מדידת Endoreduplication על ידי Cytometry זרימה של פקעת מבודד Protoplasts

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להעריך את רמות האנדורדפליקציה בתוך פקעות תפוחי אדמה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי מורפולוגיה של פקעות תפוחי אדמה, כגון השלב ההתפתחותי שבו רקמות פקעת עוברות אנדורדפליקציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תוצאות ברורות בהרבה בהשוואה לתכשירים טיפוסיים לזרימה ציטומטרית.

מי שידגים את ההליך יהיה פרקר ליימביר. סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. לאחר הכנת תמיסות ומאגרים על פי פרוטוקול הטקסט, יש לעקר פקעות תפוחי אדמה על ידי טבילתן באתנול 71% למשך חמש דקות לפחות.

הסר את החומרים הצמחיים מהאתנול ואפשר להם להתייבש באוויר. הכן ותייג צינורות חרוטיים סטריליים של 50 מיליליטר עבור כל דגימה והוסף 15 מיליליטר של תמיסת דגירה פלסמוליזה מעוקרת מסנן או PIS, לכל אחת. באמצעות אזמל מעוקר או דגימת שעם קידוח כסנטימטר מעוקב אחד של הרצון לעקר רקמות.

השתמש באזמל העיקור כדי לקצוץ גס את הרקמה לחתיכות של כשלושה מילימטר מעוקב. ולהעביר את הרקמה לצינור חרוטי המכיל PIS. לאחר מכן דגרו על הרקמה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

כדי ליצור פרוטופלסטים של תפוחי אדמה התחל בהכנה וסינון של כמות מתאימה של תמיסת אנזים או ES עם מניטול מולרי 0.71, שלושה מילי-מולרי סידן כלורי, מילי-מולרי מונופוטסיום פוספט. מגנזיום כלוריד מילי-מולרי אחד, 4% אונוזוקה R-10 צלולאז, 0.8% מאצרוזים R-10, 1% צלולאז המי ו-10 מילי-מולרי MES buffer, pH 5.8. בעזרת פיפטה סרולוגית, שאפו את ה-PIS מהדגימות בצינורות.

הוסף 10 מיליליטר של ה-ES לכל דגימה והפוך את הצינורות פעמיים-שלוש. לאחר מכן דגרו את הדגימות ב-29% צלזיוס ו-180 סל"ד למשך הלילה. ביום השלישי, כדי לקצור ולשטוף את הפרוטופלסטים, הוציאו את הדגימות מהשייקר והניחו להן להתיישב כ -10 דקות.

בעזרת פיפטה סרולוגית, שאפו כמה שיותר מתמיסת ה-ES, והקפידו להימנע מהרקמה המעוכלת. לאחר מכן באמצעות מיקרו פיפטה ותוך כדי החזקת הצינור בזווית, הסר שוב את כל תמיסת ה- ES שנותרה תוך הימנעות מהרקמה המעוכלת. זה קריטי להסיר כמה שיותר מתמיסת הכביסה של הפרוטופלסט כדי למנוע נזק לגרעינים.

החזקת הצינור בזווית עשויה לסייע בהסרת התמיסה תוך השארת הפרוטופלסטים. הוסף 15 מיליליטר PWS לכל דגימה. והפוך את הצינור בעדינות פעמיים-שלוש.

הניחו לפרוטופלסטים להתיישב במשך 10 דקות. לאחר מכן השתמש בפיפטה סרולוגית כדי להסיר את ה-PWS. ומיקרו פיפטה להסרת כל הנוזלים שנותרו.

תוך שמירה על הדגימות על קרח, הוסף 1.5 מיליליטר FCB קר כקרח לכל צינור. לנער בקצרה או מערבול כל דגימה כדי לפרק רקמה מצטברת. חשוב לפרק את גושי רקמת הפקעת כך שה-FCB יוכל לחלחל במלואו לתאים ולשחרר את הגרעינים.

אם יש להוסיף בקרה, החל משלב זה, השתמש בסכין גילוח כדי לקצוץ דק עלה קטן ב-1.5 מיליליטר FCB קר כקרח. דגימות הבקרה צריכות להיות באותה מהירות כמו דגימות הניסוי, רצוי באותו גנוטיפ. הכנס צינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר כשהקצה מנותק ורשת מתכת של 106 מיקרומטר מותכת לתחתית לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר.

לאחר מכן העבירו מיליליטר אחד של מתלה רקמת ה-FCB דרך המסנן. הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת ה-RNA לכל דגימה. לאחר מכן הפוך את הצינורות ודגר אותם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

הוסף 125 מיקרוליטר של תמיסת פרופידיום יודיד או PI שהוכנה בעבר לכל דגימה. הפוך ודגר את הצינורות על קרח למשך 30 דקות. השתמש בדגימות בהקדם האפשרי ותוך שעתיים הימנע מהשפלה.

צור שתי עלילות נקודות באמצעות קנה מידה לוגריתמי של פיזור קדימה לעומת פיזור צדדי ו-PI לעומת פיזור צדדי. צור גם היסטוגרמה עם PI על ציר x. קנה מידה לוגריתמי נדרש כדי להבטיח שכל האירועים יהיו בקנה מידה מכיוון שגרעינים עשויים להיות שונים מאוד בפלואורסצנטיות.

טען צינור של דגימת בקרה ידועה כגון רקמת עלה במבחנה מגנוטיפ דגימה. והתאם את המתח כך שכל האירועים יהיו בקנה מידה. רשום את הערוץ של שיא 2C בדגימת הבקרה.

שיאי ה-2C של דגימות הניסוי צריכים ליפול באותו מיקום. טען דגימת פקעת ניסיונית וודא שוב שכל האירועים הם בקנה מידה. אם נדרשות התאמות, חזור על כרךtagהתאמת המתח של דגימת הבקרה כדי לזהות את הערוץ של פסגות 2C.

שער ידני של גרעיני הפרוטופלסט באמצעות פיזור הצד לעומת עלילת PI. לאחר מכן הגדר את היסטוגרמה PI כך שתציג רק את אזור גרעיני הפרוטופלסט המגודר. אסוף את מספר האירועים הרצוי מכל דגימה.

לעתים קרובות חוקרים משתמשים ב-10,000 אירועים מגודרים לציטומטריית זרימה. עם זאת, 2000 אירועים משמשים כאן לדגימות פרוטופלסט פקעות כדי להכיל יותר דגימות ודגימות עם ריכוזים נמוכים. יצירת פרוטופלסטים נחוצה כדי להשיג תוצאות ציטומטריית זרימה חוזרות מפקעות תפוחי אדמה.

המורפולוגיה הכללית שלה מוצגת כאן. ההפרדה בין ליבה לפרנכימה פרימדולרית מודגמת בקווים שחורים. טבעת כלי הדם, המפרידה בין פרנכימה לקליפת המוח, מסומנת בחץ שחור.

פרוטופלסטים מבודדים צריכים להיות כדוריים וסימטריים כאשר קרום הפלזמה שלם. שימו לב להבדלי הגודל בין פרוטופלסטים של עלים ופקעת, כמו גם להבדלים בגודל בתוך רקמה שעשויים להצביע על רמות שונות של אנדורדופליקציה. איור זה מציג את השונות בתוצאות שאולי נתקלו בה הן בתרשים פיזור ציטומטריית הזרימה והן בהיסטוגרמות.

גרעינים שלמים מראים הפרדה נקייה בין פסגות כדי לכמת את השפע היחסי של תאים, בעוד שדגימות משולבות של פסגות מראות בסיסים רחבים וחופפים. בתרשים הפיזור המתאים, הקופסאות השחורות מציינות שער אירועים גרעיניים עבור היסטוגרמות, ואשכולות האירועים משתקפים ברוחב פסגות ההיסטוגרמה. ניסוי זה המנתח את רמות האנדורדפליקציה או EI מאשר תוצאות קודמות כי רקמת הליבה מציגה EI גבוה יותר מרקמת קליפת המוח.

באופן מפתיע הפרופיל של רקמת הפרנכימה היה דומה לקליפת המוח וגם היה שונה משמעותית מרקמת הליבה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על סטריליות הדגימה עבור שתי הדגירות הראשונות וכן לשמור את הדגימות על קרח ככל האפשר לאחר הליזה של הפרוטופלסטים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מניפולציה גנטית על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו אילו גנים משפיעים על רמות השכפול הפנימי של הפקעת.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ פרוטופלסטים מפקעות תפוחי אדמה ולהכין אותם לזרימה ציטומטרית כדי לחקור את רמות האנדורדפליקציה שלהם. אל תשכח שעבודה עם פרופידיום יודיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון PPE מתאים בעת ביצוע הליך זה.