים נוירולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת דימוי ברזולוציה-על ניתנת לשימוש חוזר ללימוד של כל זוג חלבונים בשלד התא כאשר הם מסומנים בפלואורופורים תואמים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במסיבות התיקוף של המטרה על ידי פתרון אינטראקציות של השלד התאי בקנה מידה ננומטרי שאינן נראות במיקרוסקופיה קונבנציונלית.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה באמצעות פרמטרי רכישה קבועים (למשל, לייזר 642 nm ב-0.2% להפעלה, 100% לדילול) וספי שחזור (דיוק לוקליזציה <10 nm).
- ערך אסטרטגי: מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של הפרות בוויסות השלד התאי במודלים פרה-קליניים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בקבלת החלטות קידום מותאמות סיכונים על ידי אספקת ראיות מבניות למעורבות של המטרה במסלולים של השלד התאי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיית רזולוציה-על (super-resolution), בצביעה אימונוהיסטוכימית ובכיול אופטי של TIRF/HILO.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל עדשה אובייקטיבית 100x NA 1.46, עדשת Optivar וקווי לייזר ב-405, 488, 561 ו-642 nm.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי קיבוע (למשל, ריכוז PFA, השבתה באמצעות sodium borohydride) כדי למזער אוטופלורסצנציה ולשמור על שלמות האפיטופים.
- דורש התאמה של צפיפות הסימון ועוצמת הלייזר בעת התמקדות בחלבונים שונים, כפי שמוצג בהגדרות השונות עבור Alexa 647 לעומת Alexa 555.
- מוגבל בשל הצורך בתמיסות שהוכנו טרי ומבקרות סביבתיות קפדניות למניעת סחיפה (drift) ולהבטחת התנהגות הבהוב (blinking) של מולקולה בודדת.
