Name: שיפה Sap דגימה של כרוב napus עבור תלת-ממד-דף של חלבונים, קומפלקסים Ribonucleoprotein (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: למדו פרוטוקול לבידוד וניתוח קומפלקסים של חלבונים וריבונוקליאופרוטאינים ממוהל של Brassica napus. השיטה משלבת אלקטרופורזה בדף כחול עם שלבים דנטוריים לזיהוי רכיבי חלבון ו-RNA בו-זמנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ג'ניפר דיק, אורסולה Zarzenska על תמיכתם מדעי. עבודה זו מבחינה כלכלית נתמך על ידי הקריירה אינטגרציה מענק (CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734) על ידי הנציבות האירופית בתוך תוכנית המסגרת השביעית המענק LFF-GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung המבורג), המענק DFG (DFG KE 856_6-1) מוענק JK.

1. דגימה וצמחים הכנת מהצינורות של napus נולד ב- 4,8,20
<ol><li>לשימוש מהצינורות דגימה, להבינם 8 בת napus דרב צמחים הפריחה הראשונית רק את הצג כדי למנוע אבקה מציג.</li>
	<li>השתמש מחט תת-עורית (Ø מ מ 0.8) punctate התפרחת שאלה מספר פעמים. חזור על מספר גבעולים תפרחת אחרים ועל צמחים אחרים כדי להשיג מספיק מהצינורות (איור 2 א). הערה: עבור ניתוח מורכב, מומלץ להתחיל עם פחות 600 µL של מהצינורות. 4-5 צמחים תניב בין 200 ל 700 µL של מהצינורות.</li>
	<li>. תנגב את הטיפה הראשונה מן האתרים פצוע עם נייר סינון טיפות אלה בעיקר מכילים חומר מזוהם מאוד מן הפצועים הרקמה שמסביב, צריך להיות מושלך.</li>
	<li>לאסוף את הטיפות הבאות על ידי pipetting ולאחסן את תפליט שנאספו בשפופרת תגובה צוננת מראש mL 1.5 חרוט ב-20 ° C באמצעות מערכת קירור שהנהר.</li>
	<li>המשך איסוף עד אין צורה ירידה נוספת היא הנצפה, אך לא יותר מ- 1 h. הליך זה יכול לחזור אחרי יומיים ללא אובדן משמעותי של מהצינורות שנאספו. הערה: מהצינורות שנאספו יכול להשתמש בו מיד או המאוחסנים ב- 80 ° C לצורך ניתוח עתידי. לאחסון-80 ° C, הלם-להקפיא הצינור התגובה בחנקן נוזלי.</li>
	<li>לרכז את הדגימה שיפה כ 1/6th של אמצעי האחסון הראשונית באמצעות רכזים צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתך (MWCO) של 10,000 Daltons (Da). Centrifuge המדגם מרוכזת בשעה 4 ° C ו- g x 20,000 לפחות 15 דקות להסיר חלקיקי אבק. הערה: ריכוז sap שיפה לא להוביל לאובדן משמעותי של חלבונים.</li>
	<li>לניתוח מורכב עוקבות, להמשיך עם שלב 3.1.</li>
</ol>2. שיפה sap טוהר שליטה באמצעות רוורס טרנסקריפטאז PCR (RT-PCR) 4,8,20
<ol><li>לבודד RNA הכולל מ מהצינורות באמצעות שיטת החילוץ RNA סטנדרטי עבור חומר נוזלי (למשל TRIzol או פנול-כלורופורם החילוץ ואחריו אלכוהול איזופרופיל משקעים פאזה מימית, אתנול שטיפה צעדים על פי הפרוטוקול של היצרן). התראה: פנול-כלורופורם הוא רעיל. לעבוד תחת ברדס עם ציוד למיגון אישי המתאים. ניתן לאחסן את הרנ א שחולצו אתנול ב-80 מעלות צלזיוס עד שישה חודשים.</li>
	<li>להסיר זיהום של ה-DNA על ידי עיכול עם DNase אני (u 1/µg) למשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, בטל את האנזים על-ידי הוספת EDTA ריכוז הסופי של 5 מ מ, דגירה המדגם ב 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>כדי לקבל את ה-RNA טהור, לטהר ולרכז את הדגימה מאת צעד טיהור נוסף (למשל באמצעות ערכות ניקוי RNA, לפי הוראות היצרן).</li>
	<li>ביצוע של רוורס טרנסקריפטאז PCR (RT-PCR) של סינתזה של cDNA עם ערכת סינתזה cDNA באמצעות 150 ng של RNA טהור כפי שתואר על ידי היצרן של פרוטוקול. הערה: cDNA שניתן לאחסן ב-20 ° C עד שימוש נוסף.</li>
	<li>להשתמש µL 5 של cDNA כתבנית עבור ריאקציה PCR רגיל כפי שצוין על-ידי היצרן, להגביר את התמלילים תא ספציפי ולבדוק על-ידי agarose בג'ל. לאשר את הטוהר של דגימות שיפה באמצעות למשל תחל יחידת משנה קטנים rubisco, thioredoxin h של החלבון מעיל אבקה (איור 1b, טבלה 1).</li>
</ol>3. כחול מקורי דף 4,25,26,31
<ol><li>להשתמש או ג'לים מעבר צבע מקורי יציקת עצמית כמפורט במקומות אחרים27 או מסחרי Bis-טריס צבע ג'לים.</li>
	<li>עומס µg 20-30 של המדגם ופרוטאין מרוכז לכל טוב על גבי הג'ל לפחות triplicates.</li>
	<li>להפעיל את הג'ל 4 ° C ו 150 V באמצעות מאגר קטודית כחול כהה B ומאגר אנודת (טבלה 2) עד המדגם 1/3rd של הג'ל (ca. 20-30 דקות, איור 3a). הערה: עבור סופג בצפון, נתיב יחיד ג'ל מספיקה, בעוד לניתוח של חלבון הרכב על-ידי דף תלת-ממד וספקטרומטר מסה שמומלץ לשלב אותה להקה של עד עשרה מסלולים ג'ל להתרכז שופע פחות חלבונים.</li>
	<li>להשהות ההפעלה, מאגר קטודית כחול כהה exchange B עם קטודה כחול בהיר מאגר B/10 (טבלה 2) ולהמשיך לרוץ. לסיים את הג'ל כאשר החזית הכחולה יתחיל elute החוצה הג'ל (ca. 120-180 דקות, איור 3a). הערה: הג'ל מקורי כחול המוגמר ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות שבוע. אחסון ממושך יכול להוביל לפזר להקות, יש להימנע. מאגר כחול כהה B הניתנים לשימוש חוזר.</li>
</ol>4. אופציונלי: זיהוי של RNA באמצעות כחול מקורי הצפוני סופג 4
<ol><li>לגזור רצועות נפרדות או להשתמש את ליין ג'ל כל הג'ל מקורי כחול, להעביר אותם לתוך קרום ניילון על ידי חצי יבש סופג-3.5 mA/cm2 עבור 60 דקות ולסמן את הגבול העליון והתחתון ג'ל עם עיפרון על הקרום (איור 4a).</li>
	<li>לאחר סופג, לשטוף את הקרום במים שטופלו DEPC ויבש בין שני ניירות סינון.</li>
	<li>לבצע UV-crosslinking של קרום blotted עם µJ/cm 120,0002 (85 ש' אם שימוש Crosslinker את הטבלה שלחומרים).</li>
	<li>מראש hybridize הקרום עם 6 מ של מאגר הכלאה (מסחרי או מתוצרת עצמית) עבור 60 דקות ב 68 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה (איור 4a).</li>
	<li>להוסיף 1 אוטם שריר נוספים של הכלאה מאגר המכיל 4 µL של הגששים 3'-biotinylated (100 ננומטר).</li>
	<li>דגירה הקרום עם החללית בן לילה, תוך כדי קירור התנור מ 68 ° C ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשטוף את הקרום עם מאגר המכיל 2 מרחביות x SSC ו- 0.1%, עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להסיר את הגששים מאוגדים unspecifically. התראה: מרחביות יכול לגרום גירויים. ללבוש כפפות, חלוק המעבדה בעת עבודה עם מרחביות מרחביות המכיל פתרונות.</li>
	<li>מבצע זיהוי הגששים 3'-biotinylated קרום למשל עם Streptavidin-HRP-המספר המשלים, הלומינול כמו מצע peroxidase (HRP) חזרת, וכתוצאה מכך לתגובה chemiluminescent רגיש (איור 4a).</li>
</ol>5. שני ממד: טריס-Tricine-אוריאה דף 4,28
<ol><li>בלו להקות יחיד של הג'ל מקורי כחול. לשלב להקות מדגימות להפעיל מסלולים מקבילים להשגת ריכוז נוסף של חלבונים מורכבים (איור 5). הערה: להקות נכרת יכול להיות מאוחסן התגובה יחיד צינורות עד שימוש נוסף ב 4 º C.</li>
	<li>לשפוך ג'ל טריס-Tricine-אוריאה ב- 12% (עובי של 1 מ מ, 6.8 ס"מ 8.6 ס"מ (רוחב x אורך)). להתכונן 10 מ ל ג'ל פתרון A הג'ל הפרדת (טבלה 2), לשפוך בין שתי צלחות זכוכית כיסוי עם אלכוהול איזופרופיל. להסיר את אלכוהול איזופרופיל בסיום הפילמור ולהעביר 4 מ ל ג'ל פתרון B (טבלה 2) עבור הערימה בג'ל ג'ל ועל הוספה ש-10 לסרק היטב. התראה: אקרילאמיד Unpolymerized יכול להיות העצבים, TEMED הוא מזיק אם נשאף. תמיד ללבוש ציוד למיגון אישי ועבודה תחת מכסה המנוע.</li>
	<li>העברת הלהקות ג'ל נכרת לתוך צינור התגובה 1.5 mL ולהוסיף 1 מ"ל של 2 x מרחביות למאגר מדגם equilibration של החלקים ג'ל (איור 5, בטבלה 2).<ol>
<li>דגירה בדגימות 10 דקות בטמפרטורת החדר, לפני רותחים בתוך גוש חימום (95 ° C) או במיקרוגל, דגירה בדגימות שוב בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות נוספות.</li>
		<li>מחסנית כמה חתיכות ג'ל equilibrated המייצג אותו מורכבים לכיס ג'ל בודד אחד.</li>
		<li>לבצע את אלקטרופורזה באמצעות אנודת קטודית הפעלת מאגרי ב-150 V 45 עד 60 דקות, לסלק את ליין ג'ל שלם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה השביל לחתוך כעשרים דקות במאגר חומצי (100 מ מ טריס, חומצה אצטית 100 מ מ), equilibrate ב 125 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8 עוד כעשרים דקות (איור 5).</li>
</ol>6. הממד השלישי: 4,מרחביות-דף32
<ol><li>יוצקים על מרחביות 15% הפרדת ג'ל על פי Laemmli32 (עובי: 1.5 מ מ, 6.8 ס"מ 8.6 ס"מ (רוחב x אורך)) (טבלה 2) ומוסיפים שכבה דקה של a 4% לערום ג'ל לעיל. התראה: מרחביות, אקרילאמיד ו- TEMED הם רעילים ואינם מזיקים. לעבוד תחת ברדס וללבוש ציוד למיגון אישי.</li>
	<li>להעביר את ליין ג'ל equilibrated על גבי הג'ל מרחביות ולכסות את הג'ל עם 0.5% (w/w) agarose ב 1 x מרחביות הפעלת מאגר בתוספת עקבות של bromophenol כחול (איור 5).</li>
	<li>מרתיחים זמנים תוססים הפעלת מאגר עם agarose במיקרוגל מוקדמת על הג'ל.</li>
	<li>להפעלת סימן הפרוטאין. כדי להעריך את המשקולות מולקולרית של רכיבי יחיד, הכנס את פיסת נייר סינון בקצה אחד של הג'ל עד agarose פני השטח למוצק או להשתמש מסרק מיוחד משמש בדרך כלל עבור IPG ג'לים.</li>
	<li>להפעיל את הג'ל ב-150 V עבור 60 דקות וכתם הג'ל עם colloidal Coomassie, הכתם כסף או כל אחד אחר מכתים שיטה מתאימה לניתוח spectrometric המוני הבאים.</li>
	<li>לנתח את הנקודות חלבון גלוי שימוש בגישות spectrometric המוני כמו לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון זמן-של-טיסה (MALDI-TOF) או LC-MS/MS ספקטרומטר מסה. הערה: מומלץ להשתמש את Coomassie colloidal מכתים כמו כבר מתואר33... בידיים שלנו, שופע אפילו פחות חלבונים יכולים להיות מספיק צבעונית ומאפשר ניתוח המוני spectrometric עם איכות נתונים סבירים.</li>
</ol>

<ol><li>Kempers, R., van Bel, A. J. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01007704">Symplasmic connections between sieve element and companion cell in the stem phloem ofVicia faba L. have a molecular exclusion limit of at least 10 kDa.</a> Planta. 201 (2), 195-201 (1997).</li>
<li>Stadler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GFP-fusions+in+Arabidopsis+companion+cells+reveals+non-specific+protein+trafficking+into+sieve+elements+and+identifies+a+novel+post-phloem+domain+in+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots.</a> Plant J. 41 (2), 319-331 (2005).</li>
<li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11 (3), 309-322 (1999).</li>
<li>Ostendorp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Brassica+napus+phloem+protein+and+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes.</a> New Phytol. 214 (3), 1188-1197 (2017).</li>
<li>Paultre, D. S. G., Gustin, M. -P., Molnar, A., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+Transit%3A+Long-Distance+Trafficking+and+Phloem+Unloading+of+Protein+Signals+in+Arabidopsis+Homografts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and Phloem Unloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts.</a> Plant Cell. 28 (9), 2016-2025 (2016).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R., Earnest, T., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 216-225 (2003).</li>
<li>Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B. S., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pumpkin+Phloem+Proteome+Provides+Insights+into+Angiosperm+Sieve+Tube+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pumpkin Phloem Proteome Provides Insights into Angiosperm Sieve Tube Function.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8 (2), 343-356 (2008).</li>
<li>Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Brassica+napus+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Brassica napus phloem sap.</a> Proteomics. 6 (3), 896-909 (2006).</li>
<li>Lucas, W. J., Yoo, B. C., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+long-distance+information+macromolecule+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Bio%22%5BJournal%5D)">RNA as a long-distance information macromolecule in plants.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 2 (11), 849-857 (2001).</li>
<li>Dinant, S., Kehr, J. Sampling and Analysis of Phloem Sap. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDinant%2C+S+%22Plant+Mineral+Nutrients%22">Plant Mineral Nutrients</a>. 953, 185-194 (2013).</li>
<li>Kennedy, J. S., Mittler, T. E. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v171/n4351/abs/171528a0.html">A Method of obtaining Phloem Sap via the Mouth-parts of Aphids.</a> Nature. 171 (4351), 528(1953).</li>
<li>King, R. W., Zeevaart, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+Phloem+exudation+from+cut+petioles+by+chelating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of Phloem exudation from cut petioles by chelating agents.</a> Plant Physiol. 53 (1), 96-103 (1974).</li>
<li>Alosi, M. C., Melroy, D. L., Park, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+gelation+of+Phloem+exudate+from+cucurbita+fruit+by+dilution%2C+glutathione%2C+and+glutathione+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The regulation of gelation of Phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and glutathione reductase.</a> Plant Physiol. 86 (4), 1089-1094 (1988).</li>
<li>Dinant, S., Bonnemain, J. -L., Girousse, C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+intricacy+and+interplay+with+aphid+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+biologies%22%5BJournal%5D)">Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding.</a> Comptes rendus biologies. 333 (6-7), 504-515 (2010).</li>
<li>Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+and+analysis+of+Arabidopsis+phloem+exudates+using+the+EDTA-facilitated+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method.</a> J Vis Exp. (80), e51111(2013).</li>
<li>Kovalskaya, N., Owens, R., Baker, C. J., Deahl, K., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+modified+EDTA-mediated+exudation+technique+and+guttation+fluid+analysis+for+Potato+spindle+tuber+viroid+RNA+detection+in+tomato+plants+%28Solanum+lycopersicum%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a modified EDTA-mediated exudation technique and guttation fluid analysis for Potato spindle tuber viroid RNA detection in tomato plants (Solanum lycopersicum).</a> J. Virol. Methods. 198, 75-81 (2014).</li>
<li>Rodriguez-Medina, C., Atkins, C. A., Mann, A. J., Jordan, M. E., Smith, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+composition+of+phloem+exudate+from+white+lupin+%28Lupinus+albus+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Macromolecular composition of phloem exudate from white lupin (Lupinus albus L).</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 36(2011).</li>
<li>Taylor, J. S., Thompson, B., Pate, J. S., Atkins, C. A., Pharis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinins+in+the+Phloem+Sap+of+White+Lupin+%28Lupinus+albus+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytokinins in the Phloem Sap of White Lupin (Lupinus albus L.).</a> Plant Physiol. 94 (4), 1714-1720 (1990).</li>
<li>Yoo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systemic+Small+RNA+Signaling+System+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Systemic Small RNA Signaling System in Plants.</a> Plant Cell. 16 (8), 1979-2000 (2004).</li>
<li>Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+small+RNAs+from+the+phloem+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of small RNAs from the phloem of Brassica napus.</a> Plant J. 53 (5), 739-749 (2008).</li>
<li>Chalhoub, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genetics.+Early+allopolyploid+evolution+in+the+post-Neolithic+Brassica+napus+oilseed+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant genetics. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome.</a> Science. 345 (6199), 950-953 (2014).</li>
<li>Sasaki, T., Chino, M., Hayashi, H., Fujiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+several+mRNA+species+in+rice+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Phys%22%5BJournal%5D)">Detection of several mRNA species in rice phloem sap.</a> Plant Cell Phys. 39 (8), 895-897 (1998).</li>
<li>Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+aphid+stylectomy+and+RT-PCR+for+the+detection+of+transporter+mRNAs+in+sieve+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements.</a> J Exp. Bot. 53 (369), 631-637 (2002).</li>
<li>Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+long-distance+transport+of+CmNACP+mRNA%3A+implications+for+supracellular+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants.</a> Dev. 126 (20), 4405-4419 (1999).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), e2164(2011).</li>
<li>Rais, I., Karas, M., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+for+the+isolation+of+integral+membrane+proteins+and+mass+spectrometric+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification.</a> Proteomics. 4 (9), 2567-2571 (2004).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/full/nprot.2006.4.html">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nature protocols. 1 (1), 16-22 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. -P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Eubel, H., Braun, H. -P., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+PAGE+in+plants%3A+a+tool+in+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions.</a> Plant Methods. 1 (1), 11(2005).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Turnbull, C. G. N., Lopez-Cobollo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy+traffic+in+the+fast+lane%3A+long-distance+signalling+by+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Heavy traffic in the fast lane: long-distance signalling by macromolecules.</a> New Phytol. 198 (1), 33-51 (2013).</li>
<li>Hall, S. M., Baker, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+composition+of+Ricinus+phloem+exudate%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The chemical composition of Ricinus phloem exudate.</a> Planta. 106 (2), 131-140 (1972).</li>
<li>Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+protein+identity+from+sieve+element+sap+in+Ricinus+communis+L.+by+quadrupole+time+of+flight+%28Q-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 55 (402), 1473-1481 (2004).</li>
<li>Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+curcurbit+phloem+exudate+reveals+a+network+of+defence+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.</a> Phytochemistry. 65 (12), 1795-1804 (2004).</li>
<li>Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+and+activity+of+a+complete+antioxidant+defence+system+in+mature+sieve+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes.</a> Plant J. 31 (2), 189-197 (2002).</li>
<li>Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins%3A+their+identities+and+potential+roles+in+the+interaction+between+plants+and+phloem-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects.</a> J Exp. Bot. 57 (4), 767-774 (2006).</li>
<li>Ham, B. -K., Brandom, J. L., Xoconostle-Cázares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polypyrimidine+tract+binding+protein%2C+pumpkin+RBP50%2C+forms+the+basis+of+a+phloem-mobile+ribonucleoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex.</a> Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J. Immunol. Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-delivered+RNA+pool+contains+small+noncoding+RNAs+and+interferes+with+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation.</a> Plant Physiol. 150 (1), 378-387 (2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

שיפה הוא תא של ריבית גבוהה, כיוון שהוא מהווה תוואי תחבורה ראשי עבור photoassimilates, היא חיונית עבור מערכת אזעקה למרחקים ארוכים בין צמחים שונים חלקים9,20,34, 35. בנוסף, מולקולות קטנות מקרומולקולות כמו חלבונים ו RNAs היו מעורבים עם תחזוקה שיפה, איתות4,7,8. הניתוח של הרכב שיפה מוגבלת על ידי נגישות מוגבלת שיפה דגימות של רוב מיני צמחים. הטכניקה stylet חרקים החלים נרחב, אך תובענית השפעול ותוצאות בכמויות קטנות מאוד של שיפה דגימות11. טכניקה קלה אחת המשמש עבור הדגימה שיפה זה הקלו EDTA exudation12. EDTA chelates יונים כלט כמו סידן, וכך מונע סגירה של מסננת צלחות על ידי P-חלבונים ו callose. זה קל לשימוש, אך נוטה זיהום על ידי תאים פגומים, דוגמאות הן מדולל. Depleting יונים כלט מאת EDTA יכול גם להוביל התמוטטות של מתחמי הקיים. עם זאת, הוא מאפשר דגימה מתוך מגוון רחב של מינים, כולל צמח מודל לבנה א15. Exudation ספונטנית של מהצינורות מתרחשת רק במספר קטן של מיני צמחים. זה שיטה פולשני הכרוך נזק משמעותי של רקמות הצמח10. לאחרונה הקמנו napus דרב כמין מודל לימוד בתחבורה הבינעירונית4,8,20. כאן, מהצינורות ניתן לטעום מן חתכים קטנים, אשר מפחית ופצעו אפקטים של מקורות זיהום.
באמצעות טכניקות דגימה שונים, פרוטאום שיפה דוגמאות של מינים שונים של נחקר, בשנים האחרונות7,8,17,36,37, 38,39. ללימודים אלה פרוטאום ', היו חלבונים חילוץ, זירז תחת denaturing תנאים, ולכן אינם מאפשרים מסקנות לגבי חלבון: חלבון וחלבון: חומצות גרעין אינטראקציות להציג בתנאים מקורית. Co-immunoprecipitation (CoIP), שכבת-על מבחני המצוין ribonucleoprotein הגדולות מורכבות אולי קיימים מהצינורות של דלעת40, אך לא הוכח כי כל מכלולי macromolecular להתקיים בתנאים מקורי בתוך מערכת שיפה.
דף מקורי כחול, שהוצגו על ידי. Schägger et al. 26, בשילוב עם ג'ל ברזולוציה גבוהה עוקבות אלקטרופורזה צעדים מאפשרות ההפרדה של רכיבים בודדים של מתחמי חלבון גדולה. באמצעות 3D-דף ניתוחים של יליד napus דרב שיפה תפליט, אנו יכול לאחרונה להדגים כי מספר גבוה משקל מולקולרי: חלבון, מתחמי RNP קיים בדגימות שיפה, פעיל enzymatically4. שיטות אלטרנטיביות כדי לבודד חלבון מתחמי, כמו גם RNPs כמו גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה שאולי קיימים, אבל נכשל מבחינת רזולוציה בהשוואה בסון-דף. יתר על כן, איכות סבירה של הפרדה מורכבים, גודל אי-הכללה של עמודות מטריצות חייב להיות מותאם על פי העובי מולקולרית בסך הכל מורכבת נחקר. ניתוח מתחמי גודל שונים ולכן ידרוש סוגים שונים של עמודות אשר הוא עולה אינטנסיבית, אינו מאפשר ככוח התמקדות גבוהה כדף בסון.
שלבים קריטיים כדי לנתח מתחמי מ napus דרב כוללים את הסכום הכולל של מהצינורות משמש החל חומר. µL לפחות 600 שיפה מדגם הכרחי, ניתן להשיג 5 מפעלים להבינם. 3D-דף ו בסון סופג בצפון זה הכרחי להפעיל את הג'ל בסון הראשונית עם כמות מספקת של שיפה דגימות. כדי להשיג זאת, שיפה דגימות מרוכזים עד ניתן לטעון לתוך כל 20-30 µg של חלבון לפחות היטב triplicates של המדגם אותו מופעלים במקביל. ריכוז נמוך מדי או גבוה מדי להפחית את הגילוי של מכלולים (איור 3). דוגמאות שיפה צריך להיות שנאספו לתוך צינורות התגובה על קרח ויש לאחסנו קפוא לשימוש במועד מאוחר יותר למנוע השפלה חלבון והמסירה. מעכבי פרוטאז נמצאו proteomes שיפה כל מנותח, אך גם פרוטאוזום פעיל מלא שתואר בעלון שיפה napus נולד ב-4. יתר על כן, נפח והרכב של דגימות שיפה תלויות זמן-נקודת הדגימה של תנאים סביבתיים10. לכן חייבים להקפיד לאסוף בו זמנית של היום בתנאים דומים. מתח טיפולים (למשל הבצורת) יכולים להפחית את כמות שיפה הניתנים לאיסוף. כדי לזהות חלבונים יחיד באמצעות ספקטרומטר מסה, זה חובה להגביל מציג קרטין אפשרי על ידי בכפפות כל הזמן. קרטין מוביל לאותות נוספים במהלך ניתוח המוני spec, הסלים זיהוי חלבונים. הפעלת בסון-הדף במתח גבוה או בטמפרטורת החדר יכול להוביל חימום של הג'ל עשוי לגרום פירוק של מתחמי שביר.
פרוטוקול המובאת כאן מתאימה לניתוח של קומפלקסים: חלבון. אנו גם מראים כי זה יכול לשמש כדי לזהות RNAs מסוים הכלול את מתחמי במקביל. כדי להשיג זאת, לאחרונה הצגנו פרוטוקול עבור בסון הצפוני סופג4. RNAs נוטים השפלה מאת RNAse מציג. כדי להגביל את השפלה כזאת שטופלו DEPC, מים אמור לשמש.
המגבלות העיקריות של השיטה הציג כוללים את אומדן משקל מולקולרי של מתחמי חלבון המופרדות על-ידי בסון-דף, מאז העברת התנהגות תלוי בגודל, צורה אפילו שינויים posttranslational של מתחמי31, 41. הערכת גודל של מתחמי RNP זה עוד יותר קשה בגלל ההשפעה של חומצות גרעין על התנהגות ההעברה. זה גם לא ניתן למנוע את מתחמי בגודל זהה שיתוף להעביר בלהקה בודד אחד. זה יכול להוביל חיזוי שגוי של קומפוזיציות מורכבות. ולכן אימות את האינטראקציות נצפתה עם שיטות משלימות, למשל על ידי מבחני תפקודית4, ייתכן שיהיה צורך. גם חלבונים בלבד בחולשה או transiently קשור קומפלקס macromolecular עלול ללכת לאיבוד בתוך שהמאגר בסון. כדי למנוע זאת, דגימות יכול להיות תפור, מה יכול גם לגרום לחפצים או יכול למנוע זיהוי חלבונים, או התנאים מאגר ניתן למטב.
בניגוד קלאסי 2D-דף, השילוב של אוריאה-מרחביות-דף מאפשר ההפרדה על פי hydrophobicity, משקל מולקולרי במקום נקודה איזואלקטרית (pI) ו משקל מולקולרי 28, וכן אינו מגביל את ההפרדה חלבונים של טווח ספציפי pI. חלבונים הדומה קלאסי 2D-דף, מופרדים גלויים נקודות יחיד, אבל על אלכסון קו 4,28 (איור 5, איור 6). יותר חלבונים הידרופובי מופיעים כתמים מעל זה באלכסון, ואילו יותר הידרופילית חלבונים נמצאים מתחת לקו28. הריכוזים לזיהוי בשימוש פרוטוקול זה להפריד חלבונים בין 25 ל-80 kDa. טוב. כדי לאפשר הפרדה של חלבונים קטן או גדול יותר לזיהוי של ריכוז יכולים להיות מגוונים או ג'לים מעבר צבע יכול לשמש בממד השלישי. הרכיבים של מורכבות הרביעי (איור 3) המופרדות באמצעות 3D-דף (איור 6) נחתכו החוצה, טריפסין, מתעכל נותחו על ידי ספקטרומטר מסה. כתוצאה מכך הזיהוי של מספר ligases tRNA. מרכיבי מתחמי אחרים היו שפורסם לאחרונה 4. 3D-עמוד שלנו זמין ההפרדה של ligases שונים, כלומר אספרטט, אספרגין, תראונין, ליזין, גליצין ligases, עם משקולות מולקולרי דומה (טבלה 3). באמצעות בדיקה tRNA ספציפי מתיונין, אנחנו הצליחו לזהות tRNA שעשויות להיות מאוגדים בתוך מתחם הרביעי, אבל אם tRNA באורך מלא או שברי tRNA במתחם לא שיפלו עם הגששים בשימוש. כדי לבדוק אם חומצות גרעין ממש בתוך המתחם וקשורות לא שותפה נודדים, פרוטאז מתעכל מהצינורות דגימות עשוי לשמש בפקדי העברה מתאים.
זה כבר העריכו קודם לכן כי תרגום החלבון יכול להתרחש בתוך צינורות מסננת שיפה, מאז כמעט רוב מרכיבי ריבוזום כולו, כמו גם גורמים התארכות נמצאו שיפה דגימות4,7. שלנו ממצא של tRNA, tRNA ligases נראה כדי לתמוך את הרעיון הזה. אולם, שברי tRNA בדגימות שיפה מתנת דלעת הוכחו להיות מעכבי חזק של תרגום42 , ריבוזומים פונקציונלי שנראה שהוא נעדר4, רומז כי התרגום לא יכולים להתקיים.
פרוטוקול המובאת כאן יחדיו, מאפשר ההפרדה של: חלבון מקורי, אפילו RNP קומפלקסים של שיפה ודוגמאות הפרדה וזיהוי של רכיבים בודדים שלהם עם רזולוציה גבוהה. היישום של שיטה זו מאפשרת הגילוי של חלבון הרומן ושל RNP מתחמי בדגימות שיפה, ולכן יכול להבהיר את פונקציות חדשות בתא הזה צמח מאוד מיוחדים.

התעלות הבינעירוניים של שיפה הם חיוניים עבור ההקצאה של חומרים מזינים אורגניים צמחים גבוהים יותר, אבל הם גם מעורבים בוויסות תהליכים שונים רבים חשוב צמיחה, פיתוח, ההגנה הפתוגן של ההסתגלות כדי לוואי תנאים סביבתיים. חוץ effectors קטן כמו יונים, phytohormones או מטבוליטים עצמם, מקרומולקולות כמו חלבונים ו RNAs שהתגלו לאחרונה כמו אותות פוטנציאליים.
מחקרים הראו כי שיפה הטעינה של חלבונים הוא גודל התלוי ומבוקר על ידי ממגבלת הגודל של הדרה (SEL) של יחידות נקבובית-plasmodesmal התחברות תאים לוויה (CC), ניפוי אלמנטים (SE) כי הם בדרך כלל בטווח של 10 > 67 kDa1 , 2 , 3. עם זאת, למרות אלה מגבלות גודל חלבונים גדולים יותר של חלבון מתחמי נמצאו בתוך מערכת שיפה מאתגר את הרעיון של אי-הכללה של גודל4, אפילו לא ספציפית אובדן מהחלבונים CC ל SE כבר הציע5 .
Ribonucleoprotein multiprotein, כמו גם גדול מתחמי ממלאים תפקידים מרכזי ביוסינטזה, שמירה על שלמות המבנה של תא6. יש ראיות כי מכלולי חלבון ו- ribonucleoprotein שיפה-mobile קיימים4,7, אך נכון להיום ידוע מעט על תפקידם. ברכיבי מסננת שיפה היו מעורבים: חלבון ו- RNP מתחמי בתחבורה הבינעירונית ו / או8,איתות9. כדי לפענח את הפונקציות של מתחמי translocated, לומד שלהם קומפוזיציה אצל משתנה סביבתי או להדגיש תנאי נדרש. כדי להשיג זאת, מתחמי מקורי צריך להיות מבודד, הרכיבים שלהם יש להפריד עם רזולוציה מספיק.
כדי לבודד מתחמי גבוהה משקל מולקולרי של שיפה, זה הכרחי הראשונה כדי לקבל דוגמאות sap מספקת איכות וכמות. הטכניקה יכולה לשמש עבור הדגימה שיפה תלוי מיני צמחים מעניינים. שלוש שיטות עיקריות להשגת מהצינורות קיים 10: חרקים stylectomy11exudation הקלו EDTA12, ספונטנית exudation13.
שיפה דגימות תודרנית לבנה (ע' לבנה), המפעל הגדולות מודל במעבדות ברחבי העולם, יכולה להיות מושגת רק על ידי הקלו EDTA exudation או כנימות עלה stylectomy14,15. שתי השיטות להוביל מהצינורות מדולל מאוד או כמויות מדגם נמוך מאוד. Exudation EDTA הקלו גם מועדים לזיהום, שאולי לא מייצג את הרכב שיפה אמיתי16. שיפה ספונטנית exudation מוגבל לשתול זנים כמו cucurbits, תורמוס או יוקה, לאן לחתוך חלקי הצמח מוביל פליטה ספונטנית של מהצינורות שניתן בקלות שנאספו13,17,18, 19. לאחרונה הקמנו שמן אונס (כרוב napus) כמערכת מודל מתאים לניתוח שיפה, שכן הוא קרוב משפחה של לבנה א , מספר microliters של מהצינורות ניתן להשיג חתכים קטנים זה הוכח להיות של טוהר גבוהה-4,-8,-20. יתר על כן, רצף הגנום napus דרב יצא בשנת 201421.
חוץ stylectomy כנימות עלה, שיפה כל אוסף השיטות המתוארות כוללים פגיעה של הרקמה באתר של הדגימה שמסביב, ההרכב של מהצינורות עשויים להשתנות בתגובה לפציעה. לכן זה חיוני כדי לבדוק את טיב דגימות שיפה, מבלי להתחשב בשיטה דגימה חלה. ישנן שיטות שונות עבור בקרת איכות של שנאספו מהצינורות, למשל על-ידי קביעת RNase פעילות22,23, RT-PCR עם primers נגד8,Rubisco24, או הניתוח של הסוכר הרכב8.
שיטות שונות כדי לבודד ולהפריד בין מתחמי חלבון יכול להיות מיושם, כולל גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה, ultracentrifugation צפיפות סוכרוז או מדגם הסינון דרך ריריות עם משקל מולקולרי ייחודי החתך offs. עם זאת, גישות אלה אינם מאפשרים ברזולוציה גבוהה. טכניקה שנקראת כחול מקורי (דף בסון-), תואר לראשונה על ידי Schägger et al. 25, עדיפה מבחינת רזולוציה. הוא שימש בהצלחה כדי לקבוע את המשקולות מולקולרית של מתחמי חלבון מקורית גדולה organelles שונים או lysates הסלולר ו26,שלהם יחסית abundances27.
להבהיר עוד יותר את הרכב מורכב של חלבונים מתחמי, זה הכרחי להפריד בין הרכיבים השונים תחת denaturing תנאים, שמוביל פירוק מוחלט של הרכיבים המורכבים. זו יכולה להיות מושגת על ידי מימד השני של 28,מרחביות-דף29 או, כדי להשיג רזולוציה גבוהה יותר, על ידי מימד השני של התמקדות לגירויי כאב (הציבורית) ואחריו third dimension של מרחביות-דף30 וזיהוי עוקבות של החלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הדגימה של מהצינורות טהור מצמחים napus דרב וניתוח של חלבון מתחמי מדגימות שיפה כזה באמצעות גישה electrophoretic 3D של שילוב בסון-דף עם טריס-Tricine-שתנן-עמוד ועמוד מרחביות. החלבון מופרדים רכיבים מורכבים לאחר מכן מזוהות באמצעות ספקטרומטר מסה. בנוסף, אנחנו מציגים כחול מקורי הצפוני סופג כשיטה המאפשר הזיהוי של RNAs קומפלקסים גדולים RNP4, הרחבת הישימות של הגישה.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל צינורות תגובה</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>מסרק 10 בארות עבור SDS PAGE, עובי 1 מ"מ</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת 30% אקרילאמיד-ביסקרילאמיד (29:1) תמיסת</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>30% תמיסת אקרילאמיד-ביסקרילאמיד (37.5:1) תמיסת</td><td>BioRad</td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>96% אתנול</td><td>Carl Roth</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Carl Roth</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>אלומיניום סולפט-(14-18)-hydrate</td><td>AppliChem</td><td>141101</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרוקסודיסולפט (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>רכזים צנטריפוגליים למשל Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td><td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent ערכת מודול זיהוי חומצות גרעין</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>ניירות כרומטוגרפיה לדוגמה 3 מ"מ CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30 System</td><td>Biocision</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie כחול מבריק G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>אתנול בטן.</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיית ג'ל למשל Chemidoc Touch</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>AppliChem</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חימום TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה למשל חממת היברידיזציה GFL 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>מחט היפודרמית (0.8 מ"מ)</td><td>B מסרק</td> ג'ל בראון <td>4658309</td><td></td></tr><tr><td>IPG, עובי 1 מ"מ</td><td>BioRad</td><td>1653367</td><td></td></tr><tr><td>תיוג RNA למשל ביוטין 3'סוף ערכת תיוג DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל שיפוע מקורי e.g. Novex NativePAGE 4&ndash; 16% ג'ל חלבון ביס-טריס</td><td>Invitrogen</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת ניילון למשל Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אורתו-זרחתית</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler סולם חלבון צבוע מראש</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח לאלקטרופורזה ג'ל EPS</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>זמין מ-GE Healthcare</td></tr><tr><td>RNA Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>כתם חצי יבש למשל . Fastblot 43B כתם חצי יבש</td><td>ביומטרה</td>, <td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>סינתזה של cDNA למשל ערכת סינתזת cDNA של RevertAid First Strand Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate dihydrate</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb מאגר הכלאה רגיש במיוחד</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td>מבית Fisher Scientific</td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורזה אנכית e.g.מערכת XCell SureLock Mini-Cell או Mini-Protean III Thermo</td><td>Fisher Scientific או BioRad</td><td>EI0001 או 1658004</td><td></td></tr><tr><td>מגבים למשל KIMWIPES Delicate מגבי משימות</td><td>קימברלי-קלארק</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

שיפה sap דגימה של כרוב napus עבור תלת-ממד-דף של חלבונים, קומפלקסים ribonucleoprotein

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

דגימה של שיפה של צמחים גבוהים לעתים קרובות מפרך ותלוי באופן משמעותי מיני צמחים. עם זאת, מחקרים פרוטאום תחת denaturing תנאים ניתן להשיג במינים שונים. מקורית: חלבון וחלבון: חומצות גרעין מתחמי מדגימות שיפה יש עדיין בקושי נותחו, למרות שהם אולי משחק תפקידים חשובים תחזוקת את התא מיוחדים או איתות למרחקים ארוכים. מכלולים גדולים מולקולרית ניתן לבודד באמצעות של כחול מקורי בג'ל (בסון-עמוד). ניתן להפריד בין מרכיבי חלבון שלהם על ידי סולפט נתרן עוקבות dodecyl (דף מרחביות-). עם זאת, חלבונים עם משקולות מולקולרי דומה משותפת נודדים, מה יכול לעכב זיהוי חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה. שילוב בסון-דף עם שני שונים denaturing ג'ל אלקטרופורזה צעדים, כלומר טריס-Tricine-אוריאה ומרחביות-דף, מאפשר ההפרדה נוספים של חלבונים על פי hydrophilicity/hydrophobicity שלהם ושל ובכך מגדיל את הרזולוציה ואת ההצלחה שיטות זיהוי חלבונים. זה גם מאפשר הבחנה חלבונים אשר נבדלים רק שינויים posttranslational שלהם. בנוסף, כחול מקורי הצפוני סופג ניתן להחיל כדי לזהות את רכיבי ה-RNA קומפלקסים macromolecular. אנו מראים כי הפרוטוקול שלנו מתאימה לפענח חלבונים ו- RNA מרכיבי מקורית: חלבון ו- ribonucleoprotein (RNP) מתחמי התרחשות בדגימות שיפה. שילוב של כחול מקורי דף עם שני צעדים דף שונה denaturing יכול לעזור כדי להפריד בין סוגים שונים של חלבון גדולה מתחמי ומאפשר גם שיעור זיהוי מוגברת של הרכיבים שלהם באמצעות ספקטרומטר מסה. יתר על כן, הפרוטוקול היא יציבה מספיק כדי לזהות בו זמנית חומצות גרעין שעשויות להיות מאוגדים בתוך מתחמי חלבון יחיד.

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את הרכב החלבון גדול מקורי: חלבון וחלבון: חומצות גרעין מתחמי מהאונס שמן (נולד ב- napus) תפליט שיפה בגישה של תלת-ממד לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) שילוב של כחול מקורי (בסון) עם שני עמודים denaturing ואחריו זיהוי המוני spectrometric.

שיפה Sap דגימה של כרוב napus עבור תלת-ממד-דף של חלבונים, קומפלקסים Ribonucleoprotein

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

המטרה הכוללת של הליך 3D-PAGE זה היא להפריד קומפלקסים של חלבון וריבונוקלאופרוטאין ממיץ Brassica napus ploem, יחד עם זיהוי חומצת הגרעין ורכיבי החלבון המתאימים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביוכימיה ובפיזיולוגיה של הצמח. לדוגמה, אתה יכול לנתח את הרכב מתחמי הפלום תחת לחץ.היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שניתן לאסוף מיץ פלום טהור ולנתח בו זמנית חומצות גרעין, כמו גם רכיבי חלבון. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי חלבון חלבון, ואינטראקציות של חומצות גרעין חלבון בתוך מערכת הפלום של לפתית זרעי שמן, ניתן ליישם אותה גם על ניתוח פלואם של צמחים אחרים כמו קוקורביטים, תורמוסים ויוקה. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשניסינו לזהות שותפים לאינטראקציה של חלבון ורנ"א עבור חלבון פלואם ספציפי.ראשית, יש לנקב את גבעול התפרחת של צמח B.napus בן שמונה שבועות מספר פעמים באמצעות מחט היפודרמית של 0.8 מילימטר. נקב כמה גבעולי תפרחת אחרים על אותו צמח וצמחים אחרים כדי להשיג מספיק מוהל פלום. נגב את הטיפה הראשונה מכל מקום פצוע עם נייר פילטר.לאחר הסרת הטיפות הראשונות, השתמש בפיפטה כדי לאסוף את הטיפות הנותרות. והעבירו אותם לצינור תגובה חרוטי מקורר מראש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן אחסן את האקסודאט שנאסף במינוס 20 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת קירור נטולת קרח.המשך לאסוף טיפות עד שלא נצפתה היווצרות טיפות נוספות, אך לא יותר משעה. לאחר מכן, הוסף את דגימת הפלום לרכז צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי שנחתך מ-10,000 דלטונים, והתרכז לכ-1/6 מהנפח ההתחלתי. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה המרוכזת בארבע מעלות צלזיוס ו-20,000 גרם למשך 15 דקות לפחות כדי להסיר חלקיקי אבק.כדי לבצע PAGE מקורי כחול, הרכיבו את תא הג'ל. והוסיפו את מאגר הקתודה הכחול הכהה B לחצי, ושטפו את הבארות עם מאגר הקתודה. טען 20 עד 30 מיקרוגרם מדגימת החלבון המרוכזת לכל באר על ג'ל קורן מסחרי של Bis-Tris לפחות משולש.מלאו את החדר במאגר קתודה ואנודה, והפעילו את הג'ל בארבע מעלות צלזיוס ו-150 וולט עד שהדגימה עוברת 1/3 מהג'ל, מה שלוקח 20 עד 30 דקות. השהה את ההפעלה החלפת מאגר קתודה כחול כהה B עם מאגר קתודה כחול בהיר B 1/10. הפעל מחדש את הריצה והמשך עד שהחלק הקדמי הכחול מתחיל לצאת מהג'ל, מה שלוקח 120 עד 180 דקות.גזרו נתיב ג'ל שלם מהג'ל הכחול המקורי, ואז העבירו לקרום ניילון על ידי ספיגה חצי יבשה, וסמנו את גבולות הג'ל העליונים והתחתונים על הממברנה בעיפרון. לאחר הספיגה יש לשטוף את הממברנה במים שטופלו ב-DEPC ולהניח בין שתי חתיכות נייר סינון לייבוש. לאחר מכן, בצע קישור צולב UV של הממברנה המוכתמת באנרגיה מופעלת של 120,000 מיקרו ג'אול לסנטימטר בריבוע.כעת, הכלאה מראש של הממברנה הצולבת UV עם שישה מיליליטר של מאגר הכלאה למשך 60 דקות ב-68 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה. הוסף לממברנה מיליליטר נוסף של מאגר הכלאה המכיל ארבעה מיקרוליטרים של בדיקות ביוטיניליות 3 ראשוניות. לאחר מכן, דגרו את הממברנה עם הגשושית למשך הלילה תוך קירור תנור ההיברידיזציה מ-68 עד 37 מעלות צלזיוס.למחרת, שטפו את הממברנה עם מאגר המכיל 2x SSC ו-0.1% SDS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר בדיקות קשורות באופן לא ספציפי. בצע את הזיהוי של בדיקות ביוטיניליות 3-prime על הממברנה עם מצומד סטרפטווידין HRP ולומינול כמצע פרוקסידאז חזרת, וכתוצאה מכך תגובה כימילומינסצנטית רגישה. הוצא רצועות בודדות מהג'ל הכחול המקורי.שלב רצועות מדגימות הפועלות בנתיבים מקבילים בצינור תגובה חרוטי של 1.5 מיליליטר כדי להשיג ריכוז נוסף של חלבונים מורכבים. להכנת ג'ל אוריאה 12%Tris-Tricine, שפכו 10 מיליליטר תמיסת ג'ל A בין שתי צלחות זכוכית ושכבו באיזופרופנול. לאחר פילמור יש להסיר את האיזופרופנול, להוסיף שניים עד שלושה מיליליטר תמיסת ג'ל B לג'ל ולהכניס מסרק של 10 בארות.לשיווי משקל של חתיכות הג'ל שנכרתו, הוסף מיליליטר אחד של מאגר דגימת SDS פי 2 לתוך צינור התגובה. לאחר דגירה של הדגימה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, יש לחמם בבלוק חימום בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך כדקה. לאחר מכן דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.לאחר מכן, ערמו מספר חתיכות ג'ל מאוזנות המייצגות את אותו קומפלקס בכיס ג'ל אחד. לאחר הרכבת תא הג'ל, בצע אלקטרופורזה באמצעות חוצצי אנודה וקתודה ב-150 וולט למשך 45 עד 60 דקות. בסיום, יש להוציא את כל נתיב הג'ל.דגרו על נתיב הג'ל החתוך למשך 20 דקות במאגר חומצי. לאחר מכן, יש לאזן ב-125 מילי-מולרי Tris-HCL ב-pH 6.8 למשך 20 דקות נוספות. יוצקים תמיסת ג'ל מפרידה 15% SDS לפי lanely.לאחר שהג'ל מתמצק, הסר את האיזופרופנול, הוסף שלושה מיליליטר של תמיסת ג'ל ערימה של 4% והכנס את המסרק המיוחד לג'ל IPG. לאחר ההתמצקות, העבירו את נתיב הג'ל המאוזן על ג'ל ה-SDS, וכסו את הג'ל ב-0.5% אגרוז במאגר ריצה 1x SDS בתוספת עקבות של ברומופנול כחול. לאחר הרכבת תא הג'ל, הפעל את הג'ל בחום של 150 וולט למשך 60 דקות.בסיום, צבעו את הג'ל בתמיסת קומאסי קולואידית לניתוח ספקטרומטרי מסה לאחר מכן. לבסוף, נתח את כתמי החלבון הנראים באמצעות ספקטרומטריית זמן טיסה של יינון לייזר בעזרת מטריצה. תוצאה מייצגת המתקבלת מדגימת פלום טהורה מתוארת כאן.דגימות פלום לא מזוהמות מראות פס גלוי לגיל תיורדוקסין, בעוד שלא נצפה אות ל-RuBisCO ולחלבון מעטפת האבקה. לפחות ארבע רצועות קומפלקס חלבונים עיקריות נראות לאחר BN PAGE של מוהל B.napus phloem. ריכוזים נמוכים מדי או גבוהים מדי של מוהל פלואם אינם מאפשרים הפרדה ברורה של הקומפלקסים.הפרדה ברזולוציה גבוהה נצפית ב-3D PAGE בשל התנהגויות נדידת החלבונים השונות בג'ל האוריאה ו-SDS-PAGE. בדרך כלל, חלבונים השייכים לקומפלקס יחיד ייראו כקו אלכסוני על פני הג'ל. לחלבונים מעל קו זה יש הידרופוביות מוגברת, בעוד שחלבונים מתחת לקו הם הידרופיליים יותר.כתמים צפוניים של BN מראים ש-tRNA ספציפי קיים רק בקומפלקס ספציפי אחד. ניתוח ספקטרומטרי מסה הראה כי קומפלקס זה מכיל בעיקר ליגאזות tRNA המאשרות את פעילות קשירת ה-tRNA שנמצאה על ידי הכתם הצפוני של BN. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים אם היא מבוצעת כראוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ללבוש כפפות וחלוק מעבדה כדי למזער זיהום קרוטן שיפריע לניתוח ספקטרומטרי מסה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו זימוגרמות ובדיקות אנזימים עם מוהל פלום שנאסף על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו פעילות מורכבת ומחקרי עיכוב. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי הצמח לחקור קומפלקסים מרובי תת-יחידות בדגימות פלום ממיני צמחים שונים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד מיץ פלום מצמחי Brassica napus, וכיצד לבודד ולנתח קומפלקסים של חלבון חלבון וחומצות גרעין חלבון. אל תשכח שעבודה עם SDS, אקרילאמיד ו-TMET עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה מתחת למכסה המנוע עם כפפות ומעיל מעבדה בעת ביצוע הליך זה.

phloem-sap-sampling-from-brassica-napus-for-3d-page-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעורבים מרחבית ספציפית התגובות phytochrome.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

פיתחנו טכניקה כדי לבדוק חלבונים אינטראקציות במפעל. חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מחולק לשני קטעים שאינן חופפות. שבר כל משובטים בתוך מסגרת של גן ריבית באמצעות מערכת Gateway, המאפשר ביטוי של חלבונים היתוך. הכינון של האות YFP מתרחשת רק כאשר החלבונים החקירה אינטראקציה.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic מטרתה קבלת תובנות לתוך הרכב של מתחמי multiprotein בתנאים שונים ומודגמת על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית. ניתוח כמותי כמויות שווה של שברים שונים מצפיפות סוכרוז שיפוע מעורבבות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

ידע של ההרכב של SAP השיפה כמו גם את המנגנון של התחבורה והטעינה למרחקים ארוכים שלה הוא חיוני להבנה של איתות למרחקים ארוכים בפיתוח ומתח / תגובת פתוגן צמח ולהטמיע תחבורה. כתב יד זה מתאר את האוסף של פליטות השיפה בשיטה EDTA-הקל.

איסוף וניתוח של<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; השיפה exudates שימוש בשיטת EDTA-הקלה

פירוק חלבונים ממוקד מייצג מנגנון רגולציה עיקרי לתפקוד תא. היא מתרחשת באמצעות מסלול היוביקוויטין-proteasome נשמרים, אשר מייחס רשתות polyubiquitin לחלבון המטרה שלאחר מכן ישמש "תגים" מולקולריים להפרוטאזום 26S. כאן, אנו מתארים assay תא ללא פשוט ואמין לשפלת proteasomal של חלבונים.

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

פרוטוקול זה מפרט את המיצוי האופטימלי של נוזל כביסה אפופלסט מעלי צמחים, תוך שימוש בצמחי שעועית צרפתית (Phaseolus vulgaris) כדוגמה למודל.

טכניקת ההסתננות-צנטריפוגה להפקת Apoplastic נוזלים מצמח עלים שימוש Vulgaris Phaseolus כדוגמה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

מוצג כאן היא גישה זרחנית, כלומר לעצור וללכת מיצוי קצה מבוסס פוספופרוטומית, אשר מספק תפוקה גבוהה כיסוי עמוק של ערבידופסיס phosphoproteome. גישה זו מתווה את הסקירה של איתות מתח אוסמוטי ב Arabidopsis.

אסטרטגיה פוספוטומית ליצירת פרופיל של איתות מתח אוסמוטי ב- Arabidopsis

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה אופטימלית לתצפית היסטולוגית של גלים המושרים על ידי פלזמודיופורה brassicae. מקטעי ויברטומים של היפוקוטיל מנוקים לפני הדמיה פלואורסצנטית כדי לחקור את המעורבות של גורמי שעתוק ופיטוהורמונים במהלך התקדמות המחלה. פרוטוקול זה מתגבר על מגבלות הטמעת הרגם, ומאפשר הדמיה של חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים.

שילוב של מיקרוסקופיית ניקוי ופלואורסצנציה להדמיית שינויים בביטוי גנים ותגובות פיזיולוגיות לפלסמודיופורה brassicae

למדו פרוטוקול לבידוד וניתוח קומפלקסים של חלבונים וריבונוקליאופרוטאינים ממוהל של Brassica napus. השיטה משלבת אלקטרופורזה בדף כחול עם שלבים דנטוריים לזיהוי רכיבי חלבון ו-RNA בו-זמנית.

שיפה Sap דגימה של כרוב napus עבור תלת-ממד-דף של חלבונים, קומפלקסים Ribonucleoprotein

גלה סרטונים נוספים