מרק Microdilution במבחנה הקרנה: שיטה קלה ומהירה כדי לזהות תרכובות חדשות נגד פטריות

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להעריך את פעילותן של תרכובות אנטי פטרייתיות פוטנציאליות, באמצעות שינוי של בדיקת הרגישות למיקרו-דילול מרק, המשמשת במעבדות קליניות. שיטה זו משמשת להערכת הפעילות הפטרייתית של תרכובות טבעיות או סינתטיות, אחת הבדיקות הראשונות בפיתוח טיפולים אנטי פטרייתיים. אנו מספקים הוראות למסך ראשוני לתרופות אנטי פטרייתיות חדשות המשתמשות בנפחים קטנים תוך זמן קצר, במיוחד אם הניסויים מתבצעים באוטומציה.

מי שידגים את ההליך יהיה דניאל זמית-מירנדה, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. התחל הליך זה על ידי גידול זני הפטרייה לבדיקה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. למחרת, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה של הצינורות החרוטיים בטמפרטורה של 1200 גרם, למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו עשרה מיליליטר PBS לכל שפופרת והשעו מחדש את התאים. שוב צנטריפוגה בחום של 1200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שטיפת ה- PBS והצנטריפוגה פעמיים נוספות.

לאחר הכביסה השלישית, השעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של מדיום RPMI 1640 בעוצמה כפולה. בהתאם לעכירות תרחיף התאים, הכינו מיליליטר אחד של דילול אחד עד 100, או אחד עד 1000, של כל זן, בצינור מיקרוצנטריפוגה. יש להוציא עשרה מיקרוליטר של דילול זה, למקם אותו בתא המוציטומטר ולספור את המספר הכולל של התאים בארבעת רבעי הפינה מתחת למיקרוסקופ.

לאחר חישוב הצפיפות של כל תרחיף תאים, הכינו מתלי תאי מלאי במדיום RPMI 1640 בעל חוזק כפול. הכן 4,000 תאים למיליליטר עבור זני C.albicans, ו-20,000 תאים למיליליטר עבור זני C.neoformans. הפפטידים הליפוליים מאוחסנים באליקווט לשימוש חד פעמי במינוס 20 מעלות צלזיוס, ומומסים רק במים נטולי יונים לפני כל ניסוי.

ריכוז הפפטיד צריך להיות כפול מהריכוז הסופי הגבוה ביותר שנבדק בבדיקה. מכינים גם נוגדי פטריות התייחסות. הבדיקה האנטי פטרייתית מתבצעת במיקרו-פלטות פוליסטירן משולשות ו-96 באר.

באמצעות דילול סדרתי פי שניים של כל פפטיד ואנטי פטרייתי בקרה, ונפח סופי של 50 מיקרוליטר לבאר. השלב המכריע ביותר בפרוטוקול הוא הדילולים הסדרתיים, לכן היזהר מאוד במהלך השלבים הבאים כדי למנוע כל שגיאה שתפגע בכל הניתוח שלך. בעזרת פיפטה, הוסף 100 מיקרוליטר של הפפטיד האנטי פטרייתי בריכוז החוזק הכפול של הריכוז הסופי הרצוי הגבוה ביותר בעמודות אחת עד שלוש בשורה A.בעזרת פיפטה רב ערוצית, הוסף 50 מיקרוליטר מים סטריליים לבארות האחרות בשורות B עד H.הסר 50 מיקרוליטר מהבארות עם הריכוז הגבוה ביותר.

העבירו לבארות המתאימות של הריכוז הבא, והומוגניזציה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. חזור על הדילול הסדרתי עד שמגיעים לבארות עם הריכוז הנמוך ביותר, והשליך 50 מיקרוליטר מבארות אלה. השאר את העמודות 11 ו- 12 של שורות A, B ו- C עם מים בלבד עבור פקדים ריקים, או בקרות צמיחה שליליות.

הוסף 50 מיקרוליטר של החיסון המותאם בעוצמה כפולה במדיום RPMI 1640 לכל באר של עמודות אחת עד שלוש, בתוספת עמודה 11. הריכוז הסופי של C.albicans יהיה 2,000 תאים למיליליטר. הריכוז הסופי של C.neoformans יהיה 10,000 תאים למיליליטר.

הכן בקרות צמיחה שליליות על ידי ערבוב של 50 מיקרוליטר מים ו -50 מיקרוליטר חיסון מותאם ללא האנטי פטרייתי. הכן פקדים ריקים על ידי שילוב של 50 מיקרוליטר מים ו -50 מיקרוליטר מדיום ללא תאים. טען את הפקדים לבארות המתאימות.

התבונן בכל הבארות באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך, ולאחר מכן דגר את הלוחות ב-37 מעלות עם טלטול ב-200 סל"ד. לאחר תקופת הדגירה, התבונן שוב בכל הבארות כדי לאמת שינויים במורפולוגיה, כמו גם לבדוק אם יש סימני זיהום. קבל תמונה של כל לוח באמצעות מצלמה דיגיטלית.

בבדיקה מייצגת זו, שלושה פפטידים אנטי-מיקרוביאליים, או AMPs, עם ריכוזים הנעים בין 100 מיקרומולר לנקודה שבע שמונה מיקרומולר, הוערכו לפעילות אנטי-פטרייתית נגד C.neoformans. נכללו בקרת צמיחה וריק. כל באר עם מצע שקוף הדומה לבארות הריקות נחשבת לתוצאה חיובית, ואילו כל באר עם עכירות אנלוגית לבארות בקרת הצמיחה השלילית נחשבת שלילית.

מכיוון שהריכוז המעכב המינימלי, או MIC, מוגדר כריכוז התרכובות האנטי-מיקרוביאליות הנמוך ביותר המעכב לחלוטין את צמיחת הפטריות הנראית לעין בסוף תקופת הדגירה, 25 מיקרומולר נחשב למיקרופון עבור AMP1. ו-12 נקודות חמש מיקרומולר, המיקרופון עבור AMP2. יהיה צורך להעריך מחדש את AMP3, מכיוון שהפטרייה גדלה בכל הריכוזים שנבדקו.

באותו אופן, שלושה פפטידים נפרדים שנבדקו כנגד C.albicans, טענו כי 50 מיקרומולר הוא ה-MIC עבור AMP1. שישה מיקרומולר הוא המיקרופון עבור AMP2, ו-25 מיקרומולר הוא המיקרופון עבור AMP3. דוגמה לתוצאה גרועה, ככל הנראה מפיפטינג לא תקין במהלך שלב הדילול, מודגמת על ידי עמודות חמש עד שבע בשורה C בלוח זה, שם קיימים הבדלים בצמיחת C.neoformans בין שכפולים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעתיים, בתוספת זמן גידול הפטרייה, אם היא מבוצעת כראוי. זכור להיות מודע לתכונות הכימיות הפיזיקליות של מולקולות אלה שנבדקו. לאחר מכן השתמש בממיסים מתאימים כבקרה למקרה שהם נחוצים, ולהשתמש תמיד בתאים באותו שלב גדילה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקת הרג זמן, שימוש בצבעי כדאיות ומבחני ST60 כדי לענות על שאלות נוספות, כמו האם לתרכובת יש השפעה פטרייתית או פטרייתית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוולוגיה הרפואית לחקור מספר מקורות של תרכובות טבעיות או סינתטיות בחיפוש אחר תרכובות אנטי פטרייתיות. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להתחיל תרבית פטרייתית, להכין תאים לבדיקה, לבצע את הדילולים הסדרתיים ולקרוא את התוצאות אחרי הדגירה של זני הפטרייה עם התרכובות שנבדקו שלנו.

אל תשכח שעבודה עם פתוגנים פטרייתיים עלולה להיות מסוכנת ביותר. ויש לנקוט בהכנה כגון לבישת ציוד מגן אישי, עבודה בתוך מכסה מנוע ביולוגי ושימוש בנוהלי בטיחות מתאימים בעת ביצוע הליך זה.