Name: הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: למדו הדמיה ברזולוציה גבוהה של מיקרוטובולים וחוטים ביניים בתאים קבועים באמצעות מיקרוסקופ dSTORM דו-צבעי דו-ממדי. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות ברשתות הציטוסקלטון ברמה הננומטרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים מיכאל Lelek, Orestis Faklaris, ניקולס Bourg לדיון פורה, אנדריי Aristov, אלנה Rensen לעזרה עם טכניקה סופר רזולוציה, דני Seetharaman עבור קריאה זהירה של כתב היד. אנו להכיר בהכרת תודה UtechS BioImaging פוטוני (Imagopole) Citech של מכון פסטר (פריז, צרפת), כמו גם את רשת תשתית צרפת-BioImaging הנתמכים על ידי הסוכנות מחקר לאומי צרפתי (ANR-10-INSB-04; השקעות לעתיד), ולא את Région ile-de-(תוכנית Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) לשימוש של המיקרוסקופ Elyra. עבודה זו נתמכה על ידי הסרטן le ליגה חדר מרווח וחדיש, הסוכנות מחקר לאומי צרפתי (ANR-16-CE13-0019).

<ol><li>Herrmann, H., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+Filaments%3A+Structure+and+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Intermediate Filaments: Structure and Assembly.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).</li>
<li>Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+crosstalk%3A+when+three+different+personalities+team+up%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).</li>
<li>Leduc, C., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+filaments+in+cell+migration+and+invasion%3A+the+unusual+suspects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li>
<li>Gevaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nobel+Prize+in+Chemistry%3A+seeing+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale.</a> Nat Nanotechnol. 9 (11), 878(2014).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+samples+for+optimizing+STORM+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Dempsey, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+localization-based+super-resolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+neuronal+microtubule+organization+and+microtubule-associated+proteins+using+single+molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy.</a> Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).</li>
<li>Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+buffers+for+3D+STORM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Simple buffers for 3D STORM microscopy.</a> Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).</li>
<li>Eliasson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+filament+protein+partnership+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intermediate filament protein partnership in astrocytes.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).</li>
<li>Leduc, C., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+microtubule-associated+motors+drives+intermediate+filament+network+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization.</a> J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).</li>
<li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+Intermediate+Filaments+Template+Microtubule+Networks+to+Enhance+Persistence+in+Cell+Polarity+and+Directed+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration.</a> Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).</li>
<li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-Orientation%3A+Quantifying+Simultaneous+Co-Localization+and+Orientational+Alignment+of+Filaments+in+Light+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy.</a> PLoS One. 10 (7), e0131756(2015).</li>
<li>Yang, Z., Wang, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein%3A+from+intermediate+filament+assembly+and+gliosis+to+neurobiomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker.</a> Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).</li>
<li>Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symptomatic+spinal+metastases+of+intracranial+glioblastoma%3A+clinical+characteristics+and+pathomechanism+relating+to+GFAP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression.</a> J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).</li>
<li>Hol, E. M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein+%28GFAP%29+and+the+astrocyte+intermediate+filament+system+in+diseases+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).</li>
<li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytoma+grade+IV+%28glioblastoma+multiforme%29+displays+3+subtypes+with+unique+expression+profiles+of+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5, 7924(2015).</li>
<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+3D-STORM+imaging+through+improved+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers.</a> PLoS One. 8 (7), e69004(2013).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nat Commun. 6, 7933(2015).</li>
<li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+image+resolution+in+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring image resolution in optical nanoscopy.</a> Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nprot.2017.024">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

שלבים קריטיים בפרוטוקול
אנו מציגים כאן פרוטוקול אשר ממזערת חפצים של תמונות dSTORM של microtubules, IFs גלייה. חפצים יכולים להיווצר בכל צעד של הכנת הדוגמא, הדמיה: יציבות, חסימת, immunolabeling, להיסחף במהלך הרכישה, בלתי אופטימאליים מהבהב תנאים23. אנחנו ברשימה להלן השלבים הקריטיים ביותר.
ניקוי על coverslips היא צעד חשוב להגביל את הכריכה לא ספציפית של fluorophores על פני השטח, ולכן כדי להגביל את רעשי הרקע בתמונה dSTORM.
<p c...

Cytoplasmic ביניים (IFs) זיריהם nm 10-קוטר הומו - או heteropolymers של קבוצת תאים סוג משנה ספציפית של אם חלבונים. IFs להשתתף מגוון רחב של פונקציות הסלולר כגון תגובות תנועתיות, התפשטות, מתח התא. תפקידם מפתח מודגשת על ידי העובדה כי מחלות אנושיות יותר מ-90 נגרמות ישירות על ידי מוטציות בחלבונים אם; למשל, שינויים בהרכב אם מלווה בצמיחה הגידול והפצת1,2,3. שם גדל ראיות שלוש מערכות שלד התא לעבוד בשיתוף פעולה כדי הפונקציות הסלולר כגון תא קיטוב, מחלקת ההגירה2,3. מאז יש זוג חזק בין אדריכלות מרחבי פונקציות, זה הכרחי לקבל תובנות בארגון המבני של IF זיריהם אחרים ולהבין טוב יותר את cytoskeletal צולבות לדבר. מאמר זה מספק פרוטוקול לבצע את dSTORM כפול-צבע (ישיר סטוכסטי אופטי שחזור מיקרוסקופ) טכניקה רזולוציה סופר4 , איך זה משמש כדי לחקור את האינטראקציה בין אם ו microtubules, קבוע, תרבותי תאים ובדו מימד (2D).
פותחו מספר שיטות זיהוי סופר האחרונות בעשור התגליות שם היו על המקור של פרס נובל לכימיה בשנת 20145. בין כל שיטות אלה שקרים השיטות מבוססות על לוקליזציה מולקולה בודדת כמו פאלם6 (Photo-Activated לוקליזציה מיקרוסקופ) העושה שימוש photoswitchable פלורסנט חלבונים, סופה7 עם זוגות של fluorophores או dSTORM4 עם fluorophores קונבנציונלי. כל שיטות אלה מבוססות על אותו עיקרון אשר מורכב (i) הבורר של רוב הכתבים פלורסנט למצב "כבוי" "(הלא-פלורסנט), (ii) ההפעלה סטוכסטי של קבוצת משנה של אותם לתוך פלורסנט המדינה כדי להתאים לשפה שלהם מיקום מרחבי עם דיוק ננומטר, וכן (iii) החזרה על התהליך הזה על מנת להפעיל כמה שיותר קבוצות משנה של fluorophores ככל האפשר. תמונה סופית הוא שיחזר באמצעות כל הגרסא המקומית של מולקולות מופעל, מתן החלטה לרוחב ל ~ 20-40 ננומטר. מספר מערכות אופטיות ממוסחר ומאפשר דקל/סופה זמינים כעת עבור ביולוגים לניסויים שגרתית. . מערכת אחת כזאת שימשה ללמוד איגוד מבניים microtubules, IFs. בין כל מולקולה בודדת המבוסס על לוקליזציה השיטות, הטכניקה dSTORM כפול-צבע נבחר, כי זה גם מתאים להתבונן אזורים מחליפי דק מאוד (< 1 מיקרומטר) של תאים חסיד יכולה לספק שיפור משמעותי של רזולוציית תמונה השקעה מינימלית של זמן וכסף. אכן, dSTORM היא טכניקה צדדי ונוח מאוד תואם תקן צבעים אורגניים בשימוש שגרתי עבור צביעת סלולרית ו- immunofluorescence.
בעוד תמונות dSTORM צבע אחד הם פשוטים יחסית להשיג באמצעות fluorophore את, Alexa6478, dSTORM צבע כפול דורש כדי למטב את תנאי הניסוי כך שני צבעי יכולה למצמץ כראוי במאגר שבחרת, במיוחד כאשר יש מוגבלת עוצמת הלייזר. ניירות מעולה כבר זמינים על שיטות כדי להגדיר צבע רב הדמיה עם dSTORM9,10,11,12,13, הניירות האלה להסביר בפירוט את מקורות אפשריים רזולוציית תמונה מפורק והאיורים וכן כיצד להתגבר עליהם. מאמר זה, התנאים ניסיוני אופטימלית קיבוע תאים, immunostaining, הכנת הדוגמא, הדמיה רכישה ושחזור תמונות מתוארות על מנת לרכוש תמונות של רשתות צפופות אם cytoplasmic microtubules ב גלייה עם dSTORM צבע כפול. בקצרה, שיטת החילוץ/קיבוע המתוארים Chazeau ואח12 היה מותאם גלייה ומשמש בצעד קיבוע שאחרי, ריכוז נוגדנים ממוטבת, מאגר סערה עם 10 מ מ MEA שמתואר דמפסי9 ואח שהיה מצא אופטימלי כדי להפוך את ניסיוני להגדיר סוג הדגימה.
גלייה אקספרס בעיקר שלושה סוגים של חלבונים אם: vimentin, nestin ו- GFAP (חלבון fibrillary חומצי גליה). חלבונים אלה שלושה הראו להם במשותף פולימריזציה האסטרוציטים14. הראנו קודם לכן באמצעות רזולוציה סופר מובנה תאורה מיקרוסקופ (SR SIM) כי ניתן למצוא חלבונים אם שלושת אלה באותה נימה אם יחיד, כי הם מציגים את דומה הפצה ודינמיקה תאי גליה 15. בשל הדמיון בין החלבונים אם שלוש, vimentin מכתים שימש ככתב עבור הרשת אם כל. שימוש dSTORM, הצלחנו לפתור כמה צרורות אם טופס לאורך microtubules, דבר שלא היה אפשרי עם עקיפה מוגבלת מיקרוסקופ טכניקות15. תצפיות אלה עשוי לעזור כדי להבין איך vimentin IFs תבנית microtubules ולווסת את מסלול הצמיחה שלהם, לקידום שמירה על ציר קוטביות במהלך ההעברה תא16. תמונות ברזולוציה סופר סיפק מידע מפתח האינטראקציה הדדית של שתי תת-מערכות cytoskeletal, והביא תובנה הקישור בין האגודה מרחבי פונקציה מקומיים אשר יכול להיות הסלולרי-סוג ספציפי17. באופן כללי, ניתן להשתמש בצבעים dual dSTORM ללמוד crosstalk בין אלמנטים cytoskeletal או סוגים אחרים של organelles, ובלבד תנאים טובים immunostaining נגישים מבחינת צפיפות וספציפיות. טכניקה זו יהיה שימושי כדי לאפיין טוב יותר את השינויים שלד התא במהלך astrogliosis, ב גליובלסטומה, הגידול הנפוץ ביותר, ממאיר ביותר של מערכת העצבים המרכזית, איפה הביטוי של חלבונים אם שינו 18 ,19,20,21.

<table><tbody><tr><td>מדיה חיונית מינימלית (MEM)</td> <td>Gibco</td><td>41090-028</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>חומצת אמינו לא חיונית</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td>תרבית תאים 1/100e</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>תרבית תאים 1/100e</td></tr><tr><td>F&oelig; טל סרום בקר</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>תרבית תאים 1/10e</td></tr><tr><td>0,05% טריפסין-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Fischer Scientific</td><td>11540486</td> כיסוי <td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>18 מ"מ n&deg; 1,5H</td><td>Marienfield/Dominic dutsher</td><td>900556</td><td>כיסויים</td></tr><tr><td>תמיסת פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>סיגמא</td><td>F8775</td><td>קיבוע תאים</td></tr><tr><td>גלוטראלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>G5882</td><td>קיבוע תאים</td></tr><tr><td>טריטון X100</td><td>סיגמא</td><td>T9284</td><td>חומר פעילי שטח לא יוני. משמש לקיבוע תאים</td></tr><tr><td>נתרן בורוהידריד (NaBH4)</td> <td>Sigma</td><td>452904-25ML</td><td>קיבוע תאים</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>פסיבציה של דגימה 3% בנוגדנים PBS</td></tr><tr><td>חד שבטיים נגד וימנטין (V9) המיוצר בעכבר</td><td>Sigma</td><td>V6630</td><td>נוגדנים</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ראשוניים עכברוש אנטי אלפא טובולין Biorad MCA77Gנוגדן משני נגד עכברוש עיזים IgG (H+L), Alexa Fluor 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>10635923</td><td>נוגדנים משניים נוגדנים משניים</td></tr><tr><td>נגד עכבר חמור IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 647</td><td>Fisher Scientific</td><td>10226162</td><td>נוגדנים משניים</td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres, 0.1 ומיקרו; m, כחול/ירוק/כתום/אדום כהה</td><td>פישר מדעי</td><td>T7279</td><td>חרוזי פלורסנט</td></tr><tr><td>תא מגנטי Chamlide</td><td>מכשיר תא חי</td><td>CM-B18-1</td><td>מחזיק מדגם מגנטי, נפח מקסימלי 1,2 מ"ל</td></tr><tr><td>Cysteamine (MEA)</td> <td>Sigma</td><td>30070</td><td>עבור המאגר המהבהב</td></tr><tr><td>גלוקוז אוקסידאז מ-Aspergillus niger</td><td>Sigma</td><td>G0543</td><td>עבור המאגר המהבהב</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td></td><td>למאגר המהבהב</td></tr><tr><td>קטלאז מכבד בקר</td><td>סיגמא</td><td>C9322</td><td>למאגר המהבהב</td></tr><tr><td>טריס (טריזמה)</td> <td>סיגמא</td><td>T1503</td><td>למאגר המהבהב</td></tr><tr><td>מתלה כיסוי Wash-N-Dry</td><td>Sigma</td><td>Z688568</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>סרט פרפין</td></tr><tr><td>מנקה קולי</td><td>פישר מדעי</td><td>15-335-6</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>האריק פלזמה</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה חוטים ביניים microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

שלד התא, המורכב אקטין שמתרגם microtubules, חוטים ביניים (אם), ממלא תפקיד מרכזי בשליטה על צורת התא קוטביות, תנועתיות. הארגון של רשתות אקטין, microtubule נחקרה בהרחבה, אבל זה של IFs לא עדיין במלואו מאופיין. אם יש קוטר ממוצע של 10 ננומטר וטופס רשת חובק הציטופלסמה של התא. הם קשורים פיזית עם אקטין, microtubules דרך המנועים המולקולריים, cytoskeletal linkers. חזק זו בלב מנגנוני הרגולציה להבטיח ברגולציה מתואמת של שלוש הרשתות cytoskeletal הדרושים עבור רוב הפונקציות התא. לכן חשוב להמחיש IFs לבד וגם עם כל אחד cytoskeletal הרשתות האחרות. עם זאת, אם רשתות הן וצפופה רוב סוגי תאים, במיוחד בתאי גליה, מה שהופך את הרזולוציה שלה מאוד קשה להשיג עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה (לרוחב ברזולוציה של ~ 250 ננומטר). ישיר סטוכסטי אופטי שחזור מיקרוסקופ (dSTORM) היא טכניקה המאפשרת רווח רוחבי ברזולוציה של סדר גודל אחד. כאן, אנו מראים כי dSTORM הלטראלי הרזולוציה מספיקה לפתור הארגון צפופה של הרשתות אם ושל, בפרט, אם חבילות סביב microtubules. איגוד חזק כזה סביר להניח להשתתף בוויסות מתואמת של שתי רשתות אלה מאי, להסביר איך vimentin IFs תבנית לייצב את הארגון microtubule וכן יכולת להשפיע microtubule תלויים vesicular סחר. באופן כללי יותר, אנו מראים איך התצפית של שני רכיבים cytoskeletal בטכניקה בצבעים dual dSTORM מביאה תובנה חדשה שלהם אינטראקציה הדדית.

מיקרוסקופ מצויד עם 50 mW 405 ננומטר ו- 100 מגוואט 488, 561, 642 nm solid-state לייזרים, EMCCD 512 x 512 מצלמה, אלפא מתכננים Apo 100 X / 1.46 אובייקטיבית, הלהקה לעבור 570-650 / ארוך מסננים פליטה 655 שימשו את התוצאות נציג שיובאו להלן.
איור 1A נותן דוגמא של מולקולה צפיפות, אות לרעש יחס זה אמור לשמש במהלך ייבוא תמונות raw. תמונות באיכות טובה מתקבלים עם מינימום של ~ 1 מיקרומטר בין מולקולות שכנות. בתנאים ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים קבוע

הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא ליצור את תנאי הניסוי האופטימליים מהכנת הדגימה ועד לרכישת ושחזור תמונה על מנת לבצע הדמיית D-STORM דו-ממדית דו-ממדית של מיקרו-צינורות וחוטי ביניים בתאים קבועים. שיטה זו יכולה לעזור לאפיין את האינטראקציות הפיזיקליות בין רשתות שלד ציטו צפופות ומורכבות כגון חוטי ביניים ומיקרו-צינורות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת התבוננות במבנים תאיים, שאינם נפתרים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהבקרה על הכנת הדגימה ורכישת נתוני קישור החלוקים היא חיונית על מנת להגביל את יצירת החפצים. לאחר גידול תאי U373 על פי פרוטוקול הטקסט, תקן את התאים על ידי שימוש תחילה ב-PBS כדי לשטוף אותם פעם אחת. לאחר מכן, הסר את ה-PBS והוסף מיליליטר אחד לבאר של תמיסת קיבוע מיצוי שחוממה מראש.דגרו על התאים בטמפרטורת החדר למשך 60 שניות. לאחר מכן הסר את התמיסה והוסף מיליליטר אחד לבאר של 4% PFA טרי שהוכן וחומם מראש מדולל במאגר שלד התא. מניחים את צלחת 12 הבארות בחזרה לחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.לאחר מכן הסר את ה- PFA והוסף שלושה מיליליטר PBS לבאר. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן הסר את ה-PBS והוסף 10 מילי-טוחנות טריות נתרן בורוהידריד מדולל ב-PBS על מנת להרוות את האוטו-פלואורסצנטי מהגלוטראלדהיד.דגרו את הת

imaging-intermediate-filaments-microtubules-with-2-dimensional-direct

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופית במהירות גבוהה 3D לחיות תאי ניאון אור וטומוגרפיה קריו אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה הגומלת על ידי הדמיה דינמית, חלקיקי אינטראקציה עם תאי הלה מארחות הקטנים HIV-1.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

מידע מרחבי-זמני על חלבונים דינמיים בתוך תאים חיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה. סוג של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הנקראת מיקרוסקופ תאורה תלת-ממדי מהיר (f3D-SIM) חושף מידע ייחודי על טבעת Z הציטוקינטית בחיידקים: הן המראה דמוי החרוז והן הדינמיקה המהירה של FtsZ בתוך הטבעת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

אנו מציגים פרוטוקול עבור היישום של interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופי (iPALM), שיטה מיקרוסקופית 3 ממדי מולקולה בודדת לוקליזציה סופר רזולוציה, אל ההדמיה של שלד התא יקטין בתאי יונקים חסידים. גישה זו מאפשרת הדמיה מבוססת אור של תכונות מבניות ננו שאחרת נותרו לא פתורים על ידי מיקרוסקופיה אופטית-מוגבל עקיפה קונבנציונלית.

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

פרוטוקול זה הוא מדריך ליישום מיקרוסקופ הפרעות הפרעה על מיקרוסקופ מתקן פלואורסצנטית רגיל עבור תוויות ללא תווית, ניגודיות גבוהה, הדמיה במהירות גבוהה של microtubules באמצעות משטחי החוץ מבחנה assays.

יישום של מיקרוסקופ רפלקציה הפרעות עבור הדמיה ללא תווית, במהירות גבוהה של Microtubules

מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה גבוהה מבוססי שבב הוא גישה מקורית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומציעה יתרונות ביעילות ובתפוקה. כאן, הפרוטוקולים להכנת השבבים וההדמיה מוצגים עבור מיקרוסקופ TIRF ומיקרוסקופ ברזולוציה סופר מבוססי-לוקליזציה.

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

מיקרוסקופיה של שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) משמשת לעקיפת מגבלת עקיפה אופיינית של מיקרוסקופיית אור ולהציג אקסוזומים בסולם הננומטר. זה יכול להיות מועסק בשניים ושלושה ממדים כדי לאפיין אקסוזומים.

מיקרוסקופיה ישירה לשחזור אופטי סטוכאסטי של שלשלות חוץ-תאיות בשלושה ממדים

כאן, בדיקת שחזור במבחנה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF מוצגת כדי לכמת ולהשוות בו זמנית את הדינמיקה של שתי אוכלוסיות microtubule. שיטה מתוארת כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של חלבונים מרובים הקשורים microtubule הקשורים על חבילות microtubule מקושרים ו microtubules יחיד.

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

אנו מציגים פרוטוקול ליישום מיקרוסקופיה של השתקפות הפרעות ומיקרוסקופיה כוללת-פנימית-השתקפות-פלואורסצנטית להדמיה בו-זמנית של מיקרו-טובולים דינמיים וחלבונים הקשורים למיקרו-טובולים המסומנים באופן פלואורסצנטי.

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית (DDM) משלבת תכונות של פיזור אור דינמי ומיקרוסקופיה. כאן מוצג התהליך של שימוש ב- DDM כדי לאפיין רשתות שלד ציטוסקטון משוחזרות על ידי כימות הדינמיקה התת-מפוזרת והכלוב של חלקיקים ברשתות וימנטין והתנועה הבליסטית של מרוכבים פעילים המונעים על ידי מיוזין אקטין-מיקרוטובול.

כימות דינמיקת שלד ציטוסקלטון באמצעות מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לבנות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל מטרה אחת ויריעות אור ואת השימוש בו להדמיית רשתות שלד.

תכנון ובנייה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הניתן להתאמה אישית, חד-אובייקטיבי, עבור הדמיה של רשתות שלד ציטו-שלד

למדו הדמיה ברזולוציה גבוהה של מיקרוטובולים וחוטים ביניים בתאים קבועים באמצעות מיקרוסקופ dSTORM דו-צבעי דו-ממדי. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות ברשתות הציטוסקלטון ברמה הננומטרית.

הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

גלה סרטונים נוספים