מיקרוסקופיה קונפוקלית מגלה התא קולטן משטח צבירת דרך התמונה המתאם ספקטרוסקופיה
2 באוגוסט 2018
נוגדנים לאגד היעד הקולטנים על פני השטח של התא יכול להתייעץ קונפורמציה והשינויים קיבוץ באשכולות. שינויים דינמיים אלה יש השלכות על אפיון פיתוח תרופות בתאי המטרה. פרוטוקול זה מנצל מיקרוסקופיה קונפוקלית וספקטרוסקופיה של המתאם תמונה דרך ImageJ/פיג'י לכמת את מידת קולטן קיבוץ באשכולות על פני התא.
המטרה הכוללת של פרוטוקול ספקטרוסקופיה זה של מתאם תמונה היא לספק מתודולוגיה נגישה לכימות אירועי אשכולות המתרחשים על פני התא. נוגדנים הנקשרים לקולטנים על פני התא יכולים להעניק אישור ושינויים באשכולות. ניתוחים של תהליכים דינמיים אלה חשובים לאפיון מטרות התרופות.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מתודולוגיה נגישה לכימות אירועי אשכולות על פני התא באמצעות מכשירי הדמיה נגישים בקלות. כדי להתחיל, זרע 10,000 תאי קרצינומה אפידרמואידים A431 לכל באר של שקופית הדמיה בת שמונה חדרים. למחרת, הוסף 100 ננוגרם למיליליטר של ליגנד EGF באופן מיידי לתאים על מנת לעורר צבירת קולטני EGF.
דגרו את התאים עם הליגנד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני קיבועם. לאחר מכן, עקוב אחר פרוטוקול האימונוציטוכימיה וההדמיה הקונפוקלית בפרוטוקול הטקסט הנלווה, תוך שימת לב רבה להגדרות המשמשות במהלך האיסוף, וטען את מערכי הנתונים שנרכשו לפיג'י. יש להימנע מרוויית יתר.
התמונות הסופיות חייבות לכלול גדלי פיקסלים של פחות מ-1 מיקרון בריבוע. בנוסף, לכוד משטח שטוח על המשטח האפיקלי או הבסיסי וכן אזור נטול תאים לנורמליזציה מאוחרת יותר של הדגימה. התחל בזיהוי אזור המעניין של קרום פני התא האפיקלי או הבסיסי בתמונה הראשונה.
בחר גודל פיקסל של 2 עד n בטווח של 256 על 256, 128 על 128 או 64 על 64. לאחר מכן, עבור לתפריט התמונה ובחר שכפל. לאחר מכן, עבור לניתוח, וירד למדידות.
חשב את העוצמה הממוצעת של אזור העניין שנחתך. כעת, זהה אזור רקע באותו גודל מהתמונה המקורית. שכפל אותו כמו קודם.
ולחשב את העוצמה הממוצעת של אזור העניין שנחתך ברקע. לאחר מדידת אזור העניין והרקע, עבור אל תהליך ובחר מחשבון תמונה. מקם את אזור העניין כתמונה 1 ואת תמונת הרקע כתמונה 2, ובחר החסר כפעולה.
לאחר מכן, עבור לתפריט התהליך. רדו אל FFT ובחרו FD Math. בתיבת הדו-שיח מתמטיקה FFT, בחר הזן את התמונות כפי שמוצג כאן והגדר את הפעולה למתאם.
ודא שהטרנספורמציה ההפוכה מופעלת. נרמל את התמונה המתקבלת על ידי בחירת תהליך, גלילה מטה למתמטיקה, בחירה באפשרות חלוקה והזנת המספר הכולל של פיקסלים בתיבת הדו-שיח. לאחר מכן, נרמל שוב על ידי חלוקה בעוצמה הממוצעת של השטח החתוך המנורמל בריבוע.
לאחר מכן, צייר קו באמצעות פונקציית התפשטות הנקודה. שרטט את הפרופיל של קו זה כדי לחשב את ערך השיא על ידי מעבר לניתוח ובחירת פרופיל עלילה. חשב את האשכולות לכל שטח אלומה על ידי העברת ערך השיא לגיליון אלקטרוני.
לאחר מכן הגדר את האשכולות לכל שטח אלומה שווה לאחד מעל ערך השיא מינוס אחד. על מנת לעבד את התמונות באצווה, מומלץ ליצור מאקרו פיג'י. זה מאפשר ניתוח עקבי ומהיר של תמונות קונפוקליות מרובות לניתוח ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה.
כדי ליצור מאקרו עבור זרימת העבודה של ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה, הגדר את התוכנית להקליט כל פקודת תפריט בפרוטוקול. לשם כך, עבור אל יישומי plug-in, למטה אל marcos, ובחר הקלט. לאחר מכן, חזור לחלון הראשי ועבור על הפרוטוקול המתואר בסעיף הקודם של סרטון וידאו זה.
בסיום, חזור לחלון המאקרו ובחר צור כדי ליצור מאקרו. לאחר מכן, בחלון עריכת המאקרו, הקפד לבחור את השפה כמאקרו LJ1. אם לא נבחר, התוכנית לא תוכל לפעול.
לבסוף, שמור את המאקרו. פונקציית ההעברה האופטית של מיקרוסקופ מבטיחה שאפילו עצמים בגודל מולקולרי יופיעו כתמונות בין 200 ל-300 ננומטר במישור ה-XY. על ידי הדמיית חרוזי פרסין ברזולוציה נמוכה באותו אופן כמו תאים כמתואר בפרוטוקול זה, ניתן לחשב את שטח פונקציית ההתפשטות הנקודתית של המיקרוסקופ.
תמונות אלה מייצגות תאי קרצינומה אפידרמואידים A431 מגורים ובלתי מדומים המסומנים בנוגדנים ראשוניים של צטוקסימאב המכוונים לקולטן EGF על פני התא. הקופסאות הצהובות מייצגות קרום תא המכיל אזורי יבול עם מידות פיקסלים של 64 על 64. תמונות אלו שימשו לביצוע ניתוח ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה.
לאחר נורמליזציה של פונקציית המתאם האוטומטי, ניתן למדוד את פונקציית התפשטות הנקודה באמצעות כלי הקו. הפרופיל של פונקציית קו זו משורטט כדי לזהות את ערך השיא. באמצעות שיטות אלה, גירוי ה-EGF נצפה כגורם לירידה של פי 2.56 באשכולות EGFR שזוהו לאזור אלומה בהשוואה לתאים לא מגורים.
לאחר השליטה, ניתוח התמונות הקונפוקליות שלך ייקח רק כמה דקות לכל תמונה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לאסוף שכפולים מרובים של כל מצב ניסוי באמצעות ההגדרות המתוארות בפרוטוקול זה. בעקבות הליך זה, ניתן להרחיב את ספקטרוסקופיית מתאם התמונה כדי לחקור את השינויים הזמניים של אירועי אשכולות בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ זמן-lapse.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור מצבי צבירה מסדר גבוה יותר באמצעות ICS הלבנת פוטו תוך לוקליזציה משותפת של שני חלבונים מבוססי ממברנה באמצעות מתודולוגיות ספקטרוסקופיה של מתאם צולב תמונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחשב את מצב האשכולות של מולקולת פני התא המעניינת שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לכימות של אשכולות קולטנים על פני התא באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם תמונות. הטכניקה חיונית להבנת אפיון מטרות תרופתיות.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- פרמקולוגיה
רקע
- נוגדנים יכולים לגרום לשינויים קונפורמטיביים בקולטנים על פני התא.
- אשכולות קולטנים חשובים לפיתוח תרופות.
- ספקטרוסקופיית מתאם תמונות מאפשרת ניתוח מפורט של תהליכים אלו.
- טכניקות הדמיה נגישות מאפשרות יישומים מחקריים רחבים יותר.
מטרת המחקר
- כימות אירועי אשכולות על פני התא.
- לספק פרוטוקול אמין לחוקרים.
- לשפר את ההבנה של הדינמיקה של הקולטנים במיקוון תרופתי.
שיטות ששימשו
- מיקרוסקופיה קונפוקלית
- ספקטרוסקופיית מתאם תמונות
- שימוש בתוכנת ImageJ/FIJI
- זריעת תאים וגירוי עם ליגנד EGF
תוצאות עיקריות
- כימות של אשכולות קולטנים הושג.
- הוכחו ההשפעות של EGF על צבירת קולטנים.
- סופקה מתודולוגיה ברורה למחקרים עתידיים.
- הודגשה החשיבות של הדינמיקה של הקולטנים בפיתוח תרופות.
מסקנות
- הפרוטוקול יעיל לחקר אשכולות קולטנים.
- שיטות הדמיה נגישות יכולות לקדם מחקר על מטרות תרופתיות.
- הבנת הדינמיקה של הקולטנים היא חיונית ליישומים פרמקולוגיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantifying receptor aggregation on the cell surface provides critical insights into target engagement and mechanism of action for antibody-based therapeutics. This methodology enables preclinical assessment of receptor dynamics, supporting target validation and lead optimization by linking ligand-induced clustering to functional outcomes. Accessible confocal-based image correlation spectroscopy offers a scalable approach to de-risk therapeutic candidates through quantitative, reproducible measurements of membrane protein organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypothesis by quantifying ligand-induced receptor clustering as a functional readout of target engagement.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, reproducible assessment of receptor aggregation states using widely available confocal microscopy.
- Predictive Value: Provides quantitative data on receptor clustering that informs target confidence and portfolio triage decisions in early discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline receptor clustering metrics under controlled conditions.
- Reproducibility: Delivers quantitative, normalized outputs suitable for assay standardization and cross-laboratory comparability in target validation workflows.
- Scalability: Enables high-throughput analysis via Fiji macro automation, supporting consistent evaluation of compound effects on receptor dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses EGFR in A431 cells as a disease-relevant system to model receptor aggregation mechanisms applicable to oncology targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery observations with preclinical validation by quantifying receptor dynamics that correlate with internalization and signaling outcomes.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic effects stem from receptor aggregation, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead identification, providing quantitative receptor clustering data that informs hit-to-lead progression and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring ligand-induced changes in receptor organization as a direct functional output of target modulation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts on receptor clustering that enable reliable comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Analytics: Generates normalized cluster density measurements per beam area, enabling statistical comparison of aggregation states under stimulated vs. basal conditions.
- Translational Research: Connects in vitro receptor dynamics to preclinical relevance by modeling EGFR aggregation mechanisms observed in tumorigenic cell lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline via Fiji macros, allowing consistent application across multiple targets and experimental settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct quantification of receptor clustering events.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined imaging parameters, normalization protocols, and automated macro-based analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target engagement metrics to functional receptor aggregation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on receptor dynamics that inform advancement decisions in preclinical pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, fluorescent immunocytochemistry, and image analysis using Fiji/ImageJ.
- Dependent on access to confocal laser scanning microscopes with appropriate laser lines and detectors for fluorophore excitation.
- Necessitates standardization of cell seeding density, ligand stimulation timing, and imaging settings across experimental replicates.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different receptor systems, cell types, or fluorescent labels beyond EGFR and cetuximab.
- Limited to fixed-cell analysis in this protocol; temporal dynamics in live cells would require additional validation and optimization for time-lapse applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Calculation of Image Correlation Spectroscopy
3:43
Batch Processing of ICS Datasets and Calculation of the Microscope s Beam Area
4:59
Results: Image Correlation Spectroscopy Detects Clusters on the Cell Surface of Adherent Cancer Cells
5:55
Conclusion
