Name: מרק Microdilution במבחנה הקרנה: שיטה קלה ומהירה כדי לזהות תרכובות חדשות נגד פטריות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: למדו שיטת microdilution במרק לסינון תרכובות נגד פטריות. מתודה זו מאפשרת הערכה מהירה של פעילות נוגדת פטריות בנפחים קטנים ובזמן קצר, עם אפשרות לאוטומציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים שכמיות-ברזיל, CNPq-ברזיל, FAP/DF עבור תמיכה כספית. אנחנו אסירי תודה ד ר הוגו קוסטה פאיס עבור תיקון כתב היד.

1. פתרונות ומדיה
<ol><li>הכנת 2 X רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני, באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), מרק דקסטרוז Sabouraud ו- Sabouraud אגר דקסטרוז לפי טבלה 1.</li>
</ol>2. תנאי הגידול Inoculum פטרייתי
<ol><li>לאחסן כל זני פטריות קפואות מניות ב- 35% גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס, עד שהוא נדרש.</li>
	<li>בצע את השלבים הבאים לפני ניסוי.<ol>
<li>עבור זנים של קנדידה אלביקנס :<ol>
<li>הפשרת בקבוקון מניות ולהעביר 200 µL מ"ל Sabouraud מרק דקסטרוז צינור פוליפרופילן סטרילי 50 מ עם מכסה, תרבות בין לילה ב 30 ° C עם עצבנות (200 סל ד). זכור שיפוע הצינור ולהשאיר את הכובע פתוחה במקצת עבור לערבב טוב יותר של התרבות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>עבור זנים קריפטוקוקוס neoformans :<ol>
<li>לגרד את פני השטח הקפואים של הבקבוקון מניות. צלחת את התאים על פלטות אגר דקסטרוז Sabouraud ואת תקופת דגירה של 48 h ב- 30 ° C. לאחר הצמיחה גלוי של מושבות המבודד, לשמור את הצלחות במקרר (4 ° C) אטום עם סרט פרפין עד 15 ימים.</li>
			<li>לאסוף את מושבה מבודד בגודל בינוני מהצלחת באמצעות קיסם סטרילי או לולאה לחסן סטרילי, לחסן 10 מ ל מרק דקסטרוז Sabouraud צינור חרוטי סטרילי 50 מ. תקופת דגירה של 24 h ב- 30 ° C תחת עצבנות (200 סל ד).</li>
			<li>אם תחרוג הדגירה 24 שעות ביממה. זכור שיפוע הצינור ולהשאיר את הכובע פתוחה במקצת עבור לערבב טוב יותר. . זה תמיד טוב לתקנן את שלב הצמיחה של התאים לפני כל בדיקה, מאחר וזה גורם חשוב המשפיעים על עמידות מיקרוביאלית. הערה: פטריות הן גדלו ב 30 ° C עבור הפצת מהירה בניסויים שלנו, אך ניתן לשנות את הטמפרטורה כדי לשקף את המטרות של המחקר, טיפול רפואי לדוגמה (37 מעלות צלזיוס). והכי חשוב, הפעם הדגירה הראשונית צריכה להיות הוקמה מראש עבור כל בידוד פטרייתי ומתוחזק לאורך כל הבדיקות כדי להבטיח הפארמצבטית.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר צמיחה פטרייתי, לאסוף את התאים על ידי צריך שתוציאו הצינורות חרוט ב g x 1,200 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע והוסף 10 מ"ל ל- PBS.</li>
	<li>Resuspend את התאים ואת צנטריפוגה שוב ב- g x 1,200 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>חזור על כביסה PBS ו צנטריפוגה עוד פעמיים. לאחר לשטוף את השלישי, resuspend את התאים ב 5 מ ל (לפי גודל גלולה) 2 X RPMI-1640 בינוני.</li>
	<li>להכין 1 מ"ל של בטחונות או 1:1,000 לדילול צינור microcentrifuge (בהתאם עכירות של התליה תא).</li>
	<li>Aliquot 10 µL של דילול זה, למקם אותו בתוך תא hemocytometer ולספור את המספר הכולל של תאים ברבעים פינה ארבעה מתחת למיקרוסקופ. לחשב את הריכוז באמצעות הנוסחה: (סה כ מס ' תא/4) x דילול פקטור x 104 (קאמרית דילול קבוע).<ol>
<li>שקול הכדאיות של 100% אם ספירות הכדאיות ותנאי גידול יש היה בקורלציה באופן שיטתי עבור בידוד נחקר. הערה: תקינה ובקרת איכות של ספירת הכדאיות יכול להיעשות על ידי חזרה-ציפוי בהתאם הוועדה האירופית על שיטת בדיקות רגישות מיקרוביאלית (EUCAST) מינימום מעכבות ריכוז (MIC) פטריות שמרים10 .</li>
		<li>אם המתאם צמיחה/הכדאיות לא נוצרה במשך בידוד שנבחנה, למדוד את הכדאיות פטרייתי על ידי ספירת תאים חיים ב hemocytometer בעזרת צבעי זה צבע סלקטיבי תאים מתים, כגון phloxine B11, trypan blue 12, או יאנוס ירוק13. השתמש התאים פטרייתי עבור פרוטוקול זה רק אם הכדאיות של האוכלוסייה בשלב זה הוא 90% ומעלה. הערה: צבעי המלח/חיה לא יפעלו היטב עם הפטריה של בחירה. בבקשה לבדוק אותם לפני השימוש. לדוגמה, לצבוע trypan blue לא עובד טוב עם neoformans ג.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר מכן, להכין את המתלים תא 2 X RPMI-1640 בינוני (2 X יותאמו inoculum בינוני RPMI-1640). עבור לוחות 96-ובכן לשקול אמצעי אחסון של 5 מ"ל על כל צלחת.<ol>
<li>עבור כל אלביקנס ג זנים, להכין השעיה תא מניות של 4 x 103 תאים למ"ל. זה הריכוז הוא 2 X של ריכוז התא האחרון מכל קידוח (2 x 103 תאים/mL).</li>
		<li>עבור זנים neoformans ג , להכין מלאי תרבות של תאים 2 x 104 תאים/מ ל.... זה הריכוז הוא פעמיים התא האחרון ריכוז כל היטב (1 x 104 תאים/mL).</li>
		<li>עבור פטריות אחרות, מבחן עם ידוע פטריות באיזה ריכוז יהיה אידיאלי לחקר מסוים ביחס זמן הדגירה. להתחשב בזמן חילוף החומרים ושכפול של הפטריה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. פפטידים (סוכן לא ידוע)
<ol><li>לאחסן את פפטידים lyophilized ב-20 ° C, לפזר אותם במים יונים לפני ניסוי. הפעם אחסון מרבי פעם מומס במים יהיה תלוי אופי כל פפטיד.</li>
	<li>להכין את aliquots של פעמיים את הריכוז הגבוה ביותר הסופי במקצועות וזמינותו (2 X). באופן אידיאלי, להכין מספר קטן של aliquots עם מספיק פפטיד לשימוש פעם אחת להימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה. הערה: הבחירה של ריכוז צריך להיות מבוסס על ספרות והמאפיינים של פפטיד. מומלץ להתחיל את דילולים סדרתי עם-100 מיקרומטר של פפטיד, ואז להקטין או להגדיל את טווח ריכוז זה בהתאם לתוצאות שהושג.</li>
</ol>4. התייחסות תבחיני (פקדי חיובי)
<ol><li>עבור אלה מדולל במים: להכין פתרון X 2 של הריכוז הגבוה ביותר של הניתוח (ראה סעיף 5: פטריות Assay עבור הצעדים דילול).<ol>
<li>עבור זנים אלביקנס ג , להכין פתרון של µg/mL 128 של פלוקונאזול או 128 µg/mL של קספופונגין. ריכוז צלחת לשניהם יהיה 64 µg/mL.</li>
		<li>עבור זנים neoformans ג , להכין פתרון של µg/mL 32 של המפוטריצין (פתרון מסיסים במים). ריכוז צלחת יהיה 16 µg/mL. הערה: בדרך כלל המפוטריצין הוא מדולל ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), מאז זה נגד פטריות הוא מסיסות במים. עם זאת, ישנם תכשירים המפוטריצין מסיסים במים זמינים מסחרית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור תבחיני מעורבבת עם הממס האורגני: להכין 100 X פתרון מניות ב דימתיל סולפוקסיד ולאחר מכן למהול אותו עד 10 X מים לשימוש. הערה: לפיכך, בבאר, הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד לא יעלה 1%. באר שבו הפטרייה יצמח בתקשורת המכיל 1% דימתיל סולפוקסיד כפקד נדרש לאור העובדה כמה פטריות לא סובלים גם בריכוז זה של הממס. זכרו דימתיל סולפוקסיד פוטוסנסיטיבית, אז כיסוי לצלחת עם נייר כסף או להניחה בחדר חשוך למשך כל תקופת הדגירה.</li>
</ol>5. פטריות Assay
הערה: במבחנה מבחני פטריות מבוצעות בהתבסס על ציר microdilution רגישות הבדיקה מן ההנחיות קלינית ומכון תקנים מעבדה (CLSI) M27-A3 עם מספר שינויים.
<ol><li>להכין לדילול טורי כפולה כל פפטיד ושליטה פטריות ב 96-ובכן פוליסטירן microplates לאמצעי הסופי של 50 µL.<ol>
<li>בעזרת פיפטה להוסיף 100 µL של פטריות/פפטיד בריכוז 2 X הגבוה הרצוי הריכוז הסופי בעמודות שורה בתוך 1-3, א</li>
		<li>בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 50 µL של מים סטריליים לתוך הבארות אחרים, בשורות ב' עד ה'</li>
		<li>הסר µL 50 הבארות עם הריכוז הגבוה ביותר (row A), העברה הבא טוב של ריכוז הבא (שורה B), homogenize.</li>
		<li>חזור על השלבים שלעיל עד הבאר עם הריכוז הנמוך ביותר ולמחוק 50 µL של זה הרבה (שורה H). להשאיר עמודות 11 ו- 12 (שורות A, B, C) עם המים היחידים עבור הפקד ריק או שליטה שלילי/צמיחה.</li>
		<li>להוסיף 50 µL של 2 X מנוכי עונתיות inoculum בינוני RPMI-1640 מכל קידוח (עמודים 1-3 בתוספת טור 11 (פקד שלילי/צמיחה)); הריכוז הסופי עבור אלביקנס ג יהיה עונה 2 פרק 103 תאים למ"ל, וריכוז הסופי זנים neoformans ג יהיה 104 תאים למ"ל.</li>
		<li>להכין פקדים ריק (מים µL 50 + 50 µL 2 X RPMI-1640 בינונית ללא תאים) שליטה שלילי/צמיחה (מים µL 50 + 50 µL מותאמות inoculum 2 X RPMI-1640 בינוני בלי פטריות) ואת העומס המשקולת טוב כפי שתואר לעיל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על ההליך בכל מתחם להיבדק והפקד פטריות שבחרת (עמודות 4-10). הערה: טורי דילולים יכול להיעשות אנכית כפי להלן הניסוי, או אופקית בצלחת (קרי, אם המספר של דילולים של התמצית נתונה התרכובת/שצריך להיבדק הוא שמונה ומעלה).<ol>
<li>אם הפניה תרכובות, סמים, או כל מרכיביו אותםלאור, לבצע את הבדיקה באור מופחתת, לכסות את הלוחות בנייר כסף או למקם בחדר חשוך במהלך incubations.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שקול את ההמלצות הבאות אופציונלי.<ol>
<li>חותם את הצלחת עם צלחת כיסוי ברור המתיר חילוף הגזים, כמו זה מסייע להפחית את אידוי.</li>
		<li>מקם את הצלחת בחדר לחים; זה גם יעזור להפחית את אידוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה או 48 שעות עבור כל זני אלביקנס ג , ועבור 48 שעות עם סל"ד 200 רועד עבור neoformans ג. עוצמת הקול הסופי נמוך (100 µL) מבטיח כששינוי לא תתרחש. הערה: אין הבדל משמעותי נצפתה בין קריאות MIC ב 24 שעות ל- 48 שעות עבור זנים אלביקנס ג . למרות זאת, קריאות ב 48 שעות הם קל הרבה יותר לדמיין.</li>
	<li>שימו לב כל בארות, בסיוע מיקרוסקופ אופטי הפוכה, לפני תקופת הדגירה ואחרי כדי לוודא שינויים מורפולוגיה גם כדי לבדוק סימני זיהום. הערה: קריאות יכול להיות נעשה באופן חזותי, צולם בסוף הניסוי. לפני כל קריאה, homogenize מעט את הצלחת. ניתן גם לבצע את הקריאות על ידי מדידת OD שלה ב 600 nm, אם התא מתגבש או filamentation הם לא נצפו.</li>
	<li>לבצע את הניסויים לפחות שלוש פעמים על תאריכים נפרדים.</li>
</ol>

<ol><li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neglected+epidemic%3A+fungal+infections+in+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li>
<li>Romani, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21394104">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).</li>
<li>Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+drug+resistance%3A+mechanisms%2C+epidemiology%2C+and+consequences+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med%22%5BJournal%5D)">Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment.</a> Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).</li>
<li>Hancock, R. E., Diamond, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cationic+antimicrobial+peptides+in+innate+host+defences%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences.</a> Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snake+cathelicidin+from+Bungarus+fasciatus+is+a+potent+peptide+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics.</a> PLoS One. 3 (9), e3217(2008).</li>
<li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AaeAP1+and+AaeAP2%3A+novel+antimicrobial+peptides+from+the+venom+of+the+scorpion%2C+Androctonus+aeneas%3A+structural+characterisation%2C+molecular+cloning+of+biosynthetic+precursor-encoding+cDNAs+and+engineering+of+analogues+with+enhanced+antimicrobial+and+anticancer+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities.</a> Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).</li>
<li>Benincasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungicidal+activity+of+five+cathelicidin+peptides+against+clinically+isolated+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts.</a> J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).</li>
<li>CLSI. <a target="_blank" href="https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m27s/">Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3</a>. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).</li>
<li>Guilhelmelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Scorpion+Venom-Derived+Antifungal+Peptides+against+Planktonic+Cells+of+Candida+spp.+and+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms.</a> Front Microbiol. 7, 1844(2016).</li>
<li>The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf">http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf</a> (2017).</li>
<li>Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1439-0434.1988.tb04474.x/full">Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica).</a> Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).</li>
<li>Boedijn, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+as+stain+for+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue as stain for fungi.</a> Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).</li>
<li>Goihman-Yahr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).</li>
<li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histatin+5-spermidine+conjugates+have+enhanced+fungicidal+activity+and+efficacy+as+a+topical+therapeutic+for+oral+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).</li>
<li>Petrou, M. A., Shanson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+Cryptococcus+neoformans+by+the+NCCLS+microdilution+and+Etest+methods+using+five+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media.</a> J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).</li>
<li>Zaragoza, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+analysis+of+variables+for+standardization+of+antifungal+susceptibility+testing+of+nonfermentative+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).</li>
<li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans%3A+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium%2C+buffered+yeast+nitrogen+base%2C+and+RPMI-2%25+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li>
<li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li>
<li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בדיקות Microdilution יכול לנתח את הפעילות נגד פטריות פוטנציאלי של מטרה מורכבים באמצעות כמויות קטנות של המתחם, באותו זמן לבחון אותה בטווח ריכוזים. בהתאם לכך, פרוטוקול זה מומלץ כשלב ראשון סינון עבור פוטנציאל תרכובות חדשות נגד פטריות. פרוטוקול המובאת כאן מבוססת על פרוטוקול M27-A3, תוכנן בתחילה כדי לסייע בבחירה של טיפול נגד פטריות במרפאות, וניתן להתאים מגוון של תרכובות חדשות נגד פטריות. בסך הכל, פרוטוקול זה יכול להתמקד התכונות physicochemical של התמצית או מורכבים. לדוגמה, מועמד פוטנציאלי ב וזמינותו שקרית להופעתו לא יעיל כי מ...

זיהומים פטרייתיים הפכו הדאגה הרפואית חשובה במהלך העשורים האחרונים, נתקל גדל במידה ניכרת בעיקר בשל עלייה במספר של יחידים immunocompromised כגון אלה עוברת טיפול בסרטן, אלה החיים עם HIV/איידס או מושתלים איברים1,2. עם זאת, מערך מוגבל מאוד של תרופות נגד פטריות זמין, הגדלת מספר דיווחים על ההתנגדות פטרייתי להם לתרום הבעיות העיקריות לגבי הרפוי של mycoses מערכתית3.
מקור פוטנציאלי של תרכובות חדשות פטריות הם פפטידים מיקרוביאלית (אמפר), קטן פפטידים cationic המיוצר על ידי אורגניזמים רבים כחלק שלהם תגובה חיסונית מולדת זיהום4. למרות זאת, שיטת ההקרנה כדי לבדוק את המשחות נגד פתוגנים ופטריות אינה אחידה. הליכים שונים שימשו כדי להעריך את הפעילות פטרת של אמפר, לפעמים על אותו מודל מיקרואורגניזם5,6,7. הבדלים אלה וחוסר פרט פרוטוקולים מסוימים לסבך השוואות בין הפארמצבטית תרכובות ואת הסלים.
דרך אחת כדי לתקנן את הבדיקות למועמדים סמים חדשים היא לעקוב אחר הנחיות המשמש להגדרת הרגישות פטריות בהגדרות קליני, כגון קלינית והנחיות M27 מכון תקנים מעבדה (CLSI)-A3. עם זאת, בדיקות רגישות פטריות אלה מגבילות מדי, לא עשה שיקול וריאציה בחילוף החומרים על פני מינים, כפי שהם הוקמו רק עבור כמה סוכנים בחר. לדוגמה, הם לא לוקחים בחשבון את צרכי חילוף החומרים שאינם התססת שמרים.
פרוטוקול זה מאפשר את ההערכה של פעילות של תרכובות פטריות פוטנציאליים והוא מיושם כאן לחיפוש פטריות פפטידים. הוא מבוסס על ציר microdilution רגישות הבדיקה מן ההנחיות CLSI M27-A3 עם שינויים לייעל את ההקרנה של תרכובות חדשות8,9. שינויים אלה מאפשרים השימוש כמויות קטנות של המתחם, וריאציות של טמפרטורה או inoculum הראשונית, מדיה שונים לצמיחה pre-test אופטימלית, תוך המתקנות את התוצאות עם השימוש של הפניה תבחיני כפקדים. שיטה זו, עם השימוש של תרבות רב טוב צלחות, מאפשר למסך במהירות ובאמינות מספר רב של תרכובות.
עקב הגמישות שלה, פרוטוקול זה יכול לשמש עם מחלקות שונות הכימי של תרכובות ונגד מיקרואורגניזמים אחרים, עם כמה עיבודים.

<table><tbody><tr><td><חזק>מדיה וריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני עם L-גלוטמין, ללא נתרן ביקרבונט</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morpholino) חומצה פרופאן סולפונית (MOPS) (o que a gente usa tem um s&oacute; dio, completa o nome dele please)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>השתמש כדי לחצץ 2X RPMI בינוני</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Din&acirc; נציץ</td><td>1528-1</td><td>137 מ"מ למי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2.7 מ"מ למי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>V000129</td><td>10 מ"מ למי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט פוספט (KH2PO4)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>60230</td><td>2 מ"מ למי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud מרק דקסטרוז</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud דקסטרוז אגר</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>V000123</td><td>35% עבור (solu&ccedil; &אטילדה; o de estoque? Criopreserva&ccedil; &אטילדה; o?)</td></tr><tr>מים <td></td><td></td><td>סטריליים</td><td>Para dilui&ccedil; &אטילדה; o das drogas na dilui&ccedil; &אטילדה; o seriada</td></tr><tr><td><תרופות חזקות>אנטי פטרייתיות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>פלוקונזול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td><חזק>פלסטיק</צינור</td> חרוטי חזק><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחת</td><td>באר קורנינג</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>מאגר תמיסה סטרילית</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>השתמש כדי לזרוק את הפתרונות באמצעות הציוד הרב-ערוצי פיפט</td></tr><tr><td><חזק>ציוד וחומרים אחרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אופטי</td><td>ניקון</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>חממה</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>מוגדר ל 37&deg; C</td></tr><tr><td>שייקר</td><td>ניו ברונסוויק סיינטיפיק</td><td>אקסלה E25</td><td>מוגדר ל-37&deg; C, 200 סל"ד</td></tr><tr><td>תא ספירת תאים, נויבאואר</td><td>BOECO גרמניה BOE</td><td>13</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה רב ערוצית</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

מרק microdilution במבחנה הקרנה: שיטה קלה ומהירה כדי לזהות תרכובות חדשות נגד פטריות

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

זיהומים פטרייתיים הפכו מצב רפואי חשוב בעשרות השנים האחרונות, אך מספר תרופות נגד פטריות זמין הוא מוגבל. בתרחיש זה, החיפוש אחר תרופות נגד פטריות חדשות הכרחי. פרוטוקול דיווח על פרטי שיטה פפטידים מסך עבור מאפייניהם נגד פטריות. הוא מבוסס על ציר microdilution רגישות הבדיקה מן ההנחיות קלינית ומכון תקנים מעבדה (CLSI) M27-A3 עם שינויים שיתאימו למחקר של פפטידים מיקרוביאלית כמו תבחיני חדשים פוטנציאליים. פרוטוקול זה מתאר assay פונקציונלי כדי להעריך את הפעילות של תרכובות נגד פטריות, ניתן לשנות בקלות כדי להתאים כל סוג מסוים של מולקולות תחת חקירה. מאז מבחני מבוצעות ב- 96-ובכן צלחות באמצעות אמצעי אחסון קטן, הקרנה בקנה מידה גדול וניתן להשלים את כמות קצרה של זמן, במיוחד אם יבוצע באווירה אוטומציה. הליך זה מדגים איך פרוטוקול קליני מתוקנן, הניתנים לשינוי יכול לעזור המרדף ספסל-עבודה של מולקולות חדשות כדי לשפר את הטיפול של מחלות פטרייתיות.

המיקרופון מוגדר הריכוז הנמוך ביותר במתחם מיקרוביאלית כי לחלוטין מעכב צמיחה פטרייתי גלוי בסוף תקופת הדגירה. מאחר המטרה של פרוטוקול זה יש שיטה מהירה תבחיני פוטנציאליים מסך, כל טוב עם הדומה הבארות ריק ברור מדיה נחשבת תוצאה חיובית, ואילו בכל טוב עם עכירות מקביל הבארות שליטה שלילי/צמיחה נחשב שלילי. עם זאת, אם יש אינטרס לדעת אם כח נתון הוא fungistatic או אנטי-פטרייתית, המדיה מן הבארות חיובי יכול גם להיות מצופה על גבי אגר דקסטרוז Sabouraud או נבדק על ידי עוד מבחן הכדאיות.
<p class="jove_cont...

שיטת microdilution מרק קל וישימה לסינון תרכובות פטריות ותמציות.

מרק Microdilution במבחנה הקרנה: שיטה קלה ומהירה כדי לזהות תרכובות חדשות נגד פטריות

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להעריך את פעילותן של תרכובות אנטי פטרייתיות פוטנציאליות, באמצעות שינוי של בדיקת הרגישות למיקרו-דילול מרק, המשמשת במעבדות קליניות. שיטה זו משמשת להערכת הפעילות הפטרייתית של תרכובות טבעיות או סינתטיות, אחת הבדיקות הראשונות בפיתוח טיפולים אנטי פטרייתיים. אנו מספקים הוראות למסך ראשוני לתרופות אנטי פטרייתיות חדשות המשתמשות בנפחים קטנים תוך זמן קצר, במיוחד אם הניסויים מתבצעים באוטומציה.מי שידגים את ההליך יהיה דניאל זמית-מירנדה, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. התחל הליך זה על ידי גידול זני הפטרייה לבדיקה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. למחרת, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה של הצינורות החרוטיים בטמפרטורה של 1200 גרם, למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו עשרה מיליליטר PBS לכל שפופרת והשעו מחדש את התאים. שוב צנטריפוגה בחום של 1200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שטיפת ה- PBS והצנטריפוגה פעמיים נוספות.לאחר הכביסה השלישית, השעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של מדיום RPMI 1640 בעוצמה כפולה. בהתאם לעכירות תרחיף התאים, הכינו מיליליטר אחד של דילול אחד עד 100, או אחד עד 1000, של כל זן, בצינור מיקרוצנטריפוגה. יש להוציא עשרה מיקרוליטר של דילול זה, למקם אותו בתא המוציטומטר ולספור את המספר הכולל של התאים בארבעת רבעי הפינה מתחת למיקרוסקופ.לאחר חישוב הצפיפות של כל תרחיף תאים, הכינו מתלי תאי מלאי במדיום RPMI 1640 בעל חוזק כפול. הכן 4,000 תאים למיליליטר עבור זני C.albicans, ו-20,000 תאים למיליליטר עבור זני C.neoformans. הפפטידים הליפוליים מאוחסנים באליקווט לשימוש חד פעמי במינוס 20 מעלות צלזיוס, ומומסים רק במים נטולי יונים לפני כל ניסוי.ריכוז הפפטיד צריך להיות כפול מהריכוז הסופי הגבוה ביותר שנבדק בבדיקה. מכינים גם נוגדי פטריות התייחסות. הבדיקה האנטי פטרייתית מתבצעת במיקרו-פלטות פוליסטירן משולשות ו-96 באר.באמצעות דילול סדרתי פי שניים של כל פפטיד ואנטי פטרייתי בקרה, ונפח סופי של 50 מיקרוליטר לבאר. השלב המכריע ביותר בפרוטוקול הוא הדילולים הסדרתיים, לכן היזהר מאוד במהלך השלבים הבאים כדי למנוע כל שגיאה שתפגע בכל הניתוח שלך. בעזרת פיפטה, הוסף 100 מיקרוליטר של הפפטיד האנטי פטרייתי בריכוז החוזק הכפול של הריכוז הסופי הרצוי הגבוה ביותר בעמודות אחת עד שלוש בשורה A.בעזרת פיפטה רב ערוצית, הוסף 50 מיקרוליטר מים סטריליים לבארות האחרות בשורות B עד H.הסר 50 מיקרוליטר מהבארות עם הריכוז הגבוה ביותר.העבירו לבארות המתאימות של הריכוז הבא, והומוגניזציה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. חזור על הדילול הסדרתי עד שמגיעים לבארות עם הריכוז הנמוך ביותר, והשליך 50 מיקרוליטר מבארות אלה. השאר את העמודות 11 ו- 12 של שורות A, B ו- C עם מים בלבד עבור פקדים ריקים, או בקרות צמיחה שליליות.הוסף 50 מיקרוליטר של החיסון המותאם בעוצמה כפולה במדיום RPMI 1640 לכל באר של עמודות אחת עד שלוש, בתוספת עמודה 11. הריכוז הסופי של C.albicans יהיה 2,000 תאים למיליליטר. הריכוז הסופי של C.neoformans יהיה 10,000 תאים למיליליטר.הכן בקרות צמיחה שליליות על ידי ערבוב של 50 מיקרוליטר מים ו -50 מיקרוליטר חיסון מותאם ללא האנטי פטרייתי. הכן פקדים ריקים על ידי שילוב של 50 מיקרוליטר מים ו -50 מיקרוליטר מדיום ללא תאים. טען את הפקדים לבארות המתאימות.התבונן בכל הבארות באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך, ולאחר מכן דגר את הלוחות ב-37 מעלות עם טלטול ב-200 סל"ד. לאחר תקופת הדגירה, התבונן שוב בכל הבארות כדי לאמת שינויים במורפולוגיה, כמו גם לבדוק אם יש סימני זיהום. קבל תמונה של כל לוח באמצעות מצלמה דיגיטלית.בבדיקה מייצגת זו, שלושה פפטידים אנטי-מיקרוביאליים, או AMPs, עם ריכוזים הנעים בין 100 מיקרומולר לנקודה שבע שמונה מיקרומולר, הוערכו לפעילות אנטי-פטרייתית נגד C.neoformans. נכללו בקרת צמיחה וריק. כל באר עם מצע שקוף הדומה לבארות הריקות נחשבת לתוצאה חיובית, ואילו כל באר עם עכירות אנלוגית לבארות בקרת הצמיחה השלילית נחשבת שלילית.מכיוון שהריכוז המעכב המינימלי, או MIC, מוגדר כריכוז התרכובות האנטי-מיקרוביאליות הנמוך ביותר המעכב לחלוטין את צמיחת הפטריות הנראית לעין בסוף תקופת הדגירה, 25 מיקרומולר נחשב למיקרופון עבור AMP1. ו-12 נקודות חמש מיקרומולר, המיקרופון עבור AMP2. יהיה צורך להעריך מחדש את AMP3, מכיוון שהפטרייה גדלה בכל הריכוזים שנבדקו.באותו אופן, שלושה פפטידים נפרדים שנבדקו כנגד C.albicans, טענו כי 50 מיקרומולר הוא ה-MIC עבור AMP1. שישה מיקרומולר הוא המיקרופון עבור AMP2, ו-25 מיקרומולר הוא המיקרופון עבור AMP3. דוגמה לתוצאה גרועה, ככל הנראה מפיפטינג לא תקין במהלך שלב הדילול, מודגמת על ידי עמודות חמש עד שבע בשורה C בלוח זה, שם קיימים הבדלים בצמיחת C.neoformans בין שכפולים.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעתיים, בתוספת זמן גידול הפטרייה, אם היא מבוצעת כראוי. זכור להיות מודע לתכונות הכימיות הפיזיקליות של מולקולות אלה שנבדקו. לאחר מכן השתמש בממיסים מתאימים כבקרה למקרה שהם נחוצים, ולהשתמש תמיד בתאים באותו שלב גדילה.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקת הרג זמן, שימוש בצבעי כדאיות ומבחני ST60 כדי לענות על שאלות נוספות, כמו האם לתרכובת יש השפעה פטרייתית או פטרייתית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוולוגיה הרפואית לחקור מספר מקורות של תרכובות טבעיות או סינתטיות בחיפוש אחר תרכובות אנטי פטרייתיות. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להתחיל תרבית פטרייתית, להכין תאים לבדיקה, לבצע את הדילולים הסדרתיים ולקרוא את התוצאות אחרי הדגירה של זני הפטרייה עם התרכובות שנבדקו שלנו.אל תשכח שעבודה עם פתוגנים פטרייתיים עלולה להיות מסוכנת ביותר. ויש לנקוט בהכנה כגון לבישת ציוד מגן אישי, עבודה בתוך מכסה מנוע ביולוגי ושימוש בנוהלי בטיחות מתאימים בעת ביצוע הליך זה.

broth-microdilution-vitro-screening-an-easy-fast-method-to-detect-new

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה וחזקה...

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

פיתחנו פלטפורמה בצפיפות גבוהה microarray המורכב 3D ננו biofilms...

קנדידה אלביקנס biofilm צ&#39;יפ (ע&quot;א BChip) להקרנה תפוקה גבוהה תרופות נגד פטריות

מקור: Koeth, L. M., et. al., A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing של חיידקים הגדלים באופן אירובי. J. Vis. Exp. (2015).סרטון זה מדגים את שיטת מיקרו-דילול המרק לקביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של אנטיביוטיקה ליפוגליקופפטיד כנגד חיידקים גראם חיוביים. הוא מכסה בידוד מושבות חיידקים, דילול, חיסון בארות מיקרו-צלחת עם ריכוזי אנטיביוטיקה משתנים, ואימות טוהר התרבית וספירת התאים. הסרטון גם מסביר כיצד קשירת אנטיביוטיקה משבשת את סינתזת דופן התא, מה שמוביל...

שיטת מיקרו-דילול מרק לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה של חיידקים גראם חיוביים

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה לסינון תרכובות אנטי פטרייתיות באמצעות בדיקת מיקרודילוציה של מרק. תרכובות הבדיקה מדוללות באופן סדרתי בצלחת מיקרוטיטר ומודגרות עם חיסון פטרייתי. לאחר הדגירה, הצלחת נבדקת עבור בארות ללא צמיחה פטרייתית נראית לעין כדי להעריך את הפוטנציאל האנטי פטרייתי של תרכובות הבדיקה ואת הריכוז המעכב המינימלי שלהם (MIC).

בדיקת מיקרודילוציה במבחנה של מרק להקרנה של תרכובות אנטי פטרייתיות

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת רגישות לדלבנצין של חיידקים גראם-חיוביים רלוונטיים מבחינה קלינית באמצעות מתודולוגיית ייחוס של מיקרו-דילול מרק.

Microdilution שיטת ההפניה מרק לDalbavancin<em&gt; במבחנה</em&gt; בדיקה של רגישות חיידקים שגדלות אירובי

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לסינון ואפיון מהיר של אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית. בדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות ובדיקת שחרור הצבע משתמשות במצעי חיידקי מטרה להערכת פעילות אנזימטית איכותית וכמותית.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

אנו מתארים שיטה מבוססת אגר שונה שנועדה לכמת את ההשפעות האנטי פטרייתיות של מוצרים שמקורם בצמחים. ניתן להעריך הן תרומות תנודתיות והן תרומות לא תנודתיות לפעילות האנטי-פטרייתית באמצעות פרוטוקול זה. בנוסף, ניתן למדוד את היעילות נגד פטריות בשלבים התפתחותיים מרכזיים במערך ניסיוני יחיד.

מדידת פעילות אנטי פטרייתית נדיפה ולא נדיפה של מוצרי ביו-בקרה

פרוטוקול מבוסס צלחת מיקרוטיטר 96-well המשתמש ב-2,3-ביס(2-מתוקסי-4-ניטרו-5-סולפופניל)-5-קרבוקסילייד-2H-tetrazolium (XTT) מתואר כאן, כדי לחקור את השפעת הנוגדנים על ביופילמים שנוצרו על ידי C. tropicalis. ניתן להשתמש בפרוטוקול in vitro זה כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות אנטי-פטרייתיות חדשות פוטנציאליות על הפעילות המטבולית של תאי מין קנדידה בביופילמים.

בדיקת הפחתה מסיסה המבוססת על טטרזוליום להערכת השפעת נוגדנים על ביופילמים של קנדידה טרופיקליס

למדו שיטת microdilution במרק לסינון תרכובות נגד פטריות. מתודה זו מאפשרת הערכה מהירה של פעילות נוגדת פטריות בנפחים קטנים ובזמן קצר, עם אפשרות לאוטומציה.

מרק Microdilution במבחנה הקרנה: שיטה קלה ומהירה כדי לזהות תרכובות חדשות נגד פטריות

גלה סרטונים נוספים