Name: וזמינותו נובר/למנהור עבור זיהוי של היפוקסיה ב הזחלים דרוזופילה melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למד לזהות היפוקסיה ברקמות בזחלי Drosophila melanogaster באמצעות מבחן התנהגותי המבוסס על מנהור וחפירה במזון. שיטה זו מסייעת להבחין בין זחלים היפוקסיים לבין מוטנטים אחרים בעלי פנוטיפ דומה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

קארן מ' Qiang היה 2016 זוכת פרס מחקר Schroepfer של ג'יי. ג'ורג ' באוניברסיטת רייס. ג'ואו Fanli היא זוכת מלגת לימוד מאוניברסיטת אורז. השירותים של המרכז מניות דרוזופילה בלומינגטון, המתקן הרווארד הטיול, מרכז המשאבים דרוזופילה וינה בתודה הם הכירו.

1. הכנת הזחלים
<ol><li>יום שני או יותר לפני תחילת וזמינותו, להגדיר חוצה של הרצוי ניסיוני ולשלוט שילובים (מינימום 20 נקבות וזכרים 10 כל) במנות ביצה-lay כפי שתואר על ידי Wieschaus ו- Nusslein-Volhard 13 אלא באמצעות 50 מ ל פוליפרופילן בקבוקונים ו- 6.0 ס מ חד פעמיים צלחות פטרי המכילה אגר ענבים, ומרוח עם שמרים להדביק רק לפני השימוש. שמור זבובים במנות ביצה-lay החושך בטמפרטורת החדר עד שהוא נדרש.</li>
	<li>מתכון אגר ענבים – 100 מ ל קפוא לשלב 100% ענבים מיץ תרכיז, 350 מ"ל deioinized מים, 5 מ ל קרחוני אצטית ו- 13 g ד melanogaster אגר בתוך זכוכית 1 ליטר. מיקרוגל בפרצים 1-2 דקות, תוך ערבוב בין התפרצויות, עד אגר כל היא התפרקה. מגניב הפתרון לכמה דקות ואז להוסיף 10 מ של 10% (w/v) Nipagen (מתיל-p-hydroxybenzoate) ב- 95% אתנול. לערבב ולאחר מכן פיפטה 7 מ לכל צלחת פטרי 6.0 ס מ חד פעמיות, מאפשרים ג'ל ויבשה בטמפרטורת החדר במשך 3-4 ח' חנות 4 ג 0 בשקיות פלסטיק.</li>
	<li>שמרים להדביק מתכון – 7 גר' יבשים שקדים, יונים 10 מ"ל מים, לערבב עם מרית עד עקביות אחיד.</li>
	<li>הקולקציות מתוזמן ביצה כדי ליצור ניסיוני ולשלוט הזחלים. משתמש חדש, צלחות מרוח שמרים, ענבים, לאסוף ביצים בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות בחשיכה בשעות הבוקר. להסיר את הלוחיות אוסף 4 שעות והחלף צלחות טריים. דגירה הלוחות אוסף 4 שעות בלילה בגיל 25 0C עד אחר הצהריים למחרת, כאשר רוב החרקים יש בקעו. לאסוף את הזחלים לחלל הראשון אלה ולהשתמש בהם כדי להגדיר את הניסוי.</li>
</ol>2. הגדרת assay צלחות
<ol><li>הכנת לוחות וזמינותו. לריצה יחיד של וזמינותו, להכין חמישה assay צלחות כל הזחלים ניסיוני 10 צלחות חמש של הזחלים שליטה 10. השתמש בורר הפקק של 1.5 ס מ להסיר את הליבה המרכזית של אגר כל צלחת ליצור חור בשביל האוכל. לשים רסק שמרים (0.8 - 0.9 g) לתוך החור, לטפוח בעדינות עם מרית כדי להפוך תלולית ממלא את החור.</li>
	<li>הכנת צלחת אגר – לשלב יונים 700 מ"ל מים עם 16 גרם אגר melanogaster ד ב גביע זכוכית 2 ל', במיקרוגל ל 5 דק הסרה של מיקרוגל ומערבבים עם מוט זכוכית אגר undissolved להכניס הפתרון. להוסיף מ 17.5 ל 10% (w/v) Nipagen 95% אתנול, מיקס, ולאחר מכן להמשיך חימום במיקרוגל בפרצים s 30 ולאחריו תוך ערבוב, עד אגר כל היא התפרקה לחלוטין. מגניב במשך דקה או שתיים, ואז פיפטה aliquots 15 mL פטרי פלסטיק 10 ס מ. לאפשר אגר ג'ל, לכסות את הלוחות בשלמותם ולתת להם יבש בטמפרטורת החדר לכמה שעות או למשך הלילה. חנות צלחות בשקיות פלסטיק אטום-18 מעלות צלזיוס. הערה 1: כדי למנוע היווצרות גבישים Nipagen על פני הלוחות עקב עודף dessiccation, השתמש צלחות תוך מספר ימים של הכנה. במידת הצורך, קריסטלים להיות מומס מחדש על ידי הטלת כמה microliters של אלכוהול 95% לעברם. הערה 2: אצוות של אגר יכול שיש לה מאפיינים שונים ג'לי. הלוחות ג'ל יבש צריך להיות מוצק למגע מספיק גמיש מעגל נקי, ללא פגע אגר יכול יוסרו בעת שימוש בורר את הפקק ליצירת החור מזון (ראה לעיל).</li>
	<li>הגדרת הזחלים בתוך צלחות וזמינותו. השתמש לחץ מכני עקומת קצה microspatula פלסטיק, טובלים הקצה של שמרים הדבק כדי לספק "דבק" לאסוף את הזחלים. לאסוף את הזחלים לחלל הראשון בנפרד ומניחים בצלחת אגר קרוב התל מזון. להכין לפחות חמישה לוחות שכפל של הזחלים 10 עבור שנינו ניסיוני, שליטה אחרים. עם סיום, קאפ, תווית כל צלחת, הניח את הצלחות (צד המכסה למעלה) במקום חשוך בטמפרטורת החדר (במעבדה שלנו זה 22 ° C).</li>
</ol>3. פיקוח על צלחות assay
<ol><li>לבחון צלחות מדי יום תחת מיקרוסקופ ויבתר ולהקליט את המספר של הזחלים על האוכל, או בחוץ על פני השטח אגר. הערה כל הזחלים גלוי מת או גוסס. שימו לב, אם וכאשר, מינהור לתוך תשתית אגר נראה כי הזחלים להעביר לתוך לחלל השלישי. הערה תאריכים שבהם הגלמים מתחילים להיווצר ושים לב חריגות הגולמי. המשך מדי יום עד כל הזחלים מת או pupated.</li>
	<li>הסר הגלמים בזהירות לצלחת עם נטייה להקניט המחט והעברתן ל צלחת ענבים. אם רצונך בכך, המשך ניטור הגלמים כדי לקבוע כמה eclose כמבוגרים.</li>
</ol>4. הכנת assay לוחות עבור הדמיה
<ol><li>בזהירות להסיר ולמחוק את כל האוכל השמרים. מהבאר המרכזי של כל צלחת.</li>
	<li>בעדינות להציף כל צלחת עם מים מהברז ולהשתמש המכחול של אמן רך כדי להימרח היטב פסולת זה יש כבר מסומנים על גבי המשטח אגר. להחליף את המים מספר פעמים ולהמשיך צחצוח עדין עד שהלוח נקי לחלוטין. תן צלחות שטיפה סופית עם מים יונים, קאפ אותם ולהשאיר בטמפרטורת החדר לילה יבש. הערה: מינהור לתוך אגר הוא האינטנסיבי ביותר סביב התל מזון (ראה איור 2). כתוצאה מכך, שפת הבור מזון בדרך כלל מורחב מעבר לקוטר הראשוני 1.5 ס מ. בנוסף, השבריריות של אגר עבד באזור זה עלולה לגרום חתיכות קטנות של אגר tunneled יאבד מן ההיקף של החור במהלך הניקוי. הגדלת ריכוז אגר ג'ל יכול לעזור עם בעיות אלה, אך תיקונים אפשריים במהלך השלבים כימות התמונה J (ראו להלן).</li>
</ol>5. כימות של מנהרות
<ol><li>תמונה את הצלחות. להכין תמונה של כל צלחת שצולמו על רקע שחור מראה את המנהרות באגר שורות לבן בהיר. הערה: אנו משתמשים במערכת נפוץ לשיקוף DNA ג'לים בשלב זה (ראה טבלה של חומרים, ריאגנטים). יכולה להיות מכוונת חלופית מערכות המסוגלות לייצר קבצי tiff, כגון מצלמות דיגיטליות או מצלמות הפלאפון הדמיה כדי להפיק תמונות מתאימות.</li>
	<li>השתמש בתוכנית הציבור NIH התמונה J כדי quantitate מינהור זחל. להוריד את התוכנית מ- http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. לקבלת מידע נוסף אודות התוכנית ללכת http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html. הערה: מערכות הדמיה אחרות יכול לשמש כדי quantitate tunneling. ההוראות שלהלן חלות NIH תמונה ג'</li>
	<li>לאחר פתיחת תמונת קובץ tiff של צלחת מנהור, השתמש בכלי אליפסה להגדרת אזור עבור כימות מייצג את פני השטח כולו אגר, אך גידולי את קצה הפלסטיק של הצלחת.</li>
	<li>להחיל את סף אוטומטי כדי להפיק תמונה הפוכה של הצלחת, עם המנהרות מציג כמו קווים שחורים. השתמש בדוגם הצבע כלי מברשת צבע לבן יש אזורים שחורים המייצגים נזק אגר מאשר מנהרות.</li>
	<li>תחת התפריט הנפתח נתח , בחר קנה מידה סט | לחץ כדי להסיר מידה ולאחר מכן בחלון לקבוע מידות (גם תחת נתח), בדוק את האזור ואת מגבלת לסף.</li>
	<li>הקש על מקש Cntrl + מקש מ ' הצג אזור שחור (מנהרות) בפיקסלים.</li>
	<li>העתק והדבק ערך הפיקסל של כל צלחת הוא לתוכנית גליונות אלקטרוניים (כגון Excel) אשר יאפשרו אנליזה כמותית.</li>
	<li>החור המרכזי בדרך כלל מורחב עקב מינהור אינטנסיבי באזור זה. כדי quantitate את החסר מינהור, בטל "הגבלת לסף" והשתמש בכלי מטה כדי להגדיר החור המרכזי. הקש על מקש Cntrl + מקש מ כדי לקבל את ערך הפיקסל של אזור זה. להחסיר מהערך הזה את ערך הפיקסל של חור 1.5 ס מ ומוסיפים את ההבדל לערך מינהור שהושג בשלב 5.6.</li>
	<li>עבור כמה צלחות, החור המרכזי אולי חסר חתיכה של אגר tunneled הכולל אזור הסמוך לחור untunneled אגר. כאשר quantitating החור המרכזי לשימוש לוחות אלה דוגם הצבע ואת צבע מברשת כלים כדי להוסיף פס שחור ברחבי האזור החסר כדי להגדיר את אזור tunneled או לא לכלול אזור שאינו חפר מ כימות. הערה 1: אם הזחלים ניסיוני לבצע tunneling כלשהו, כימות זה מאפשר חישוב של ממוצע מינהור סטים של צלחות, השוואה סטטיסטית של שליטה וערכי ניסיוני.</li>
</ol>

<ol><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+responses+to+oxygen+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li>
<li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://mcb.asm.org/content/22/19/6842.full">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li>
<li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC534649/">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li>
<li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li>
<li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17998052">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li>
<li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+hypoxia-induced%2C+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.Cell%22%5BJournal%5D)">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li>
<li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4975476/">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233(2016).</li>
<li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2754235/">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li>
<li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19818339">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li>
<li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15159437">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li>
<li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3127060/">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li>
<li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C. Looking at embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+E+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press. Oxford and Washington DC. 199-227 (1986).</li>
<li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://jeb.biologists.org/content/216/23/4334">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23382692">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230(2013).</li>
<li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark%5BTitle%5D)+AND+%22Scient.+Rep%22%5BJournal%5D)">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שיש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

הוצגו כאן וזמינותו פשוטה שנועדה לזהות רקמת היפוקסיה melanogaster ד הזחלים. האבחנה מתבססת על ומחילות ירד לתוך המזון תלים מוקדם בחיים זחל ואת העדר תשתית מינהור בשלב מאוחר בחייו זחל. הצפיפות זחל יכול לגרום העברה מוקדמת מן מקור מזון, ובכך היבט קריטי אחד של וזמינותו היא כי מספר קטן של הזחלים הם לבדיקה בנוכחות עודפי מזון גדול. הכללת פטריות מתיל-p הידרוקסיל בנזואט (Nipagen) לתוך הצלחות אגר חיוני גם כדי למנוע צמיחה של עובש במהלך וזמינותו.
אנו מוצאים כי הלוחות אגר יכול להיות מקור ההשתנות ב וזמינותו. בדרך כלל, הזחלים של גנוטיפ באותה, קבוצות שונות של ההורים, או אוספים שונים של הזחלים, הצג וריאציה מוגבלת יחסית ההתנהגות שלהם וזמינותו. לעומת זאת, פלטות אגר עשוי בימים שונים או עם קבוצות שונות של אגר יכולות להניב הבדלים tunneling. התנאי אחת ולכן הוא פקד זה, הזחלים ניסיוני צריך כל להיבדק באמצעות פלטות אגר מהכנת אצווה אותו. אגר מיצרנים שונים או אפילו משלוחים של ייצור זהה יכול להשתנות כוחם ג'לי, אז ייתכן צורך התאם הריכוז אגר כלפי מעלה מ- 2.2% משמשת כאן להשגת ג'ל של האופטימלית. מצאנו כי הזחלים פראי סוג יכול בקלות קודחים חור אגר 3% מוצקים.
על מנת להדגים את הערך של זה וזמינותו, השתמשנו בו כדי לחקור היפוקסיה רקמות פוטנציאליים ב הזחלים עם הפונקציה מודחקים של uninflatable , tracheae. הממצאים שלנו מספקים תמיכה חזקה ההשערה כי אובדן הנשימה ביטוי של גן זה יכול לייצר היפוקסיה: btl-Gal4 > UAS -uif RNAi הזחלים הראה כשל להתחפר מזון, העדר תשתית מינהור במהלך לחלל השלישי. במחקרים קודמים שלנו של אחרים אחרים, הבחנו כי היפוקסיה-induced אובדן של מזון ומחילות אינו מוחלט כמו אובדן של מנהרות תשתית על btl-Gal4 > UAS -uif RNAi הזחלים למד כאן התנהגו באופן דומה. הרכיב מינהור כושל של assay הזה מספק לכן הסימן החזק ביותר של היפוקסיה.
למרות btl-Gal4 > uif RNAi הזחלים הראו תכונות התנהגותיות האבחון של היפוקסיה, חתך(מורה)-Gal4 > UAS -uif RNAi לא מוצג ליקויים אלה. Btl , לחתוך(מורה) Gal4 נהגים באים לידי ביטוי בשלבים שונים, ובשנת דפוסים שונים, בתוך tracheae הזחל. Btl-נהג Gal4 בא לידי ביטוי לאורך כל מערכת הנשימה החל מהתפתחותו ב מופרה והמשך דרך החיים זחל. לעומת זאת, ביטוי Gal4 מ חתך(מורה)-Gal4 רק מתחיל בסוף החיים מתחלקים, לאחר מורפוגנזה של tracheae, ונהג מוגבל לסעיפים האחורי הקיצוני של גזעי הגבי, כלי האורך העיקריים של מערכת הנשימה. uif נוקאאוט עם הקו הזה Gal4 לא ייתכן לכן להפחית uif ביטוי מספיק מוקדם או רחבה מספיק כדי לייצר כמה רמת סף של היפוקסיה נדרש כדי להפעיל את ההתנהגויות נמדד זה וזמינותו.
מחקר קודם מצא כי הזחלים לחלל השלישי שנחשפו לרמות נמוכות של חמצן (10%) להראות צמיחה ירידה ועיכוב היווצרות pupariation 14. Btl-Gal4 > UAS -uif RNAi הזחלים למד פה התקדם לחלל השלישי, אבל ההשפעות על שיעורי הצמיחה, להתגלמות שלהן היו יותר מבוטא: הם היו קטן יותר פקדים עם מעט מאוד רקמות שומן מתחת האפידרמיס (איור 3), רק שבריר קטן (~ 10%) ניסיון pupariation. הבדלים אלה מראים את btl-Gal4 > UAS -uif RNAi הזחלים חווה מידה רבה יותר של היפוקסיה, משום uif נוקאאוט ב tracheae היה נוכח במהלך כל חייהם זחל, או משום זה מיוצר יותר מחסור בחמצן חמור ב לחלל השלישי. איך אובדן התפקוד uif tracheae עשוי למנוע העברת החמצן אינה ברורה בשלב זה. Tracheae של btl-Gal4 > UAS -uif RNAi הזחלים היו גלויות דרך הקוטיקולה (איור 3), מעיד כי הם הכיל אוויר, לא נפגעו לנקודת הכניסה נוזלים שנפרצו פונקציה. לכן אפשרי באופן רשמי כי הנזק והכו אותי שנוצרו על-ידי אובדן התפקוד uif לא זכה היפוקסיה אבל מעדיף קצת אחרים מום זה מעכב tunneling. עבור אחרים למד בעבר, קבענו כי כשל לחפור מנהרה קשורה עם רמות גבוהות של LDH mRNA7, מחוון הקנוני של היפוקסיה גליקוליזה מאוחר השלישי לחלל הזחלים 15. לפיכך, אישור סופי של היפוקסיה עבור btl-Gal4 > UAS -uif הזחלים RNAi (וגם בהזחלים בחן בעתיד שימוש assay הזה) מערבת RT-PCR כדי להעריך את רמות ה-mRNA LDH או השימוש מחוון זמינים מסחרית כדי למדוד רמות החמצן תאיים (לדוגמה ראה 16).

מערך גנטי כלים הזמינים ב ד melanogaster מתוחכמים לעשות את זה אורגניזם בעל ערך לחקר תהליכים ביולוגיים שנשמרת אבולוציונית. מפתח התגובות זמינות חמצן מולקולרי הוכיחו להיות שמור לאורך האבולוציה, מחקרים קודמים melanogaster ד יצרו תובנות הרכיבים אוניברסלי של אלה איתות המסלולים 1,2, 3,-4,-5,-6.
במסגרת מחקר שמטרתה לנתח פונקצית נוירון חישה melanogaster ד הזחלים, זיהינו שתי תגובות התנהגותיות אשר הוכיח להיות מופעל על ידי רקמת היפוקסיה-רמות חמצן נורמלית 7. באחת מהן, כשל להתחפר מזון, קשורה מאוד בתגובה רמות חמצן נמוכות שדווחו על-ידי Wingrove ו או'פרל 8. הפעולה השנייה, כשל לחפור מנהרה לתוך תשתית רך במהלך לחלל השלישית מאוחר משוטט שלב, לא בעבר זוהה כמו היפוקסיה הקשורות. אנחנו נקבע כי חשיפת פראי סוג הזחלים נודד אל רמות חמצן נמוכות גם מעכב תשתית מינהור 7, ובכך לבסס כי הן התנהגויות אלו מקורן היפוקסיה - גם הנגרם על ידי נזק לרקמות או רמות צריכת החמצן נמוך. כאן נתאר assay שפותחו כדי quantitate שני היפוקסיה-induced התנהגויות אלו, אשר מתחיל עם תצפיות מיד לאחר הבקיעה זחל.
תגובות ובשפתיים זחל בשלבים המוקדמים לא נבדקו בעבר, ולכן ביצוע ניתוח לאורך החיים הזחל הוא מרכיב חשוב של assay שלנו. רוב הביטויים הברורה של היפוקסיה – איטי, המסכן צמיחה ופיתוח והאתרי גינקולוגיות – חופפים עם זחל פנוטיפים המיוצר על ידי מוטציות רבות. אבל מצאנו כי רק השלישי הזחלים לחלל עם היפוקסיה להראות כישלון חרוץ לחפור מנהרה 7. לכן, אנחנו נקבע כי הזחלים אפילו יותר מסובך מבחינת הצמיחה ובאופן יותר הזחלים ובשפתיים שלנו, עדיין לבצע קצת חופר, ואילו הזחלים ובשפתיים מעולם לא חפר 7. עוד ערך יסוד זה וזמינותו היא לפיכך כי זה מספק דרך להקים כאשר היפוקסיה היא המקור אוסף מסוים של פנוטיפים pleiotropic, בניגוד קצת מתח או תקלה מטבוליות אחרות. בתור הדגמה של וזמינותו, כאן אנו מתארים השימוש באפיון את התגובות של הזחלים עם ביטוי והכו אותי מופחתת של uninflatable, גן כי פונקציות ב איירווייז זחל 9.
אנחנו הסתברותיות כי assay הזה יהיה בעל ערך החוקרים העוסקים באפיון פנוטיפים הזחל כוללת התנהגות לאיטי וצמיחה המסכן. כתוצאה מכך, גנים חדשים המשפיעים על הפצה, שימוש או תגובות, יכול להיות מזוהה חמצן בכל הגוף. עוד יותר, שילוב זה וזמינותו מוטציה הקרנת פרוטוקול יספק מסלול ישיר לזיהוי מוטציות המייצרים היפוקסיה. Assay הזה יהיה גם בעל ערך בניתוח המעגלים ולחושים היפוקסיה-induced מולדת ההתנהגויות שתוארו כאן. רשת עצבית ניתוח מסוג זה הוא מוקד הרבה המחקר הנוכחי והיא מערכת העצבים פשוטה של הזחל melanogaster ד מערכת יקר ניקוד את התנהגויות אוטומטיות. מעורב בתפיסה חמצן זחל החישה הניריונים כבר זוהו, מתן צעד ראשון לקראת הגדרת המעגלים מלא תגובות היפוקסיה-induced 10,11. שימוש assay שלנו בשילוב עם נוקאאוט עצבית סלקטיבית באמצעות מערכת GAL4-UAS12 הוא מסלול ברור עבור קווים נוספים מרכיבי הרשת העצבית.

<table><tbody><tr><td><ריאגנטים חזקים>ריאגנטים</שמרים חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיובשים&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרכיז מיץ ענבים קפוא</td><td>Welch's</td><td></td><td>&nbsp; ניתן להשיג ברוב הסופרמרקטים הגדולים</td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila agar</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-para-hydroxybenzoate</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>20-658</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>50 מ"ל כוסות פוליפרופילן</td><td></td></tr><tr><td>6.0 ס"מ כלי פטרי חד פעמיים</td><td>פלקון</td><td>08757100B</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ כלי פטרי חד פעמיים מפלסטיק</td><td>E+K Scientific</td><td>EK-24104</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומרית פלסטיק</td><td>קורנינג משולב</td><td>3012</td><td></td></tr><tr><td>מחט מתגרה כפופה</td><td></td><td>S08848MH</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח כל מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td>עם 10-30X הגדלה</td></tr></tbody></table>

וזמינותו נובר/למנהור עבור זיהוי של היפוקסיה ב הזחלים דרוזופילה melanogaster

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

מחסור בחמצן בבעלי חיים יכול כתוצאה מחשיפה רמות חמצן אטמוספרי נמוכות או מפני נזק לרקמות פנימיות המפריע בחמצן הפצה. זה גם אפשרי כי התנהגות חריגה של נוירונים חישה חמצן שיכולים לזרז התנהגות היפוקסיה בנוכחות רמות החמצן הרגיל. ב ד melanogaster, פיתוח רמות חמצן נמוכות תוצאות עיכוב של צמיחה ושל התנהגות לאיטי במהלך שלבי זחל. עם זאת, גילויי ויצר גרעון חמצן חופפים במידה ניכרת הפנוטיפים של מוטציות רבות לווסת את הצמיחה, תגובות הלחץ או גפיים. וכתוצאה מכך, אין כרגע אין assay זמין לזהות היפוקסיה הסלולר i) הנגרמת על ידי מוטציה או התנהגות ii) היפוקסיה כאשר המושרה על ידי התנהגות חריגה עצביים.
לאחרונה זיהינו שני בהתנהגויות הייחודי של הזחלים melanogaster ד להתרחש ברמות חמצן נורמלי בתגובה זיהוי פנימי של היפוקסיה. ראשית, בכל שלבי, הזחלים כזה להימנע ומחילות למזון, לעיתים קרובות בסטייה רחוק ממקור המזון. שנית, חופר לתוך תשתית רך, אשר בדרך כלל מתרחשת במהלך השלב השלישי נודד לחלל לחלוטין פוליטי אם הזחלים ובשפתיים. וזמינותו המתוארים כאן נועד לזהות quantitate התנהגויות אלו ובכך לספק דרך לזהות היפוקסיה הנגרם על ידי נזק פנימי ולא חיצוני חמצן נמוכה. Assay צלחות עם תשתית של אגר ותקע המרכזי של שמרים הדבק משמשים לתמיכה חיות דרך החיים זחל. העמדות ואת מצב של הזחלים מתבצע מדי יום כפי שהם המשך הדרך לחלל הראשון עד השלישי. היקף מינהור לתוך תשתית אגר במהלך שלב נודד הוא quantitated לאחר להתגלמות באמצעות NIH ImageJ. וזמינותו יהיה לו ערך בקביעת כאשר היפוקסיה הוא רכיב של הפנוטיפ המוטנטי, ובכך מספקים תובנה אתרים אפשריים הפעולה של הגן המדובר.

כמו הפגנה של הערך הזה assay השתמשנו בו כדי לחקור היפוקסיה פוטנציאליים ב הזחלים עם תפקוד לקוי של הגן uninflatable (uif) ב- tracheae. uif מקודד של טראנסממברנלי גדול זה מתבטא בחריפות על-פני התאים והכו אותי זחל הפסגה. מוטציות של uif נרשמו בעבר שהפגינו התנהגות סוטה יכול להצביע על רקמות היפוקסיה עקב תקלה והכו אותי 9. אנו במיוחד דיכאו uif ביטוי לקנה זחל באמצעות מערכת Gal4-UAS. Gal4 שתי שורות שימשו: i) עד כלות הנשימה (btl)-Gal4, הבאה לידי ביטוי חזק tracheae מתחילת שלהם התפתחות עובריים ו- ii) לחתוך(מורה)-Gal4, אשר מתחיל בביטוי באזור האחורי קטן של tracheae הראשי המטען הגבי בסוף מופרה וממשיך ביטוי חזק באזור זה לאורך כל החיים זחל 7. UAS -uif RNAi קו הושג מן המרכז לחקר דרוזופילה וינה (VDRC ID #1050).
כפי שתואר לעיל בפרוטוקול, חמש לשכפל את צלחות בימיו לחלל הראשון הזחלים הוגדר עבור כל אחד ארבעה צלבים כדלקמן.
ניסוי 1 1) בקרת 1 - לחתוך(מורה)-Gal4 x קנטון-S (+) 2) ניסיונית 1 - לחתוך(מורה)-Gal4 x UAS-uif RNAi
ניסוי 2 3) שליטה 2 - btl-Gal4 x קנטון-S (+) נסיוני 4) 2 - btl-Gal4 x UAS-uif RNAi
ההתנהגות של חתך(מורה)-Gal4 &gt; UAS -uif RNAi הזחלים של ניסוי 1 היה דומה לזה של הבקרה לחתוך(מורה)-Gal4 &gt; + חיות ומחילות, מינהור, מהישרדות להתגלמות, (איור 1 , איור 2). לעומת זאת, הביטוי uif מווסת למטה לאורך כל מערכת הנשימה כולו מן מוקדם בהתפתחות (ניסוי 2) הפיק תגובות שונה במידה ניכרת. Btl-Gal4 &gt; UAS -uif RNAi הזחלים מוצגים שני ביטויים התנהגותיים של רקמות היפוקסיה – צמצום המזון ומחילות, העדר מוחלט של תשתית מינהור בהמשך חייו זחל (איור 1 , איור 2 ). הזחלים ניסיוני היו גם ניכר קטנות, דק יותר וכבד יותר מאשר פקדים (איור 3), הראו שיעור גבוה של מוות במהלך וזמינותו. כפי שצוין לעיל, צמיחה מופחתת, והאתרי ומוות organismal ידועים סימפטומים של היפוקסיה זחל. בנוסף, רוב הזחלים ניסיוני נכשל ניסיון להתגלמות ונשארתי instar כמו השלישי הזחלים ארוך לאחר שליטה הזחלים היה pupated. הזחלים קצת שרדו יותר מ 15 ימים לפני בסופו של דבר למות בלי מאבריה (איור 1 א'). כמה מן הזחלים ניסיוני pupate אבל בכל המקרים חריגים הגלמים נוצרו היוצרים לא מבוגרים בת קיימא.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> איור 1. כימות של מזון ומחילות זחל ופיתוח. (א) אחוז הזחלים חיים מחוץ תלים מזון עבור אחרים ארבע למד כאן. ממוצעים עבור לוחות assay חמש המשמש עבור כל גנוטיפ מוצגים. ביום 3 לאחר הבקיעה, ~ 70% btl-Gal4 &gt; UAS uif RNAi הזחלים היו מחוץ האוכל, ואילו הזחלים לא אותרו בחוץ האוכל או על פני השטח אגר על אחרים שלושה אחרים. Btl-Gal4 &gt; UAS uif RNAi הזחלים למות לאט בין ימים 4-20, עם ~ 15% מהם עדיין חי 15 ימים לאחר הבקיעה. החץ השחור לאורך ציר x כאן, ב (B) מציין את היום שבו כל הזחלים של שלושה אחרים אחרים היו pupated. (ב) אחוז גלוי בחוץ המזון אחרים ארבעה מתים הזחלים. ממוצעים עבור לוחות assay חמש עבור כל גנוטיפ מוצגים. מת btl-Gal4 &gt; UAS uif RNAi הזחלים לצבור לאורך זמן עם רוב גוסס בחוץ האוכל. אחרים אחרים כל לשרוד עד להתגלמות (ג) אחוז ההישרדות כדי להתגלמות עבור אחרים ארבע למד. ממוצעים עבור לוחות assay חמש עבור כל גנוטיפ מוצגים. אין גלמים נורמלי של btl-Gal4 &gt; UAS uif RNAi גנוטיפ הופקו. קווי שגיאה לאורך כל דמות מייצגים SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> באיור 2. כימות של מנהרות זחל. (א) דוגמאות של הלוחות assay עבור כל ארבעה אחרים למד לאחר הכנה מינהור כימות. הערה העדר מינהור עבור btl-Gal4 &gt; UAS uif RNAi הזחלים. צלחות assay הן צלחות פטרי 10 ס מ. (ב) מינהור כימות נגזר J תמונה עבור אחרים ארבע. ממוצע ערכי פיקסלים עבור לוחות assay חמש עבור כל גנוטיפ. אין מנהרות מתחת נצפתה עבור btl-Gal4 &gt; UAS uif RNAi הזחלים. קווי שגיאה = SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> איור 3. השוואה של btl-Gal4 &gt; UAS uif RNAi, btl-Gal4 &gt; + הזחלים הזחלים גיל דומה (יום 6 לאחר הבקיעה) עבור btl-Gal4 &gt; UAS uif RNAi (א) ו- btl-Gal4 &gt; + (ב) אחרים. חצים אדומים הצבע tracheae המטען הגבי. שניהם הזחלים עם תמונה בהגדלה אותו. סרגל קנה מידה = 0.5 מ מ. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

הפרוטוקול מתאר של assay פשוט לזהות את הזחלים דרוזופילה melanogaster חווים היפוקסיה תחת רמות חמצן אטמוספרי רגיל. פרוטוקול זה מאפשר הזחלים שתקבעו יהיה מכובד של מוטאנטים אחרים שמראים פנוטיפים חופפים כגון והאתרי או צמיחה איטית.

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לזהות זחלי דרוזופילה הסובלים מהיפוקסיה של רקמות למרות היותם ברמות חמצן תקינות. בדרוזופילה ישנן מוטציות רבות המייצרות צמיחה איטית וגרועה, של הזחלים וחלק מהזחלים איטיים. בדיקה זו מזהה בתוך אותה קבוצה של זחלים, אלה הסובלים מהיפוקסיה של רקמות.בסופו של דבר, בדיקה זו תסייע בזיהוי מוטציות נוספות המייצרות מחסור בחמצן ברקמות באמצעות תהליכים פיזיולוגיים שונים. הרעיון לבדיקה זו עלה מהתצפית שזחלים עם דרכי נשימה פגועות או קנה נשימה הראו שתי התנהגויות מוזרות. התנהגויות חריגות אלה הן כישלון להתחפר במזון במהלך חיי הזחל המוקדמים וכישלון לחפור מנהרה לתוך שכבה רכה יותר בשלב הנדודים.הגדר את ההכלאות הגנטיות של הבקרה והניסוי בצלחות הטלת ביצים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שמור את הזבובים בחושך לפחות יומיים לפני תחילת איסוף הביצים המתוזמן. לאיסוף ביצים מתוזמן, העבירו את הבוגרים לצלחות אגר ענבים חדשות מעוטרות במריחה טרייה של רסק שמרים מוקדם ביום ואפשרו לבוגרים להטיל ביצים על הצלחות במשך ארבע שעות.לאחר ארבע שעות מעבירים את הבוגרים לצלחות אגר ענבים טריות. לאחר מכן, דגרו את צלחות האיסוף של ארבע שעות למשך הלילה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. עד למחרת אחר הצהריים, רוב הזחלים יבקעו.תכננו שיהיו לפחות 50 לכל קבוצת ניסוי. עבור ריצה אחת של הבדיקה, הכינו לפחות חמש לוחות בדיקה לכל קבוצת ניסוי. הוסף 16 גרם אגר זבוב ו -700 מיליליטר מים נטולי יונים על ידי חימום.הכן ניפגן 17.5 מיליליטר באתנול 95%. מחממים את תמיסת האגר עד להמסה כמעט מלאה. לאחר מכן מוסיפים תמיסת ניפגן לתמיסת האגר ומחממים עד שהאגר נמס לחלוטין.מצננים את תמיסת האגר לזמן קצר, ואז טוענים צלחות של 10 סנטימטר עם 15 מיליליטר מתמיסת האגר. לאחר ג'ל האגר, הניחו מכסים על הצלחות ותנו להם להתייבש בטמפרטורת החדר למשך כמה שעות או למשך הלילה. אגר נרפא חייב להיות יציב למגע ולהתנגד להתפוררות כאשר חותכים ממנו חתיכות.לאחר שהאגר נרפא, השתמש בלוח שעם בגודל 1.5 ס"מ כדי ליצור חור מרכזי בג'ל האגר בכל צלחת. ואז ממלאים את החורים בצורה מסודרת במשחת שמרים טרייה. כדי להעביר את הזחלים לצלחת הבדיקה, הכינו כלי פשוט.כופפו עקומה לקצה מיקרו-מרית פלסטיק וטבלו את הקצה במשחת שמרים כדי שיהיה דביק לזחלים. כעת הרם את זחלי הכוכב הראשונים בנפרד והניח אותם על צלחת האגר קרוב לתלולית המזון. לכל קבוצת ניסוי, הכינו לפחות חמש צלחות, כל אחת עם 10 זחלים.כדי להבטיח שחזור בין שכפולי הבדיקה, זה קריטי שרק 10 זחלים יונחו על כל לוחית בדיקה. הקפד לבדוק היטב את לוחית הבדיקה כדי לקבוע שזחל אחד, ויחיד, מועבר בכל פעם שאתה מעביר זחל עם קצה המיקרו-מרית. לאחר טעינת צלחת, סמן אותה, כסה אותה ולאחר מכן הנח אותה בחושך כשצד המכסה כלפי מעלה בטמפרטורת החדר.בדוק כל צלחת מדי יום עד שכל הזחלים מתו או התגלמו. להלן דוגמאות לצלחות לזן מסוג בר ליום השני עד היום השמיני של הבדיקה. ביום השני, הזחלים נקברים במזון ולא מתרחשת מנהור.חפירת המנהרות מתחילה ביום השלישי ומגיעה למקסימום בין היום החמישי לשמיני, כאשר הזחלים מפסיקים לנדוד ומתגלמים במנהרותיהם. העבירו בזהירות את הגלמים בעזרת מחט מתגרה כפופה לצלחת ענבים ואם תרצו, ספרו כמה גלמים סוגרים. שימו לב להיווצרות הגולם והעריכו את הגלמים לאיתור חריגות.כדי לדמות את המנהרות בתוך לוחית הבדיקה, ראשית הסר בזהירות והשליך את כל מזון השמרים מהבאר המרכזית של כל צלחת. לאחר מכן הציפו בעדינות כל צלחת במי ברז והשתמשו במברשת צבע רכה כדי לשפשף בזהירות כל פסולת שאותרה על משטח האגר. חתיכות מסוימות של אגר עשויות להתפורר במקומות שבהם המנהור הוא האינטנסיבי ביותר.ניתן לתקן זאת מאוחר יותר. המשיכו להחליף את המים מספר פעמים והברישו בעדינות את הפסולת עד שהצלחת נקייה לחלוטין. לאחר מכן שטפו את הצלחת במים נטולי יונים, כסו אותה ותנו לה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה.חשוב להשתמש בזרימה עדינה של מים ובמשיכות מכחול עדינות לניקוי צלחות האגר כדי שלא תתנתק או תפגע בחלקים מג'ל האגר. למחרת, הכינו תמונת קובץ tiff של הלוח באמצעות רקע שחור כדי להציג את המנהרות כקווים לבנים בהירים. מערכות תיעוד ג'ל עובדות היטב עבור שלב זה.לאחר מכן, כמת את המנהור בתמונה באמצעות תמונה J עם הכלי הסגלגל, הגדר את ג'ל האגר עד, אך לא כולל, את קצה הפלסטיק של לוחית הפטרי. לאחר מכן החל סף אוטומטי כדי לייצר תמונה הפוכה של הלוחית כך שהמנהרות יופיעו כקווים שחורים. לתיקון אזורים כהים שאינם כוללים מנהרות, השתמשו בדוגם הצבע ובכלי מברשת צבע כדי להלבין אזורים אלה.לאחר מכן, תחת התפריט הנפתח ניתוח, בחר הגדר קנה מידה ולחץ כדי להסיר קנה מידה. לאחר מכן עבור לחלון הגדר מדידות תחת נתח וסמן אזור והגבל לסף. כעת לחץ על מקש Control עם מקש M כדי לקבל מדידה של האזור השחור בתמונה ביחידת הפיקסלים המייצגת את אזור המנהור.כדי לכמת מנהור שאבד עקב שחיקת אגר סביב החור המרכזי, בטל את הסימון של גבול לסף. השתמשו בכלי שרביט להגדרת החור המרכזי והקישו Control ועוד M למדידת ערכו בפיקסלים. הפחיתו מערך זה את ערך הפיקסלים של חור בקוטר 1.5 סנטימטר.הוסף את ההפרש לערך הפיקסלים שהושג בעבר כדי לקבל את ערך הפיקסל הכולל של המנהור. עבור לוחות שבהם האגר החסר משתרע מעבר לטבעת המרכזית של המנהור, יש צורך בצעד נוסף כדי למנוע מהכימות לכלול אזורים מחוץ לאזור המרכזי. השתמש בכלים Color picker ו-Paintbrush כדי להוסיף פס שחור כפי שמוצג כדי להגביל את השטח המכומת.הבדיקה המתוארת שימשה לחקירת היפוקסיה פוטנציאלית בזחלים עם תפקוד לקוי של הגן הבלתי מתנפח בקנה הנשימה. הגן דוכא RNAi באמצעות כטב"ם Gal4. נעשה שימוש בשני קווי Gal4.Gal4 חסר נשימה, המתבטא בכל ההתפתחות בכל מערכת קנה הנשימה. או cut(ue)Gal4, המתבטא בעוצמה בחתך קנה הנשימה קטן במהלך חיי הזחל. זחלי הבקרה הכילו אחד מקווי Gal4, אך לא RNAi בלתי מתנפח.זחלים עם חתך (ue)Gal4 המניעים RNAi לא מתנפח לא היו ניתנים להבחנה מבקרות לאורך כל ההתפתחות הן מבחינת גדילה והן מבחינת התנהגות. עם זאת, דיכוי חזק של RNAi בלתי מתנפח לאורך קנה הנשימה עם blt-Gal4 הביא לכישלון להתחפר בשלב ההזנה ויצר שיעור תמותה גבוה. זחלים אלה הראו גם היעדר מוחלט של מנהרות בשלב הנדודים.יתר על כן, זחלי הניסוי חסרי הנשימה של Gal4 היו קטנים יותר, דקים יותר ואיטיים יותר מקבוצת הביקורת ונשארו כזחלים זמן רב לאחר שכל הקבוצות האחרות התגלמו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבדוק זחלי דרוזופילה להיפוקסיה של רקמות על ידי ניטור המידה שבה הם מתחפרים בתלוליות המזון שלהם או מנהרה לתוך תשתית רכה. היעדר מוחלט של מנהור הוא אינדיקטור חזק להיפוקסיה של רקמות.

a-burrowingtunneling-assay-for-detection-hypoxia-drosophila

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

תסיסנית melanogaster היא מערכת גנטית התנהגותית מודל צייתן, שבו נעשה שימוש כדי להבין את הבסיס המולקולרי התאי של תהליכים ביולוגיים רבים חשובים יותר ממאה שנים 1. תסיסנית נוצלה היטב כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס הגנטי של ההתנהגות במהירות הבזק.

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

סרטון זה מציג שיטה לבדיקת היפוקסיה בזחלי דרוזופילה על ידי הערכת יכולות המחילה והמנהור שלהם. באמצעות טכניקה זו חוקרים יכולים להבחין בין זחלים הסובלים ממחסור בחמצן לבין אלה עם ליקויים התפתחותיים. פרוטוקול הדוגמה מדגים את ההתקנה עבור בדיקה זו.

דרוזופילה בדיקת מחילה ומנהור: שיטה להערכת היפוקסיה של רקמות בזחלי זבובים

סרטון זה מתאר שיטה פשוטה לכימות תנועת הזבובים ומציג את בדיקת הטיפוס שבוצעה. מבחן טיפוס הזבובים הוא מבחן כללי של תפקוד מוטורי המסתמך על תגובת גיאוטקסיס שלילית.

בדיקת טיפוס זבובים: שיטה לבדיקת תנועה כללית בדרוזופילה מלנוגסטר

Source:Siddarth Gunnala1, Nafisa M. Jadavji2,3,41Department of Biomedical Sciences, Midwestern University, Glendale, AZ, USA2Division of Integrative and Molecular Physiology, Department of Biomedical Sciences, Southern University of Illinois, Carbondale, IL, USA3Department of Child Health, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, Phoenix, AZ, USA4Department of Neuroscience, Carleton University, Ottawa, ON, CanadaThis video demonstrates hypoxia-induced climbing behavior in Drosophila...

Hypoxia-Induced Climbing Behavior of Drosophila melanogaster

האפידרמיס העוברי של עוברי דרוזופילה שלב מאוחר מאוד מספק מערכת vivo בתגובה לניתוח פצע מהיר ויכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות או טיפולי microinjection כימיים לקידום מחקרים בריפוי פצעים לתרגום למודלים של יונקים.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

דוח זה מתאר שיטה למדידת פעילות הזחלים של דרוזופילה באמצעות מוניטור פעילות הדרוזופילה TriKinetics. המכשיר משתמש בקרני אינפרא אדום כדי לזהות תנועות של עד 16 בעלי חיים בודדים. ניתן לנתח נתונים כדי לייצג פרמטרי תנועה כולל קצבים ומיקומי בעלי החיים בתוך תאי הבדיקה.

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

אנו מציגים פרוטוקול למדידת צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . מנתח חילוף החומרים מנוצל עם פרוטוקול מותאם וממוטב. מיקרו-רקמת ריסון הינם המכריעים של פרוטוקול זה, היו עיצבת ויצרת במיוחד לשימוש שלהם ניתוח זה.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

פרוטוקול זה נועד להעריך את הכדאיות של דרוסופילה בכל שלב התפתחותי, מעובר למבוגר. ניתן להשתמש בשיטה כדי לקבוע ולהשוות בין הכדאיות של גנוסוגים שונים או תנאי גדילה.

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

שלמות מכשול הדם במוח. היא קריטית לתפקוד מערכת העצבים בדרוזופילה מלאנוסטר, מכשול המוח בדם נוצר על ידי תאי גלאל במהלך הembryogenesis המאוחרות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיפול בתפקוד ותחזוקה של מחסומי מוח בדם בד. מלאנוגסטר עוברים והזחלים השלישי.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה וחסכונית להערכת רעילות עצבית בזבוב הפירות באמצעות כימות תפקוד לקומוטורי כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים. מטרתו להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של תרכובות פרמצבטיות, גורמים סביבתיים או שינויים גנטיים באמצעות מודל רגיש, ניתן לשחזור וחיובי מבחינה אתית.

ניתוח התנהגותי של תפקוד לקומוטורי ב-Drosophila melanogaster כקריאה לרעילות עצבית

למד לזהות היפוקסיה ברקמות בזחלי Drosophila melanogaster באמצעות מבחן התנהגותי המבוסס על מנהור וחפירה במזון. שיטה זו מסייעת להבחין בין זחלים היפוקסיים לבין מוטנטים אחרים בעלי פנוטיפ דומה.

וזמינותו נובר/למנהור עבור זיהוי של היפוקסיה ב הזחלים דרוזופילה melanogaster

גלה סרטונים נוספים