שיפה Sap דגימה של כרוב napus עבור תלת-ממד-דף של חלבונים, קומפלקסים Ribonucleoprotein

המטרה הכוללת של הליך 3D-PAGE זה היא להפריד קומפלקסים של חלבון וריבונוקלאופרוטאין ממיץ Brassica napus ploem, יחד עם זיהוי חומצת הגרעין ורכיבי החלבון המתאימים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביוכימיה ובפיזיולוגיה של הצמח. לדוגמה, אתה יכול לנתח את הרכב מתחמי הפלום תחת לחץ.

היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שניתן לאסוף מיץ פלום טהור ולנתח בו זמנית חומצות גרעין, כמו גם רכיבי חלבון. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי חלבון חלבון, ואינטראקציות של חומצות גרעין חלבון בתוך מערכת הפלום של לפתית זרעי שמן, ניתן ליישם אותה גם על ניתוח פלואם של צמחים אחרים כמו קוקורביטים, תורמוסים ויוקה. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשניסינו לזהות שותפים לאינטראקציה של חלבון ורנ"א עבור חלבון פלואם ספציפי.

ראשית, יש לנקב את גבעול התפרחת של צמח B.napus בן שמונה שבועות מספר פעמים באמצעות מחט היפודרמית של 0.8 מילימטר. נקב כמה גבעולי תפרחת אחרים על אותו צמח וצמחים אחרים כדי להשיג מספיק מוהל פלום. נגב את הטיפה הראשונה מכל מקום פצוע עם נייר פילטר.

לאחר הסרת הטיפות הראשונות, השתמש בפיפטה כדי לאסוף את הטיפות הנותרות. והעבירו אותם לצינור תגובה חרוטי מקורר מראש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן אחסן את האקסודאט שנאסף במינוס 20 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת קירור נטולת קרח.

המשך לאסוף טיפות עד שלא נצפתה היווצרות טיפות נוספות, אך לא יותר משעה. לאחר מכן, הוסף את דגימת הפלום לרכז צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי שנחתך מ-10,000 דלטונים, והתרכז לכ-1/6 מהנפח ההתחלתי. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה המרוכזת בארבע מעלות צלזיוס ו-20,000 גרם למשך 15 דקות לפחות כדי להסיר חלקיקי אבק.

כדי לבצע PAGE מקורי כחול, הרכיבו את תא הג'ל. והוסיפו את מאגר הקתודה הכחול הכהה B לחצי, ושטפו את הבארות עם מאגר הקתודה. טען 20 עד 30 מיקרוגרם מדגימת החלבון המרוכזת לכל באר על ג'ל קורן מסחרי של Bis-Tris לפחות משולש.

מלאו את החדר במאגר קתודה ואנודה, והפעילו את הג'ל בארבע מעלות צלזיוס ו-150 וולט עד שהדגימה עוברת 1/3 מהג'ל, מה שלוקח 20 עד 30 דקות. השהה את ההפעלה החלפת מאגר קתודה כחול כהה B עם מאגר קתודה כחול בהיר B 1/10. הפעל מחדש את הריצה והמשך עד שהחלק הקדמי הכחול מתחיל לצאת מהג'ל, מה שלוקח 120 עד 180 דקות.

גזרו נתיב ג'ל שלם מהג'ל הכחול המקורי, ואז העבירו לקרום ניילון על ידי ספיגה חצי יבשה, וסמנו את גבולות הג'ל העליונים והתחתונים על הממברנה בעיפרון. לאחר הספיגה יש לשטוף את הממברנה במים שטופלו ב-DEPC ולהניח בין שתי חתיכות נייר סינון לייבוש. לאחר מכן, בצע קישור צולב UV של הממברנה המוכתמת באנרגיה מופעלת של 120,000 מיקרו ג'אול לסנטימטר בריבוע.

כעת, הכלאה מראש של הממברנה הצולבת UV עם שישה מיליליטר של מאגר הכלאה למשך 60 דקות ב-68 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה. הוסף לממברנה מיליליטר נוסף של מאגר הכלאה המכיל ארבעה מיקרוליטרים של בדיקות ביוטיניליות 3 ראשוניות. לאחר מכן, דגרו את הממברנה עם הגשושית למשך הלילה תוך קירור תנור ההיברידיזציה מ-68 עד 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, שטפו את הממברנה עם מאגר המכיל 2x SSC ו-0.1% SDS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר בדיקות קשורות באופן לא ספציפי. בצע את הזיהוי של בדיקות ביוטיניליות 3-prime על הממברנה עם מצומד סטרפטווידין HRP ולומינול כמצע פרוקסידאז חזרת, וכתוצאה מכך תגובה כימילומינסצנטית רגישה. הוצא רצועות בודדות מהג'ל הכחול המקורי.

שלב רצועות מדגימות הפועלות בנתיבים מקבילים בצינור תגובה חרוטי של 1.5 מיליליטר כדי להשיג ריכוז נוסף של חלבונים מורכבים. להכנת ג'ל אוריאה 12%Tris-Tricine, שפכו 10 מיליליטר תמיסת ג'ל A בין שתי צלחות זכוכית ושכבו באיזופרופנול. לאחר פילמור יש להסיר את האיזופרופנול, להוסיף שניים עד שלושה מיליליטר תמיסת ג'ל B לג'ל ולהכניס מסרק של 10 בארות.

לשיווי משקל של חתיכות הג'ל שנכרתו, הוסף מיליליטר אחד של מאגר דגימת SDS פי 2 לתוך צינור התגובה. לאחר דגירה של הדגימה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, יש לחמם בבלוק חימום בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך כדקה. לאחר מכן דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר מכן, ערמו מספר חתיכות ג'ל מאוזנות המייצגות את אותו קומפלקס בכיס ג'ל אחד. לאחר הרכבת תא הג'ל, בצע אלקטרופורזה באמצעות חוצצי אנודה וקתודה ב-150 וולט למשך 45 עד 60 דקות. בסיום, יש להוציא את כל נתיב הג'ל.

דגרו על נתיב הג'ל החתוך למשך 20 דקות במאגר חומצי. לאחר מכן, יש לאזן ב-125 מילי-מולרי Tris-HCL ב-pH 6.8 למשך 20 דקות נוספות. יוצקים תמיסת ג'ל מפרידה 15% SDS לפי lanely.

לאחר שהג'ל מתמצק, הסר את האיזופרופנול, הוסף שלושה מיליליטר של תמיסת ג'ל ערימה של 4% והכנס את המסרק המיוחד לג'ל IPG. לאחר ההתמצקות, העבירו את נתיב הג'ל המאוזן על ג'ל ה-SDS, וכסו את הג'ל ב-0.5% אגרוז במאגר ריצה 1x SDS בתוספת עקבות של ברומופנול כחול. לאחר הרכבת תא הג'ל, הפעל את הג'ל בחום של 150 וולט למשך 60 דקות.

בסיום, צבעו את הג'ל בתמיסת קומאסי קולואידית לניתוח ספקטרומטרי מסה לאחר מכן. לבסוף, נתח את כתמי החלבון הנראים באמצעות ספקטרומטריית זמן טיסה של יינון לייזר בעזרת מטריצה. תוצאה מייצגת המתקבלת מדגימת פלום טהורה מתוארת כאן.

דגימות פלום לא מזוהמות מראות פס גלוי לגיל תיורדוקסין, בעוד שלא נצפה אות ל-RuBisCO ולחלבון מעטפת האבקה. לפחות ארבע רצועות קומפלקס חלבונים עיקריות נראות לאחר BN PAGE של מוהל B.napus phloem. ריכוזים נמוכים מדי או גבוהים מדי של מוהל פלואם אינם מאפשרים הפרדה ברורה של הקומפלקסים.

הפרדה ברזולוציה גבוהה נצפית ב-3D PAGE בשל התנהגויות נדידת החלבונים השונות בג'ל האוריאה ו-SDS-PAGE. בדרך כלל, חלבונים השייכים לקומפלקס יחיד ייראו כקו אלכסוני על פני הג'ל. לחלבונים מעל קו זה יש הידרופוביות מוגברת, בעוד שחלבונים מתחת לקו הם הידרופיליים יותר.

כתמים צפוניים של BN מראים ש-tRNA ספציפי קיים רק בקומפלקס ספציפי אחד. ניתוח ספקטרומטרי מסה הראה כי קומפלקס זה מכיל בעיקר ליגאזות tRNA המאשרות את פעילות קשירת ה-tRNA שנמצאה על ידי הכתם הצפוני של BN. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ללבוש כפפות וחלוק מעבדה כדי למזער זיהום קרוטן שיפריע לניתוח ספקטרומטרי מסה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו זימוגרמות ובדיקות אנזימים עם מוהל פלום שנאסף על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו פעילות מורכבת ומחקרי עיכוב. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי הצמח לחקור קומפלקסים מרובי תת-יחידות בדגימות פלום ממיני צמחים שונים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד מיץ פלום מצמחי Brassica napus, וכיצד לבודד ולנתח קומפלקסים של חלבון חלבון וחומצות גרעין חלבון. אל תשכח שעבודה עם SDS, אקרילאמיד ו-TMET עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה מתחת למכסה המנוע עם כפפות ומעיל מעבדה בעת ביצוע הליך זה.