ויזואליזציה, כימות פוטנציאל בידול Adipogenic תא Mesenchymal עם סמן ספציפי שושלת היוחסין

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ולכמת את ההתמיינות של תאי סטרומה לשושלת אדיפוגנית, באמצעות סמן חלבון ספציפי לשושלת, חלבון קושר חומצות שומן ארבע. זה מושג על ידי בידוד והרחבה של תאי הסטרומה המעניינים. לאחר מכן נקצרים תאי הסטרומה ומצופים לצלחות תרבית סטנדרטיות במבחנה.

לאחר הדגירה של מספר ימים, התאים מטופלים במדיום התמיינות אדיפוגני. התאים מודגרים במשך 14 יום, עם החלפת מדיה קבועה. לאחר ההתמיינות, התאים מקובעים ומוכתמים בנוגדנים כנגד חלבון קושר חומצות שומן 4.

מיקרוסקופ אימונופלורסנט אוטומטי בעל תוכן גבוה משמש לצילום תמונות של התאים המסומנים בצלחות המיקרובאר. לאחר מכן מכמתים את הבידול, באמצעות תוכנה מיוחדת לניתוח תמונה. בניגוד לשיטות המסורתיות למדידת התמיינות אדיפוגנית באמצעות צבעים כגון שמן אדום O, הבדיקה המתוארת בסרטון זה משתמשת בנוגדנים כנגד חלבון ספציפי לשושלת, חלבון קושר חומצות שומן ארבע, כדי לאשר התמיינות אדיפוגנית.

בכך, שיטה זו מכמתת שינויים בביטוי גנים התואמים להתמיינות אדיפוגנית. בדיקה זו מסוגלת לספק שפע של מידע, כולל אחוז התאים הממויינים, עוצמת האות הקרינה לכל תא ושינויים במורפולוגיה של התא. היכולת לנתח מאפיינים מרובים מאפשרת לזהות שינויים עדינים פוטנציאליים בהתמיינות בתגובה לטיפולים שונים.

לבדיקה זו יש גם יכולת משיכה גבוהה, מה שהופך אותה לאידיאלית עבור יישומי סינון תרופות גבוהים. השעיית תאים במדיום ASC שלם, שהוא חומר בסיסי DMEM/F-12, בתוספת סרום בקר עוברי 10%, GlutaMAX ואנטיביוטיקה. פיפטה לצלחת תרבית של 96 בארות, ב -5000 תאים לבאר.

יש צורך בשמונה בארות לכל תורם. ארבע בארות מקבלות מדיום בקרה, בעוד השאר מקבלות מדיום התמיינות. כל באר רביעית של כל טיפול תשרת בקרה ראשונית של צומת.

דגרו על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות, לחים בתנאי אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני למשך ארבעה ימים. זאת כדי לאפשר לתאים לגדול למפגש בכל באר. ביום הרביעי, הוציאו את הצלחות מהחממה.

הסר מחצית מהמדיה מכל באר. הוסף נפח שווה של מדיום ASC שלם, או מדיום התמיינות אדיפוגני, המתווסף לאינסולין, איזובוטיל מתילקסנטין, דקסמתזון ואינדומתזון. צלחת דגירה ב-37 מעלות, לחה בתנאי אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני.

פרק הזמן הנדרש לבידול מספיק הוא 14 יום. במהלך תקופה זו, חדש את המדיה על ידי ביצוע החלפת מדיה כל יומיים-שלושה. לאחר ההבחנה, הוציאו צלחות מהחממה.

פיפטה בזהירות את כל המדיה מכל באר. תקן תאים על ידי הוספת מתנול קר כקרח. דוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

הסר את המתנול ולאחר מכן שטוף עם מי מלח עם Tris-buffering. חסום על ידי הוספת 0.25% של חוסם קזאין. דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

יש להסיר קזאין ולאחר מכן לשטוף עם מי מלח עם טריס. הכן תערובת נוגדנים ראשונית על ידי דילול נוגדן נגד FABP4 פי 200 במאגר דילול הנוגדנים. הוסף תערובת לכל הבארות, למעט אלה השמורות כבקרה ראשונית של הצומת.

הוסף מאגר דילול נוגדנים לבארות אלה במקום זאת. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעם אחת עם מי מלח עם Tris-buffering.

מוציאים, מוסיפים מי מלח טריים עם טריס ומדגרים במשך חמש דקות על הנדנדה. חזור על תהליך זה פעמיים. הכן תערובת נוגדנים שנייה על ידי דילול אנטי-ארנב Alexa 488 נוגדן שני פי 200 במאגר דילול נוגדנים.

הוסף DAPI, שמסמן גרעיני תאים, בדילול סופי של 1 עד 2000. מוסיפים את התערובת לכל הבארות, ועוטפים את הצלחת בנייר כסף למניעת פוטוהלבנה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר הדגירה יש לשטוף תאים עם TBS, ועוד שתי שטיפות של 15 דקות על הנדנדה. הסר את כל המאגר מהבארות והוסף חיץ אחסון, בתוספת 0.4 מיליגרם למיליליטר תימרוסל, כדי למנוע צמיחת חיידקים. מכונת סינון בעלת תוכן גבוה המצוידת בבמה אוטומטית, יעדי מיקוד ומסננים, משמשת להדמיית הבדיקה הביולוגית הזו.

בדוק שהמסננים הנכונים נמצאים במקומם. נקה את תחתית הצלחת לאיכות הטובה ביותר. טען את הצלחת לתוך הבמה עם A1 הממוקם בפינה השמאלית העליונה.

באמצעות אשף רכישת הלוחות, רשום מידע חיוני על הניסוי, כגון מספר לוחית, הגדלה, תאריך, תנאי ניסוי ופרטי תיוג. בחר את סוג צלחת המיקרווול המשמשת. משתמשים יכולים לבחור בארות ואת מספר האתרים שיירכשו.

בחר את כל הבארות להדמיה על ידי הדגשת הרשת. העבר את הבמה לבאר הבהירה ביותר. בחירת הבאר הבהירה ביותר תבטיח שכל התמונות יתקבלו עם ערכי פיקסל-אפור הנמצאים בטווח ליניארי, ולכן ביחס ישר לעוצמת הצביעה.

אם שלב זה לא מבוצע, תמונות שצולמו בבארות בהירות יותר עשויות להיות רוויות יתר על המידה. בחר את שילובי הערוצים, זמן החשיפה ופרמטרי היסט Z המתאימים לניסוי. המסננים המשמשים להדמיה של FABP4 ו-DAPI תואמים לתוויות הספציפיות המשמשות להמחשת צביעה.

Alexa 488, שמרגש ב-480 ננומטר ופולט ב-560 ננומטר, שימש להדמיית FABP4. וצבע ה-DAPI, שמרגש ב-360 ננומטר ופולט ב-460 ננומטר, שימש להמחשת גרעיני התאים. עבור צלחות המסומנות בשמן אדום O, טיפות שומן הודגמו עם אור בהיר המועבר על ידי דלק.

ותווית ה-Oil Red O הודגמה גם היא עם פלורסנציה, מכיוון שהיא מרגשת ב-575 ננומטר ופולטת ב-630 ננומטר. כאשר כל ההתקנה הושלמה, הבדיקה הביולוגית מוכנה לרכישה. התמונה נשמרת אוטומטית בשרת המקוון, כדי לאפשר גישה קלה מרחוק לתמונות.

ערכת התמונות המלאה המאוחסנת בשרת המקוון נגישה באמצעות תוכנית שולחן העבודה המרוחק. לאחר מכן ניתן לנתח את התמונות באמצעות תוכנת MetaXpress. אפליקציית ניקוד התאים מאפשרת למשתמשים לבחור אורך גל לזיהוי כל הגרעינים בשדה, כגון DAPI, במקרה זה.

ניתן להשתמש באורכי גל עוקבים כדי לזהות סמן חיובי בגרעין, בציטופלזמה או בשני מיקומי התאים. חלבון קושר חומצות שומן 4, או FABP4, הוא סמן לשושלת אדיפוגנית. הביטוי של FABP4 ממוקם בגרעין ובציטופלזמה של אדיפוציטים מובחנים.

בבדיקה ביולוגית זו, אנו מנתחים ביטוי FABP4, באמצעות מודול ניקוד התאים. ראשית, זהה גרעיני תאים באמצעות ערוץ DAPI, עם פרמטרים המוגדרים על ידי המשתמש לגודל ועוצמת האות מעל הרקע. זהה אות FABP4 באמצעות ערוץ רגל C, ופרמטרים המוגדרים על-ידי המשתמש עבור גודל ועוצמת האות מעל הרקע.

בבדיקה ביולוגית זו, טיפות שומן עם תווית שמן-אדום-O, אשר מתפרצות בטווח של 560 ננומטר, נותחו באמצעות מודול פחית MetaXpress, Transflour. אלגוריתם ניתוח זה מזהה תאים כוללים באמצעות גרעינים המסומנים ב-DAPI, העומדים בקריטריונים של גודל התא ועוצמת הצביעה שצוינו על ידי המשתמש. המשתמש גם מציין את הגודל והעוצמה של בורות, שבמקרה זה מזהים טיפות שומן בקרבת גרעיני התא.

מידע לגבי גודל טיפות השומן, עוצמת הצביעה, מספר לתא, נרשם על ידי בדיקת Transflour. חשוב לציין שתווית ה-Oil Red O אכן דלפה החוצה, או התמוססה מחלק מהתאים, מה שעלול להגביל ולבלבל את הכמות האמיתית של ההתמיינות המתרחשת. תמונות מייצגות של מעבר מוקדם ומאוחר, בקרה ותאים מובחנים, המסומנים ב-DAPI, כתם גרעיני ו-FABP4 מוצגות לצד תמונות מיזוג ופילוח.

תמונות הפילוח מציגות תאים מובחנים עם שכבת-על ירוקה ותאים לא ממוינים עם שכבת-על אדומה. אחוז התאים המבטאים FABP4 שימש כמדד לפוטנציאל ההתמיינות האדיפוגנית. עלייה משמעותית בתאים המבטאים FABP4 נצפתה עם התמיינות אדיפוגנית בתאי מעבר מוקדמים ומאוחרים.

תאי מעבר מוקדמים הראו עלייה משמעותית בהתמיינות מאשר תאי מעבר מאוחר. התמונות המייצגות של DAPI ו-Oil Red O מוצגות לצד תמונות מיזוג ופילוח. תמונות הפילוח מתארות את כל הגרעינים עם שכבת על ירוקה, וטיפות שומן מוכתמות בצבע אדום-O עם שכבת על אדומה.

האזור של צביעת שמן אדום O לכל תא שימש כמדד לפוטנציאל התמיינות אדיפוגנית. עלייה משמעותית באזור צביעת שמן אדום O נצפתה עם התמיינות אדיפוגנית. תאי מעבר מוקדמים הראו שטח גדול יותר של כתם O אדום שמן לתא, בהשוואה לתאי מעבר מאוחרים.

כתם מערבי בוצע כדי לנתח את רמת ביטוי החלבון FABP4 של ASCs מובחנים במעבר מוקדם ומאוחר. ניתוח כמותי למחצה של הצפיפות האופטית של רצועות FABP4 כיחס לבקרת העמסת החלבון הכוללת הראה כי התיוג החיסוני של FABP4 גדל באופן משמעותי בתאים מובחנים במעבר מוקדם, ובמידה פחותה במעבר מאוחר. על ידי צפייה בסרטון זה, הייתם אמורים לקבל הבנה כיצד להבדיל תאי גזע לשושלת אדיפוגנית, כיצד לבצע צביעה אימונופלורסצנטית באמצעות סמן ספציפי לגן אדיפוגני, חלבון קושר חומצות שומן 4, ולבסוף, כיצד לדמות ולנתח את כל המאפיינים המורפולוגיים הרלוונטיים מתאים שהם חיסוניים עבור חלבון קושר חומצות שומן 4.

אני מקווה שתמצא את הסרטון הזה שימושי למחקר שלך.