יבש הדם ולנקודות סרום ככלי שימושי עבור אחסון מדגם להעריך סמנים ביולוגיים לסרטן

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר תרגומי כגון ההזדמנות לחקור סמנים ביולוגיים בחולים ממדינות מתפתחות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא האפשרות לאחסן דגימות דם וסרום למשך שבועיים לפחות ללא הקפאה ולספק חומר באיכות גבוהה לניתוח במורד הזרם כגון qPCR ו-ELISA. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון מחלות כמו סרטן ומחלות זיהומיות.

ניתן ליישם שיטה זו גם בתחומי האבחון או המחקר כמו חקר מחלות טרום לידתיות או ניתוח פתולוגיה זיהומית כגון HIV. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר התחלנו להשוות סמנים ביולוגיים בין סדרת מקרים קווקזית ואפריקאית שעבורם דגימות קפואות לא היו זמינות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי איתור הדם.

בהליך זה, שלושה מיליליטר של דגימת דם נאספים בצינור של שלושה מיליליטר עם 5.4 מיליגרם של EDTA. כתוב את מספר קוד המטופל בפינה הימנית התחתונה של כרטיס החיסכון. השעו בזהירות את הדם בעזרת פיפטה של חמישה מיליליטר.

לאחר מכן, פיפטה והעבירו נקודה אחת של דם לכרטיס השומר. בעזרת קצה חדש לכל מנת דם, חזור על הכתמים כדי להשיג בסך הכל שלושה עד חמישה כתמי דם. השאירו את כתמי הדם היבשים, או DBS, לייבוש למשך הלילה בטמפרטורת החדר כשמכסה כרטיס החיסכון פתוח במצב אופקי על משטח פתוח ולא סופג והימנע מאור שמש ישיר.

למחרת יש לאחסן את הכרטיס בטמפרטורת החדר בשקית ניילון עם חומר ייבוש עד לשימוש. DNA יופק משלושה כתמי דם מיובשים מכרטיס החוסך. התחל בחיתוך כל אחד מה-DBS מהכרטיס והפרדתם מהכרטיס.

חותכים את ה-DBS המופרד לחתיכות קטנות בקוטר של כמילימטר אחד. הנח את החתיכות הקטנות מ-DBS אחד לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. כדי לעכל את הדגימות, הוסף לצינור 180 מיקרוליטר של מאגר ליזה אחד מערכת מיצוי DNA זמינה מסחרית, ולאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר של פרוטאינאז K.Mix על ידי מערבולת.

מניחים את הצינור בחממה תרמית ודוגרים עם טלטול בחום של 56 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. בתום הדגירה, צנטריפוגה קצרה את הצינור כדי להסיר טיפות מהמכסה. התחל את הכביסה על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר ליזה שניים ומערבולת למשך 10 שניות.

מניחים את הצינור במיקסר תרמי ומדגרים בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הנח את עמוד החמקמק בצינור איסוף חדש של שני מיליליטר והשליך את הישן. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה וצנטריפוגה בכוח משיכה פי 6000 למשך דקה אחת.

הניחו את העמוד בצינור איסוף חדש של שני מיליליטר והשליכו את הישן. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה שניים וצנטריפוגה בכוח משיכה פי 6000 למשך דקה אחת. הניחו את העמוד בצינור איסוף חדש של שני מיליליטר והשליכו את הישן.

צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 20,000 למשך שלוש דקות לייבוש הממברנה. כדי לנטרל את ה-DNA, הנח את העמודה בצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר והשליך את צינור האיסוף. מניחים 50 מיקרוליטר מים מזוקקים על מרכז הממברנה ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

צנטריפוגה את הצינור בכוח הכבידה פי 20,000 למשך דקה אחת. אוספים את האלוט ומניחים שוב על מרכז הממברנה. צנטריפוגה את הצינור שוב בכוח הכבידה פי 20,000 למשך דקה אחת.

השלך את הממברנה. לאחר מדידת ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר, יש לאחסן את ה-DNA במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לצורך הליך זה, שבעה מיליליטר של דגימת דם היקפית נאספים תחילה בשפופרת של שבעה מיליליטר ללא EDTA.

השאירו את דגימת הדם להיקרש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. כתוב את מספר קוד המטופל בפינה הימנית התחתונה של כרטיס החיסכון. צנטריפוגה דגימת הדם בכוח הכבידה פי 1100 בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

הסר את הסופרנטנט מהצינור והעביר אותו לצינור חדש של 15 מיליליטר. השעו בזהירות את הדם בעזרת פיפטה של חמישה מיליליטר. פיפטה והעבירו נקודה אחת של סרום לכרטיס החיסכון.

חזור על הכתמים כדי לקבל בסך הכל שלושה עד חמישה כתמי דם. השאירו את כתמי הסרו המיובשים לייבוש למשך הלילה בטמפרטורת החדר כשמכסה כרטיס החיסכון פתוח. למחרת יש לאחסן את הכרטיס בטמפרטורת החדר בשקית ניילון עם חומר ייבוש עד לשימוש.

אם האחסון ארוך מ -14 יום, יש לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס. התכוננו לבדיקת ELISA על ידי הפשרת ה-DSS עבור כל דגימה במידת הצורך. כדי לסלק את החלבון מה-DSS, חותכים DSS אחד לחתיכות קטנות בקוטר של כמילימטר אחד ומכניסים את החתיכות לצינור של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, הוסף ארבעה מיקרוליטר PBS. לנער את הדגימות במהירות נמוכה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, השתמש בדילול מתאים של החלבון כדגימת סרום לניתוח חלבון מופרש או גורם גדילה באמצעות ערכה זמינה מסחרית.

בפרוטוקול זה, דגימות דם וסרום אוחסנו כנקודות מיובשות על נייר סינון בטמפרטורת החדר. כרטיס מייצג לחיסכון בחלבון מוצג לפני ואחרי דגימת הדם. על מנת לוודא שהאחסון על נייר סינון וההליך להסרת דם אינם מפריעים לאיכות הדגימה, בוצעו בדיקות ELISA לחלבון קושר ויטמין D, או רמות DBP, על שמונה דגימות סרום שנאספו בשפופרת של שני מיליליטר ואוחסנו מיד במינוס 80 מעלות צלזיוס או נאספו ככתמי סרום מיובשים.

מקדם השונות, או CV, בין דגימות תואמות נע בין 2% ל-24% וממוצע ה-CV היה 9.6%לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 10, 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות במורד הזרם של ביולוגיה מולקולרית או ניתוח חלבונים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו מאפשרת למחקר בתחום המחקר התרגומי וניתוח הסמנים הביולוגיים לשתף פעולה עם מכונים מכל העולם שאין להם את ציוד המעבדה לאחסון דגימות ביולוגיות בתנאים סטנדרטיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאחסן נכון דגימות דם בדם מיובש ובכתמי סרום. אל תשכח שעבודה עם דם ומגיב כימי עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות וחלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.