המערכת האקולוגית פרוטוקולים פבריקציה נוספת (EcoFAB) להקמת מערכות אקולוגיות מעבדה שנועדה ללמוד אינטראקציות צמח-חיידק
10 באפריל 2018
מאמר זה מתאר מפורטת פרוטוקולים עבור ייצור המערכת האקולוגית של התקנים (EcoFABs) המאפשרים את הלימודים של הצמחים והאינטראקציות צמח-חיידק בתנאי מעבדה מבוקרת מאוד.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להגדיר גישות סטנדרטיות לבניית מערכות אקולוגיות של צמחים במודל פשוט, הנקראות EcoFABs, המאפשרות ניסויי מעבדה מבוקרים ומשוכפלים כדי לחקור אינטראקציות של חיידקי צמחים שניתן לבחון עוד בשטח. השיטה הזו יכולה לשמש לחקר אינטראקציות של מיקרואורגניזמים של צמחים בתוך סביבות מבוקרות, מה שמאפשר לנו לקבל תובנות מכניסטיות מפורטות על התפקודים של מיקרו-ביום כדי לאפשר לנו לרתום אותן לחקלאות בת-קיימא. עזרנו לתכנן את ה-Eco-FAB הראשון הזה, המשתמש במגוון טכנולוגיות הדפסה תלת-ממדיות זמינות ולעקר את תאי הגידול של הצמחים המאפשרים הן תמונות ברזולוציה גבוהה ללא הסחות דעת והן ניתוח כימי.
מכשיר ה-Eco-FAB שפותח כאן מתאים היטב לניתוח אינטראקציות של חיידקי צמחים מכיוון שהוא משלב ניתוח של מורפולוגיה של שורשים והדמיה ספקטרוסקופית מסה. לאחר בניית תבניות Eco-FAB, באמצעות הדפסת תלת מימד על פי פרוטוקול הטקסט, במיכל חד פעמי של ליטר אחד, מערבבים 40 מיליליטר בסיס אלסטומר סילוקסן עם נפחים שונים של חומר ריפוי, בהתאם לניסוי. הנח את המיכל בתא ואקום למשך 30 דקות לפחות כדי להסיר בועות אוויר מתערובת האלסטומר.
לאחר מכן, הסר את התערובת ושפך אותה לתבנית הפלסטיק המודפסת בתלת מימד המורכבת. על מנת ליצור שכבת PDMS אחידה, יש להסיר בזהירות בועות אוויר. השתמש באוויר דחוס כדי לפוצץ שאריות אוויר לאחר העברת התערובת לתבנית.
שמור את התבנית על גוש חימום בחום של 85 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. הניחו לתבנית להתקרר במשך חמש דקות. לאחר מכן, משוך בעדינות את התוספת מהתבנית, והשתמש בסכין שירות כדי להפריד לאט את ה-PDMS ממסגרת היציקה.
לחץ על בסיס התבנית עם PDMS כלפי מעלה מחוץ למסגרת היציקה. לאחר מכן, השתמש בסכין או בכלים אחרים כדי להפריד בעדינות את שכבת ה-PDMS מבסיס התבנית בקצוות, ולקלף אותה לאט לאט ממשטח התבנית. באמצעות מחט קהה בגודל 15, צור תעלת כניסה על שכבות ה-PDMS על ידי יצירת חורים של 1.6 מילימטר בחלק זה.
לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לקצץ את הקצוות של שכבות ה-PDMS. כדי לחבר לצמיתות את שכבות ה-PDMS לשקופיות המיקרוסקופ, השתמש במתנול כדי לשטוף את הצד המקשר של שכבת ה-PDMS בשקופית מיקרוסקופ בגודל 7.6 על חמישה סנטימטרים, ולאחר מכן לפוצץ אותן עם אוויר דחוס או אקדח חנקן טהור במיוחד. הנח את שקופית המיקרוסקופ ושכבת ה-PDMS לתוך מנקה פלזמה כשדפנות ההדבקה שלהם פונות כלפי מעלה.
סגור את החדר ואת שסתום האוורור של הגז. לאחר מכן, הפעל את הוואקום ושאב את החדר למשך דקה אחת. הפעל את מתח מחולל הפלזמה, והעבר את תדר הרדיו, או רמת ה- RF, לגבוה למשך דקה אחת.
לאחר מכן, כבה גם את משאבת הוואקום וגם את כוח הפלזמה, ואוורר את החדר לאטמוספירה. הוצא את שקופית המיקרוסקופ ושכבת ה-PDMS מתא הפלזמה, ולחץ במהירות על כל ארבעת הקצוות של שכבת ה-PDMS על השקופית בלחץ אחיד. ודא שהאזור הסגלגל המרכזי, שהוא תא השורש, אינו נוגע בשקופית.
בעזרת מים טהורים במיוחד, שטפו את מכשירי Eco-FAB. הנח התקן Eco-FAB אחד במיכל Eco-FAB והוסף 70% אתנול עד שהמכשיר שקוע. לאחר מכן, סגור את מכסה המיכל ונער אותו בעדינות כדי להרטיב את כל המשטחים בפנים באתנול, וודא שתא גידול השורשים של מכשיר Eco-FAB מלא באתנול, עם מעט מאוד בועות אוויר או ללא בועות אוויר.
לאחר דגירה של המכשירים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, שפכו את האתנול 70% והחליפו אותו ב-100% אתנול. לאחר מכן, דגרו על המכשירים למשך חמש דקות. לאחר הדגירה, מסננים את האתנול ומשאירים את ה-Eco-FAB המעוקר במכסה זרימה למינארי למשך 16 שעות כדי לייבש אותו לחלוטין.
אם זמין, עקר את המערכת על ידי הדלקת אור ה-UV במכסה המנוע למשך שעה. כדי לבצע עיקור זרעים ונביטה, יש להשרות את הזרעים באתנול 70% למשך שתי דקות. לאחר מכן, בעזרת פיפט, הסר את האתנול והשתמש במים סטריליים כדי לשטוף את הזרעים שלוש פעמים.
לאחר מכן, יש להשרות את הזרעים בתמיסת אקונומיקה של 10% למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את תמיסת האקונומיקה, והשתמש במים סטריליים כדי לשטוף היטב את הזרעים שלוש פעמים. לאחר השטיפה, הוסיפו מים סטריליים לזרעים, ודגרו על הצינור בארבע מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים.
מורחים את הזרעים באופן שווה על 0.5 Murashige ו-Skoog, או מדיום MS, עם 0.6% ויטאגל. ובעזרת סרט מיקרופור, אטמו את הצלחות. לאחר מכן, גדלו את הצמחים לאורך שורש של כחמישה מיליליטר.
כדי להעביר את השתילים ל-Eco-FABs, באמצעות מזרק סטרילי או מיקרופיפט ומים סטריליים, שטפו את תא השורשים של מכשיר Eco-FAB שלוש פעמים, ולאחר מכן מלאו את תא השורשים במדיום הגידול המעניין, כגון מדיום 0.5 MS. כעת, הכנס בזהירות שתיל בודד למאגר הצמחים של מכשיר Eco-FAB. חשוב שהשתילים יועברו בזהירות מהצלחת ל- Eco-FAB כדי שהשורשים לא יישברו.
הוסף שלושה מיליליטר מים סטריליים למיכל, הימנע ממכשיר Eco-FAB. זה יגביר את הלחות ויפחית את אידוי המדיום מתא השורש. לאחר מכן, סגור את המיכל והשתמש בסרט מיקרופור כדי לאטום את המכסה.
הנח את ה-Eco-FAB בחממת צמחים, או השתמש במערכת התאורה Eco-FAB בסביבת טמפרטורה מבוקרת המתאימה לגידול הצמח המתאים. לאחר מכן, הגדר את החדר ל -24 מעלות צלזיוס. לבסוף, בצע פרופיל מטבוליט וספקטרומטריית מסה, על פי פרוטוקול הטקסט.
נתונים אלה מראים Aaabidopsis thaliana, brachypodium distachyon ו-panicum virgatum הגדלים ב-Eco-FABs. גם הדיקו וגם המונוקוט נמצאו כעומדים בשלבי הרבייה שלהם ב-Eco-FAB. שתילים אלה מייצגים קבוצה של דיסטצ'יון ברכיפודיום בן 14 יום הגדל בתווך הידרופוני, כמו גם חול ואדמה בתוספת מדיום הידרופוני ומים, בהתאמה.
שכבת המצע הדקה והמוצקה ותאי גידול השורשים מאפשרים לאור לחדור דרכה להדמיה מיקרוסקופית של מערכות שורשים. כאן, שתיל דיסטצ'יון ברכיפודיום הועבר למכשיר Eco-FAB, ומבנה השורש שלו תועד על ידי מצלמה בתוך מצלמת ג'ל ביורד. כימות שטח השורשים הכולל במהלך שלושה שבועות הראה עלייה הדרגתית בשלב המוקדם, ואחריה מגמת צמיחה ליניארית עד הסוף.
באיור זה, Eco-FAB המכיל את הריזובקטריות המעודדות צמיחת צמחים, pseudomonas simiae, WCS417 נוסף למערכות שורשי הצמח ב-10 עד שישית תאים לצמח. חיידקי WCS147 התיישבו על פני השטח של כל מערכות השורשים עם חיידקים מרוכזים סביב אזורי קצות השורש. כאשר מרעננים חומרי גידול ואיסוף הפרשות שורש מ-Eco-FABs, חשוב לזכור לעבד את כל העבודה במכסה מנוע סטרילי כדי למנוע זיהום.
ניתן לייצר התקני Eco-FAB גם באמצעות אטם פיזי הפיך על ידי שימוש במהדק מודפס בתלת מימד או על ידי שינוי הצמיגות של ה-PDMS. זה מאפשר שימוש במצעי גידול מוצקים ובהדמיה ספקטרוסקופית מסה ישירה. לאחר פיתוח Eco-FAB, מערכת זו תאפשר לחוקרים ברחבי העולם להשתמש במערכות אקולוגיות של מודלים מעבדתיים אלה כדי לחקור אינטראקציות של מיקרואורגניזמים של צמחים באמצעות טכנולוגיות ביולוגיה והדמיה של מערכות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר מערכת Eco-FAB, כמו גם את היישומים הרחבים שלה במחקרי מערכות אקולוגיות. אנו מקווים שעיצוב Eco-FAB זה יאפשר למדענים אחרים להשיג את המטרות המדעיות הספציפיות שלהם. חשוב מכך, אנו מקווים שמדענים אחרים יתבססו על העיצוב הזה של Eco-FAB ויהפכו אותו לטוב יותר, וישתפו אותו עם מדענים אחרים, כך שכקהילה, נוכל לבנות את המערכות האקולוגיות המעבדתיות האלה כדי לאפשר לנו להבין טוב יותר אינטראקציות בין מיקרואורגניזמים של צמחים.
אל תשכח שעבודה עם חיידקים וחדים עלולה להיות מסוכנת ביותר, וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקולים מפורטים לבניית EcoFABs, המאפשרים מחקרים על אינטראקציות צמחים ומיקרובים בתנאי מעבדה מבוקרים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אינטראקציות צמח-מיקרוב
- ייצור מערכות אקולוגיות מבוקרות
- פיתוח פרוטוקול מעבדה
רקע
- EcoFABs הם מערכות אקולוגיות מודליות פשוטות המתוכננות לניסויים במעבדה.
- הם מאפשרים מחקרים מבוקרים ומשוכפלים של אינטראקציות צמח-מיקרוב.
- השיטה שמה לה למטרה לספק תובנות מכניסטיות לתפקודי המיקרוביום.
- שימוש בטכנולוגיות הדפסה תלת-ממדית משפר את העיצוב של המכשירים הללו.
מטרת המחקר
- להגדיר גישות סטנדרטיות לבניית EcoFABs.
- לחקור אינטראקציות צמח-מיקרוב בסביבה מבוקרת.
- לאפשר בדיקה נוספת של הממצאים בתנאי שדה.
שיטות ששימשו
- בניית תבניות EcoFAB באמצעות הדפסה תלת-ממדית.
- הכנה ועיקור תאי גידול צמחים.
- פרוטוקולים לעיקור זרעים ונביטה.
- פרופיל מטבוליטים וספקטרומטריית מסה לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- גידול מוצלח של מיני צמחים שונים ב-EcoFABs.
- ניתוח מפורט של מורפולוגיה של שורשים ואינטראקציות.
- הדגמה של התועלת של EcoFAB לצילומים ברזולוציה גבוהה.
- תובנות לגבי תפקיד המיקרוביום בחקלאות בר-קיימא.
מסקנות
- EcoFABs מספקים פלטפורמה חזקה לחקר אינטראקציות צמח-מיקרוב.
- הפרוטוקולים שהוקמו ניתנים ליישומים על מגוון מיני צמחים.
- הממצאים יכולים לתרום להתקדמות בתחום הפרקטיקות החקלאיות הבר-קיימא.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
EcoFABs provide a standardized, reproducible platform for mechanistic studies of plant-microbe interactions under controlled laboratory conditions. This enables de-risking of target validation in agricultural biotechnology by clarifying functional roles of microbiomes in plant health and stress response. The system supports predictive confidence in lead identification for microbiome-based bioinputs through dynamic monitoring of root exudates, microbial localization, and plant growth phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by manipulating microbiome composition, including mutant strains, to assess causal effects on plant phenotypes.
- Operational Value: Supports functional target validation through controlled addition of plant growth promoting rhizobacteria such as Pseudomonas simiae WCS417 and quantification of colonization patterns.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking microbial interventions to measurable outputs like root morphology, exudate composition, and growth kinetics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling sterile, reproducible mounting of seedlings and controlled media exchange in flow-through devices.
- Quantitative Outputs: Generates standardized metrics including total root area over time, microbial localization via mass spectrometry imaging, and exudate profiling for compound screening.
- Platform Reuse: Designed for scalability across plant species (Arabidopsis, Brachypodium, Panicum) and growth media (hydroponic, sand, soil), supporting cross-project standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models plant-soil-microbe interactions relevant to sustainable agriculture and bioenergy feedstock production.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by allowing progression from sterile lab conditions to defined soil/sand systems with supplemental media.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on reproducible phenotypes under controlled stress or nutrient conditions prior to field testing.
Pipeline & Workflow Integration
EcoFABs integrate into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supporting iterative design-test cycles for microbiome-based agricultural solutions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling manipulation of microbiome composition and environmental variables while monitoring plant responses.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through sterile fabrication, controlled hydration, and sealed incubation systems that minimize evaporation and contamination.
- Analytics: Provides quantitative measurements including root morphology imaging, metabolite profiling, and mass spectrometry data to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by supporting validation in increasingly complex media (sand, soil) while maintaining controlled variables.
- Enterprise Reuse: Designed as a reusable platform rather than a single-use tool, with modular design allowing adaptation across labs and plant models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in plant-microbe interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through detailed sterilization protocols, 3D-printed molds, and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of microbiome-based leads before field trials.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, reproducible phenotypes linked to microbial interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, 3D printing, and PDMS handling for device fabrication.
- Depends on access to plasma cleaners, vacuum chambers, and imaging systems for bonding and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for seed transfer, media exchange, and contamination control.
- Requires adaptation considerations when switching between liquid, sand, or soil-based growth media while maintaining sterility.
- Limited by the need for aseptic workflows during exudate sampling and media refresh to prevent biofilm formation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:13
EcoFAB Device Fabrication: Casting PDMS Layers
3:22
EcoFAB Device Fabrication: Chemically Attached PDMS Layers onto Microscope Slides
4:50
EcoFAB Sterilization
5:59
Growing Plants in EcoFABs
8:31
Results: Plant-microbe Interactions Using Ecosystem Fabrication Protocols
10:18
Conclusion
