וזמינותו נובר/למנהור עבור זיהוי של היפוקסיה ב הזחלים דרוזופילה melanogaster

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לזהות זחלי דרוזופילה הסובלים מהיפוקסיה של רקמות למרות היותם ברמות חמצן תקינות. בדרוזופילה ישנן מוטציות רבות המייצרות צמיחה איטית וגרועה, של הזחלים וחלק מהזחלים איטיים. בדיקה זו מזהה בתוך אותה קבוצה של זחלים, אלה הסובלים מהיפוקסיה של רקמות.

בסופו של דבר, בדיקה זו תסייע בזיהוי מוטציות נוספות המייצרות מחסור בחמצן ברקמות באמצעות תהליכים פיזיולוגיים שונים. הרעיון לבדיקה זו עלה מהתצפית שזחלים עם דרכי נשימה פגועות או קנה נשימה הראו שתי התנהגויות מוזרות. התנהגויות חריגות אלה הן כישלון להתחפר במזון במהלך חיי הזחל המוקדמים וכישלון לחפור מנהרה לתוך שכבה רכה יותר בשלב הנדודים.

הגדר את ההכלאות הגנטיות של הבקרה והניסוי בצלחות הטלת ביצים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שמור את הזבובים בחושך לפחות יומיים לפני תחילת איסוף הביצים המתוזמן. לאיסוף ביצים מתוזמן, העבירו את הבוגרים לצלחות אגר ענבים חדשות מעוטרות במריחה טרייה של רסק שמרים מוקדם ביום ואפשרו לבוגרים להטיל ביצים על הצלחות במשך ארבע שעות.

לאחר ארבע שעות מעבירים את הבוגרים לצלחות אגר ענבים טריות. לאחר מכן, דגרו את צלחות האיסוף של ארבע שעות למשך הלילה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. עד למחרת אחר הצהריים, רוב הזחלים יבקעו.

תכננו שיהיו לפחות 50 לכל קבוצת ניסוי. עבור ריצה אחת של הבדיקה, הכינו לפחות חמש לוחות בדיקה לכל קבוצת ניסוי. הוסף 16 גרם אגר זבוב ו -700 מיליליטר מים נטולי יונים על ידי חימום.

הכן ניפגן 17.5 מיליליטר באתנול 95%. מחממים את תמיסת האגר עד להמסה כמעט מלאה. לאחר מכן מוסיפים תמיסת ניפגן לתמיסת האגר ומחממים עד שהאגר נמס לחלוטין.

מצננים את תמיסת האגר לזמן קצר, ואז טוענים צלחות של 10 סנטימטר עם 15 מיליליטר מתמיסת האגר. לאחר ג'ל האגר, הניחו מכסים על הצלחות ותנו להם להתייבש בטמפרטורת החדר למשך כמה שעות או למשך הלילה. אגר נרפא חייב להיות יציב למגע ולהתנגד להתפוררות כאשר חותכים ממנו חתיכות.

לאחר שהאגר נרפא, השתמש בלוח שעם בגודל 1.5 ס"מ כדי ליצור חור מרכזי בג'ל האגר בכל צלחת. ואז ממלאים את החורים בצורה מסודרת במשחת שמרים טרייה. כדי להעביר את הזחלים לצלחת הבדיקה, הכינו כלי פשוט.

כופפו עקומה לקצה מיקרו-מרית פלסטיק וטבלו את הקצה במשחת שמרים כדי שיהיה דביק לזחלים. כעת הרם את זחלי הכוכב הראשונים בנפרד והניח אותם על צלחת האגר קרוב לתלולית המזון. לכל קבוצת ניסוי, הכינו לפחות חמש צלחות, כל אחת עם 10 זחלים.

כדי להבטיח שחזור בין שכפולי הבדיקה, זה קריטי שרק 10 זחלים יונחו על כל לוחית בדיקה. הקפד לבדוק היטב את לוחית הבדיקה כדי לקבוע שזחל אחד, ויחיד, מועבר בכל פעם שאתה מעביר זחל עם קצה המיקרו-מרית. לאחר טעינת צלחת, סמן אותה, כסה אותה ולאחר מכן הנח אותה בחושך כשצד המכסה כלפי מעלה בטמפרטורת החדר.

בדוק כל צלחת מדי יום עד שכל הזחלים מתו או התגלמו. להלן דוגמאות לצלחות לזן מסוג בר ליום השני עד היום השמיני של הבדיקה. ביום השני, הזחלים נקברים במזון ולא מתרחשת מנהור.

חפירת המנהרות מתחילה ביום השלישי ומגיעה למקסימום בין היום החמישי לשמיני, כאשר הזחלים מפסיקים לנדוד ומתגלמים במנהרותיהם. העבירו בזהירות את הגלמים בעזרת מחט מתגרה כפופה לצלחת ענבים ואם תרצו, ספרו כמה גלמים סוגרים. שימו לב להיווצרות הגולם והעריכו את הגלמים לאיתור חריגות.

כדי לדמות את המנהרות בתוך לוחית הבדיקה, ראשית הסר בזהירות והשליך את כל מזון השמרים מהבאר המרכזית של כל צלחת. לאחר מכן הציפו בעדינות כל צלחת במי ברז והשתמשו במברשת צבע רכה כדי לשפשף בזהירות כל פסולת שאותרה על משטח האגר. חתיכות מסוימות של אגר עשויות להתפורר במקומות שבהם המנהור הוא האינטנסיבי ביותר.

ניתן לתקן זאת מאוחר יותר. המשיכו להחליף את המים מספר פעמים והברישו בעדינות את הפסולת עד שהצלחת נקייה לחלוטין. לאחר מכן שטפו את הצלחת במים נטולי יונים, כסו אותה ותנו לה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

חשוב להשתמש בזרימה עדינה של מים ובמשיכות מכחול עדינות לניקוי צלחות האגר כדי שלא תתנתק או תפגע בחלקים מג'ל האגר. למחרת, הכינו תמונת קובץ tiff של הלוח באמצעות רקע שחור כדי להציג את המנהרות כקווים לבנים בהירים. מערכות תיעוד ג'ל עובדות היטב עבור שלב זה.

לאחר מכן, כמת את המנהור בתמונה באמצעות תמונה J עם הכלי הסגלגל, הגדר את ג'ל האגר עד, אך לא כולל, את קצה הפלסטיק של לוחית הפטרי. לאחר מכן החל סף אוטומטי כדי לייצר תמונה הפוכה של הלוחית כך שהמנהרות יופיעו כקווים שחורים. לתיקון אזורים כהים שאינם כוללים מנהרות, השתמשו בדוגם הצבע ובכלי מברשת צבע כדי להלבין אזורים אלה.

לאחר מכן, תחת התפריט הנפתח ניתוח, בחר הגדר קנה מידה ולחץ כדי להסיר קנה מידה. לאחר מכן עבור לחלון הגדר מדידות תחת נתח וסמן אזור והגבל לסף. כעת לחץ על מקש Control עם מקש M כדי לקבל מדידה של האזור השחור בתמונה ביחידת הפיקסלים המייצגת את אזור המנהור.

כדי לכמת מנהור שאבד עקב שחיקת אגר סביב החור המרכזי, בטל את הסימון של גבול לסף. השתמשו בכלי שרביט להגדרת החור המרכזי והקישו Control ועוד M למדידת ערכו בפיקסלים. הפחיתו מערך זה את ערך הפיקסלים של חור בקוטר 1.5 סנטימטר.

הוסף את ההפרש לערך הפיקסלים שהושג בעבר כדי לקבל את ערך הפיקסל הכולל של המנהור. עבור לוחות שבהם האגר החסר משתרע מעבר לטבעת המרכזית של המנהור, יש צורך בצעד נוסף כדי למנוע מהכימות לכלול אזורים מחוץ לאזור המרכזי. השתמש בכלים Color picker ו-Paintbrush כדי להוסיף פס שחור כפי שמוצג כדי להגביל את השטח המכומת.

הבדיקה המתוארת שימשה לחקירת היפוקסיה פוטנציאלית בזחלים עם תפקוד לקוי של הגן הבלתי מתנפח בקנה הנשימה. הגן דוכא RNAi באמצעות כטב"ם Gal4. נעשה שימוש בשני קווי Gal4.

Gal4 חסר נשימה, המתבטא בכל ההתפתחות בכל מערכת קנה הנשימה. או cut(ue)Gal4, המתבטא בעוצמה בחתך קנה הנשימה קטן במהלך חיי הזחל. זחלי הבקרה הכילו אחד מקווי Gal4, אך לא RNAi בלתי מתנפח.

זחלים עם חתך (ue)Gal4 המניעים RNAi לא מתנפח לא היו ניתנים להבחנה מבקרות לאורך כל ההתפתחות הן מבחינת גדילה והן מבחינת התנהגות. עם זאת, דיכוי חזק של RNAi בלתי מתנפח לאורך קנה הנשימה עם blt-Gal4 הביא לכישלון להתחפר בשלב ההזנה ויצר שיעור תמותה גבוה. זחלים אלה הראו גם היעדר מוחלט של מנהרות בשלב הנדודים.

יתר על כן, זחלי הניסוי חסרי הנשימה של Gal4 היו קטנים יותר, דקים יותר ואיטיים יותר מקבוצת הביקורת ונשארו כזחלים זמן רב לאחר שכל הקבוצות האחרות התגלמו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבדוק זחלי דרוזופילה להיפוקסיה של רקמות על ידי ניטור המידה שבה הם מתחפרים בתלוליות המזון שלהם או מנהרה לתוך תשתית רכה. היעדר מוחלט של מנהור הוא אינדיקטור חזק להיפוקסיה של רקמות.