תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור עיבודים תלת מימדיים של שברי עצי שליה המתאימים לניתוח רשתות כלי הדם הכלולות בהם. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום שלנו, כגון מדוע ילד עשוי להיות מוגבל בגדילה או איזה לחץ ועד כמה חמור הלחץ עשוי היה להוביל ללידה מוקדמת. היתרון העיקרי של ההליך שלנו הוא שאנו נמצאים כעת בעמדה לתייג חיסוני של רקמת עץ סיסי שליה ואז לדמיין את רשתות כלי הדם שלהם ולהשתמש בהדמיות אלה כדי לאפיין ולנתח את רשתות כלי הדם הללו.

ההשלכות של טכניקה זו יכולות להתרחב לאבחנות וטיפולים רבים מכיוון שרוב מדעי החיים מסתמכים על אפיון היסטולוגי דו-ממדי. מי שתדגים את ההליך תהיה גב' ואלרי שוונק שתבצע את התיוג החיסוני וניקוי רקמת השליה ולאחר מכן מר פיליפ נסייז יבצע את הדיסקציה של רקמת השליה ויבצע גם את הניקוי ההפוך של הרקמה. כדי להתכונן לכריתת העץ הווילוס, יש לשטוף תחילה את רקמת השליה הרשמית והקבועה במי מלח חוצצים פוספט.

לאחר מכן מניחים בצלחת פטרי על במת מיקרוסקופ דיסקציה. כדי לאתר את העץ הווילוס, השתמש באזמל ובמלקחיים עדינים כדי לקרוע את רקמת השליה. לאחר מכן, נתחו חתיכות מהעץ הווילוסי באורך של כחמישה מילימטרים והעבירו למיקרו-צינור המכיל מיליליטר אחד של מי מלח עם פוספט.

החלף את מי המלח הפוספטים באחד טרי והמתן 10 דקות עם מערבולת מדי פעם. לאחר מכן, החלף את מי המלח הפוספטים במאגר חודר כדי לחלחל את הרקמה ולחסום קשירה לא ספציפית של נוגדנים משניים. לאחר מכן, דגרו למשך 30 דקות.

לאחר מכן, החלף את המאגר המחלחל בתמיסת מלח חוצצת פוספט המכילה סרום עיזים של שני אחוזים באנטי CD31 חד שבטי של עכבר ואנטי CK7 של ארנב. השאירו את הטישו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת, הסר את הנוגדנים הנותרים עם שטיפות נוספות עם מי מלח עם פוספט עם סרום עיזים של שני אחוזים.

לאחר מכן, הסר את תמיסת המלח עם הפוספט עם סרום עיזים של שני אחוזים והוסף את אותו חיץ, בתוספת אימונוגלובולין נגד עכברים עיזים G יחד עם פלואורופור ירוק ואימונוגלובולין G נגד ארנב עזים יחד עם פלואורופור אינפרא אדום. דגירה למשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הטישו פעם אחת עם PBS-GS ואחסנו טישו מסומן בחושך בטמפרטורת החדר עד לניקוי.

שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במרווחים של 10 דקות. כדי לייבש את הרקמה, הסר את מי המלח המבודדים בפוספט והוסף 50% אתנול לרקמה ודגר למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, יש להשליך ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 70% אתנול במרווחים של 10 דקות ולאחר מכן שלוש שטיפות עם 100% אתנול במרווחים של 15 דקות.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים עדינים כדי להעביר את הרקמה למיקרו-צינור מלא במיליליטר אחד של תמיסה אחת למשך ארבע שעות. לאחר ארבע שעות, העבירו את הרקמה למיקרו-צינור מלא בתמיסה שתיים ודגרו למשך ארבע שעות נוספות. כדי להרכיב את הרקמה בתא סייקס-מור השתמש במלקחיים עדינים כדי למקם החלקת כיסוי עגולה של 25 מילימטר על בסיס החדר.

שוב, השתמש במלקחיים בעלי קצה דק כדי להניח אטם גומי בבסיס על החלקת הכיסוי. הסר את הרקמה השקועה בתמיסה שתיים והנח אותה במרכז החלקת הכיסוי. לאחר מכן, הוסיפו טיפה של תמיסה שתיים, כ-40 מיקרוליטר, על הרקמה.

לאחר מכן, קח פתק כיסוי שני והנח אותו על גבי האטם. לאחר מכן, דחוס את החלקת הכיסוי ואת האטם בחוזקה על ידי השחלת טבעת נעילה לחלק העליון של הבסיס. לאחר מכן, הכנס מחט בגודל 25 דרך האטם לתוך היציאה בבסיס.

לאחר מכן, מלאו מזרק של שלושה מיליליטר בנקודה אחת חמישה מיליליטר של תמיסה שתיים. לאחר מכן, הרכיב מחט בגודל 25 על המזרק והכנס את המחט ליציאה הנגדית דרך האטם. לאחר מכן, התחל להזריק לתא את התמיסה השנייה ובדוק שהאוויר בתוך התא יוצא דרך המחט האחרת בקוטר 25

כאשר החדר מלא, הסר את המחט והמזרק והנח את מחזיק תא סייקס-מור על שלב המיקרוסקופ הקונפוקלי. השתמש במטרה פי 10 כדי למקד את הרקמה המונחת על החדר. לאחר מכן, הגדר נקודת ייחוס לשלב והזז את שלב המיקרוסקופ למעלה ולמטה דרך מישור המוקד כדי לזהות ולהגדיר את החלק העליון והתחתון של הרקמה.

הגדר את גודל הצעד ל-2 נקודות וחמישה מיקרומטר ואסוף קובץ תמונה קונפוקלי המכיל קבוצה של תמונות של הרקמה מלמעלה למטה. לאחר מכן, העבירו את הרקמה למיקרו-צינור המכיל יותר מפי 20 נפח של 100% אתנול כדי להפוך את הפינוי. לאחר מכן, לאחר כל מרווח של שעה, החלף ב-70 ולאחר מכן באתנול 50% ולבסוף במי מלח עם פוספט.

יש לאחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך עד להטמעה. כאן, כדי להראות את רשת כלי הדם של השליה, נרכשו תמונות מיקרוסקופיות וקונפוקליות של שליה אנושית. תמונות מיקרוסקופיות אלה של השליה מראות את עץ הווילוס המקרין שחדר לפרנכימת השליה.

תמונות מיקרוסקופיות אלה מראות נוכחות של חלק דיסטלי של חתיכות עץ וילוס המסתיים באשכול הווילי. לאחר מכן, כדי להראות את שכבת הטרופובלסט של הווילוס, החלק הדיסטלי של העץ הווילוס סומן כחיסוני. בתמונה, שכבת הטרופובלסט החיצונית מוצגת בירוק והנימים מוצגים באדום.

לאחר מכן, כדי לבדוק את רקמת השליה לפני ואחרי ניקוי נרכשו תמונות קונפוקליות של רקמות שליה לא נקיות ונוקו. התמונות מראות כי עבור רקמה לא מנוקה, ניתן ללכוד אימונופלואורסצנציה בעומק של 100 מיקרומטר או פחות של הרקמה. להיפך, עבור רקמת שליה נקייה ניתן ללכוד אימונופלואורסצנציה בעומק גבוה בהרבה.

יתר על כן, כדי להשוות את הרקמה הקונבנציונלית עם החלקים השקופים ההפוך, הרקמה שפונה התייבשה בתהליך הפוך עם אתנול. הצביעה האימונוהיסטוכימית של רקמת השליה עם אנטי CK7 לפני ואחרי הניקוי לא מדגימה שינוי משמעותי במורפולוגיה של הרקמה עקב ניקוי. האנימציה מראה כי רקמת הווילוס המוכתמת במערכת החיסון מופצת לאורך כל עומק נפח הרקמה.

ברגע שאתה מרגיש בנוח לבצע את ההליך, אתה יכול לצפות שהוא יימשך כ-18 שעות, בחלוקה על פני שלושה ימים. בניסיון לבצע הליך זה חשוב לזכור שהוא דורש מספר מערכי מיומנויות שונים. צריך להיות מסוגל לעשות פתולוגיה של שליה, מיקרוסקופיה קונפוקלית.

אתה צריך להיות מסוגל ליצור עיבודים תלת מימדיים של ההדמיה, ואתה צריך להיות מסוגל להיות בקיא בעיבוד וניתוח חיסוני. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו היסטולוגיה מסורתית, דף STS או מאלדי. עם פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך בתחום רפואת האם והעובר, ניאונטולוגיה וביולוגיה של טרופובלסט לחקור את הסיבות השורשיות העומדות בבסיס רעלת הריון, גדילה לקויה של העובר ומצוקה עוברית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנקות, לעבד ולנתח רקמת עץ שילי שליה. תודה רבה שצפיתם בסרטון ובהצלחה בניסויים שלכם.