היווצרות קשרי ערכיות דנ א Adducts על ידי חומרים מסרטנים Enzymatically מופעל, סמים במבחנה ונחישות שלהם על ידי ³²P-postlabeling

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא תיאור שיטות המשתמשות בתגובות המזורזות על ידי ציטוכרום p450 ואנזימי ביוטרנספורמציה נוספים כדי לחקור את עוצמתם של כימיקלים או תרופות להפעלתם למטבוליטים היוצרים תוספות DNA קוולנטיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח בתחום התפתחות הסרטן והטיפול בו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מראה לך סוג של שיטה להעריך את העוצמה של כימיקלים סביבתיים או תרופות ליצירת תוספות DNA קוולנטיות המייצגות התחלה של התפתחות סרטן.

ההשלכות של הטכניקה הקובעת את העוצמה המסרטנת של כימיקלים. עוצמה סביבתית, חומרים רעילים ותרופות וקובעת גם שיטות פשוטות יחסית ליצירת תוספות DNA קוולנטיות הנוצרות על ידי תרכובות כאלה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התחלת התפתחות הסרטן והטיפול בו, ניתן ליישם אותה גם בתחומים מדעיים אחרים.

כגון מחקרים על מנגנונים מולקולריים, על נזק ל-DNA, ומחקרים בעל פה על הפעלה אנזימטית ורעלים של כימיקלים. שמעתי לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר חקרתי תהליכים המעורבים בשלב ההתחלה של סרטן כימי. ראשית מכינים את תערובת הדגירה על ידי הוספת כל התרכובות ומערכות האנזימים לנפח סופי של 0.75 מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס.

זאת כדי לדגור את החומר המסרטן עם ה- DNA בנוכחות ציטוכרום p450. לאחר מכן, הוסף מיקרוזומים או p450 רקומביננטי טהור בסופרזום לתערובת. לאחר מכן, הוסף 7.5 מיקרוליטר של תרופה אליפטיצינית 0.1 מילי-מולרית מומסת ב-DMSO ו-42.5 מיקרוליטר מים כדי להתאים את הנפח הסופי ל-0.75 מיליליטר.

לאחר מכן, מערבבים את הרכיבים על ידי מערבולת הצינור למשך חמש שניות. מיד לאחר מכן, דגרו את הצינור בחום של 37 מעלות צלזיוס כשהמכסה פתוח למשך 30 עד 60 דקות. לאחר מכן, ערבבו פנול או פנול כלורופורם ביחס של אחד לאחד עם תערובת הדגירה בשפופרת אפנדורף.

זה יסיר את זיהום החלבון מה-DNA בתערובת הדגירה. לאחר מכן מערבבים את התערובת ליצירת תחליב. לאחר מכן סובבו את התערובת בחום של 1600 פעמים גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת הסביבה.

לאחר סיום הצנטריפוגה השתמש בפיפטה כדי להעביר את שלב המים העליון לצינור פוליפרופילן חדש. לאחר מכן השליכו את ממשק החלבון יחד עם השלב האורגני. לאחר מכן, מערבבים את שלב המים עם נפח שווה ערך של פנול וכלורופורם ביחס אחד לאחד.

ואז חזור על הצנטריפוגה. לאחר מכן, הוסף כמויות שוות של כלורופורם לשלב המים שנאסף ושוב צנטריפוגה. לאחר מכן זרז את ה- DNA מהשלב המימי על ידי הוספת שני נפחים של אתנול קר שנשמר במינוס 20 מעלות צלזיוס.

ואז מערבבים היטב את התמיסה. כדי להתכונן לתיוג תוספות ה-DNA, ערבבו את תמיסת חיץ הביצין עם תמיסת ATP עם תווית רדיו כדי לתייג את תוספות ה-DNA. הוסף את תערובת התיוג לתמיסת NP1, או לתערובת העשרת בוטנול.

הניחו לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן יש למרוח כ -20 מיקרוליטר על כל הדגימה על צלחת ה- TLC של PEI-תאית. לאחר איתור הדגימה על צלחת TLC PEI-תאית, השאר את הצלחת להתפתח בכיוון D1 כדי לנקות את התוספות.

לאחר שהצלחת מתייבשת, השאירו את הצלחת להתפתח בכיווני D3 ו-D4. כדי לפתח ב-D3, השתמש במאגר פורמט ליתיום ב-pH 3.5 עם אוריאה. לפיתוח D4, השתמש במאגר Tris-HCl עם ליתיום כלוריד ואוריאה.

על מנת למנוע בעיות בהתפתחות בכיוון D4, פתח את הלוחות גם בכיוון D5. ראשית, נעשה שימוש בטכניקת תיוג P32 כדי לחקור את היעילות של אליפטיצין ביו-אקטיבי בתיווך מיקרוזומלי p450 ביצירת תוספות DNA. התוצאות מראות היווצרות של תוספות DNA קוולנטיות בדאוקסיגואנוזין של ה-DNA של תימוס העגל בנוכחות מיקרוזומים כבדיים של חולדות ו/או אנושיות; עם זאת, לא נוצרות תוספות בקבוצת הביקורת.

לאחר מכן, נחקר הפוטנציאל של אליפטיצין מופעל תלוי באנזים פרוקסידאז. התמונה מציגה היווצרות של תוספות DNA קוולנטיות ב-DNA של תימוס עגל בנוכחות חזרת פרוקסידאז, לקטופרוקסידאז בקר ומיאלופרוקסידאז אנושי. למעשה, תוספות DNA נוצרות גם מה-DNA של הכבד כאשר החולדות מטופלות ב-40 מיליגרם לק"ג משקל גוף של אליפטיצין in vivo.

מעניין לציין כי האנזים האנושי ציטוכרום p450 CYP3A4 מראה גם פוטנציאל חזק לחמצון יעיל של אליפטיצין למטבוליטים כגון 12-הידרוקסיאליפטיצין ו-13-הידרוקסיאליפטיצין. מטבוליטים אלה יכולים להיקשר בקלות ל-DNA כדי ליצור את התוספות. לאחר מכן, נעשה שימוש בשיטות העשרה של נוקלאז P1 ו-n-בוטנול כדי לחקור את היווצרות תוספות ה-DNA עם הפעלת 3-nitrobenzanthrone עם רדוקטאז ציטוזולי כגון NQ01 מחולדות ובני אדם.

התוצאות מראות היווצרות של עד חמש תוספות DNA מה-DNA של תימוס העגל שהתקבל מהחולדה, ציטוזול כבד אנושי וגם כבד עכברים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. על ידי ניסיון הליך זה חשוב לזכור את היציבות של המערכות האנזימטיות בהן נעשה שימוש.

פעילות האנזים עלולה להצטמצם אם לא מאוחסן על קרח. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביוכימיה, הביוכימיה של סרטן כימי לחקור את טבע התופעה מתהליכי התחלה של התפתחות סרטן באורגניזמים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את העוצמה של כימיקלים סביבתיים או תרופות שיופעלו אנזימטית כדי לבצע חילוף חומרים של תוספות DNA קוולנטיות גנטיות.

תהליך זה מייצג חשיבות גבוהה לפיתוח טיפולים מבוססי סרטן. אל תשכח שאתה עובד עם כימיקלים שעלולים להיות מסוכנים ביותר. חומרים מסרטנים פוטנציאליים, כימיקלים רדיואקטיביים, למשל זרחן ATP.

לכן יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון כפפות לטקס מעבדה ויריעות פרספקס בעת ביצוע הליך זה.