Name: זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: למדו לזהות תאי לוויין בשרירי השלד הבוגרים באמצעות שיטת Immunofluorescence עם נוגדנים ל-Pax7 ו-Laminin. פרוטוקול זה מאפשר חקר תאי גזע שריריים בסביבתם הפיזיולוגית הטבעית עם מינימום מניפולציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים NIAMS אור הדמיה המקטע למתן מיקרוסקופים וסיוע טכני. נוגדנים MF20 ו- Pax7 התקבלו מהבנק התפתחותית מחקרים ליפידים שפותח תחת חסותה של NICHD ומתוחזק על ידי העירייה במחלקה למדעי הביולוגיה, אוניברסיטת איווה, איווה. עבודה זו נתמכה על ידי מגזר מחקר התוכנית של NIAMS של מכוני הבריאות הלאומיים.

ב פרוטוקול זה, שרירי הגפיים האחוריות הקדמי של עכברים בוגרים (2-6 חודשים), השוקתי הקדמי (TA), השריר פושט האצבעות הארוך (EDL), הועסקו בתור דוגמה כדי לבצע את immunofluorescence מכתים-SCs שלהם. כל השלבים טיפול עכברים שריר רקמות והניתוחים אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC) של NIAMS/NIH.
1. לנתח את השריר ת א/אדי מן האיבר הינד העכבר
<ol><li>המתת חסד העכבר בחדר מלא המתת חסד2 CO תחת הנחיות ACUC של NIH. לבצע פריקה צוואר הרחם במידת הצורך.</li>
	<li>לשים את הפנים העכבר על משטח חיתוך (פרקדן). תרסיס אתנול 70% על גבי העור בבטן שלו. חתך של 1-2 ס מ פתיחה אופקית על המרכז של העור בטן העכבר, אז כן, עדיף את העכבר על ידי משיכת הפתח לכיוון כפות הרגליים העכבר. חושפים צד אחד של האיבר הינד העכבר.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים חדה שני: להשתמש אחד להחזיק את הגידים לצרף את ת א/אדי לקרסול ולהשתמש השני כדי לשבור להטיה fascia כיסוי ה-TA/EDL. לאחר fascia קולפה, להשתמש קצה חד של המלקחיים כדי לנתק את ת א/אדי של עצם השוקה על-ידי הפעלת את הקצה מתחת לשריר ת א/אדי.</li>
	<li>חתך הגידים הקרסול עם מספריים בעודו מחזיק אותם עם המלקחיים. חתוך את השריר עם מספריים לאורך קו האורך ת א/אדי בין הקרסול לברך כשאתם מרימים את ת א/אדי מהצד הקרסול עם המלקחיים. חותכים את הגידים בצד הברך כדי לנתק את אדי/ת א שלם של עצם השוקה.</li>
</ol>2. הקפאה-הטבעה של שריר ת א/אדי
<ol><li>הכנת אמבט חנקן נוזלי במיכל, למשל., חנקן נוזלי דיואר הבקבוק. שופכים methylbutane לתוך חבית פלסטיק קטנה (בערך 20 מ ל) עד חצי מלא. אז לשים את. הספל באמבטיה בחנקן נוזלי להקפיא אותו. לאחר כמה דקות, לבדוק methylbutane הוא קפוא. הערה: ניתן להחליף החנקן הנוזלי דלי קרח יבש, אך הזמן הקפוא הוא איטי יותר.</li>
	<li>להניח את אדי/ת א גזור על גבי משטח שטוח של פומפה מזרק פלסטיק קטנים. כיסוי מלא ה-TA/EDL עם מספר טיפות של האופטימלית חיתוך טמפרטורה (O.C.T.) מורכב (המדיום ההקפאה).</li>
	<li>לקחת את הספל methylbutane מהאמבטיה חנקן נוזלי, להפשיר את השטח עם חפץ חמים (למשל., נקודת האחיזה של מספריים). במהירות מח ש O.C.T. מכוסה ת א/אדי על הבוכנה לתוך methylbutane נמס אל snap-הקפאת הרקמה.</li>
	<li>לנתק את הרקמה מוטבע של הבוכנה עם מלקחיים, ושם את זה בתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. למקם את הצינור לתוך חנקן נוזלי לאחסן אותו לטיפול דגימות נוספות. הערה: הרקמה מוטבע ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך (שנתיים) או-20 ° C לטווח קצר (6 חודשים).</li>
</ol>3. cryostat חלוקתה
<ol><li>להוסיף טיפה של מתחם במרכז בעל הדגימה cryostat O.C.T.. המתן עד למתחם O.C.T. כמעט פני השטח למוצק. מקל במהירות את אדי/ת א מוטבע למתחם O.C.T., בניצב עם הקרסול-בצד למטה ובצד הברך-למעלה.</li>
	<li>הר בעל הדגימה על גבי cryostat לחתוך את הרקמה במרווח 10 מיקרומטר, לאסוף את הסעיפים הקפאה על פרוסט מצופה שקופיות עם סעיפים 4-8 על שקופית אחת.</li>
	<li>יבש הסעיפים בטמפרטורת החדר במשך לפחות 3 h ללון. הערה: למרות ייבוש הסעיפים במקפיא נלון או יותר קבילה, באופן בלתי נמנע יגדיל את autofluorescence. לקבלת תוצאות מיטביות, יבש הסעיפים עבור 0.5 h, ואז להמשיך עם קיבוע והשלבים מכתימים מיד.</li>
	<li>לאסוף את השקופיות בתיבה שקופיות, להשתמש בהם באופן מיידי, או לאחסן את השקופיות ב- 80 ° C או-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.</li>
</ol>4. הכנה של ריאגנטים Immunofluorescence מכתים
<ol><li>
הכן מאגרים:
	<ol>
<li>להכין 2 ל' 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) מהערוץ 10 x.</li>
		<li>להכין 40 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS 1 x מ- 16% מחברים.</li>
		<li>להכין 2 ל' של PBST: 1 x PBS עם 0.1% טריטון-100.</li>
		<li>להכין 50 מ של PBST-b: PBST עם 2% אלבומין שור (BSA).</li>
		<li>הכינו 10 מ"ל של PBST-ב'-ז': PBST עם סרום עז נורמלי BSA ו- 5% 2%.</li>
		<li>להכין 1 מ"ל של חסימת פתרון. AffiniPure Fab שתדללו פרגמנט עז אנטי עכבר אג (H + L) (1:10) PBST-ב'.</li>
		<li>להכין 200 מ ל 1 x ציטראט המאגר. הערה: הכרכים של הפתרונות שלעיל מספיקים עבור שקופיות לפחות 5. אמצעי אחסון צריך להיות מותאם על פי מספר השקופיות והגודל של המכולות שקופיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להכין נוגדן כתמים:
	<ol>
<li>ראשי נוגדנים (ריכוז בעבודה): להכין 1.2 מ של נוגדן ראשוני מיקס על ידי דילול Pax7 העכבר monoclonal נוגדנים (IgG1) (1-5 µg/mL) + Laminin ארנב polyclonal נוגדנים (0.5-2 µg/mL) + MF20 העכבר monoclonal נוגדנים (IgG2b) (0.5-2.5 µg / מ"ל) ב- PBST-B-G. הערה: MF20 העכבר monoclonal נוגדנים (IgG2b) היא אופציונלית.</li>
		<li>נוגדנים משניים (ריכוז בעבודה): להכין 1.2 מ של נוגדנים משניים מיקס על ידי דילול עז העכבר אנטי IgG1 קרוס-הספוחה משני נוגדן, אלקסה עבור חיל הים 488 (0.5-2 µg/mL) + עז ארנב אנטי איג (H + L) מאוד קרוס-הספוחה משני נוגדנים, אלקסה עבור חיל הים בתוספת 555 (0.5-2 µg/mL) + עז אנטי-העכבר IgG2b קרוס-הספוחה משני נוגדן, אלקסה עבור חיל הים 647 (0.5-2 µg/mL) ב- PBST-B-G. הערה: עבור חיל הים אלקסה 647 היא אופציונלית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. immunofluorescence מכתים צעדים
<ol><li>
נתרענן ונחזור לתקן את הסעיפים הקפאה עם כדורגלן.
	<ol>
<li>הסר את מספר השקופיות הקפאה. באזור ת א/אדי תיבת שקופיות. חממו את השקופיות מגש שקופית החזקת בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>השתמש עט חוסם נוזלי (PAP עט) כדי לצייר אזור הכולל כל הקפאה-הסעיפים בשקופית. מעגל זה ימנע את הפתרונות זורם מחוץ לשקופית.</li>
		<li>קח את המגש ברדס fume מעבדה. להוסיף 300-500 µL של 4% מחברים אותן לשקופית בתוך חגו באזור לתקן את הסעיפים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לשטוף החוצה כדורגלן עם PBS 1 x לפחות 3 x 5 דקות בתוך מיכל שקופיות. התראה: PFA היא toxic של פסולת מסוכנת; זה צריך להיות פעלו בזהירות, הושלך לתוך מיכל פסולת מסוכנת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אחזור אנטיגן
	<ol>
<li>למלא מיכל שקופית אחרת עם 200 מ ל מאגר ציטראט.</li>
		<li>להעביר את השקופיות לתוך המיכל. העברת המכולה עם השקופיות סיר לחץ לבשל את השקופיות במצב לחץ גבוה למשך 10 דקות.</li>
		<li>לקרר את המיכל עם ניקוז מים במשך 10 דקות העברת כל השקופיות כדי מיכל חדש עם PBST (200 מ"ל), לשטוף את השקופיות עם PBST למשך לפחות 3 x 5 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
חסימת
	<ol>
<li>להוסיף kimwipes ספוגי מים במגש מחזיק את השקופיות כדי ליצור סביבה לחה כדי למנוע ייבוש של השקופיות.</li>
		<li>העבר את השקופיות חזרה המגש, וכן להוסיף 200 µL של חסימת פתרון על כל שקופית. מכסים את המגש עם כובע ולתת את חסימת לפתח למשך 30 דקות. הערה: נוגדן Pax7 הוא נוגדן חד שבטי עכבר, אז יש איגוד לא ספציפי של העכבר IgG ברקמות השריר העכבר יוצר רקע. שימוש AffiniPure Fab פרגמנט עז העכבר אנטי אג (H + L) חוסם של עכבר-על הכריכה לא ספציפי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
החל נוגדנים העיקרי.
	<ol>
<li>יש לשטוף את השקופיות עם PBST פעם בגורם המכיל של השקופית. ואז להעביר את השקופיות בחזרה למגש מכתימים.</li>
		<li>החל µL 200 של נוגדן ראשוני תערובת על כל שקופית, מכסים את המגש עם כובע, והנח את התגובה לפתח בטמפרטורת החדר במשך 1 h או ב 4 ° C נלון. הערה: התגובה לילה ב 4 ° C נותן את התוצאה הטובה ביותר, למרות פיתוח התגובה בטמפרטורת החדר נותן תוצאות משביעות רצון. ניתן להוסיף הנוגדן MF20 צולבות הקישור חוטים שרירן בתערובת לבצע תיוג של טריפל (Pax7, Laminin, MF20). כתמים MF20 הבדיל סיבי השריר. שלב זה משמש גם צעד חסימת נוסף עם PBST-B-G כדי להפחית מחייב לא ספציפי פוטנציאלי משני הנוגדנים (עז נוגדנים) בשלב הבא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
החל נוגדנים משניים.
	<ol>
<li>תשטוף את הנוגדנים ראשי עם PBST בטמפרטורת החדר לפחות 3 x 5 דקות.</li>
		<li>להוסיף 200 µL של נוגדנים משניים לערבב כל שקופית, ולאפשר את התגובה לפתח בטמפרטורת החדר במשך לפחות שעה. הערה: עבור Pax7 + Laminin, להשתמש עז העכבר אנטי IgG1 אלקסה 488 עז ארנב אנטי אלקסה 555. עבור Laminin + Pax7 + MF20, להוסיף עז אנטי-העכבר IgG2b אלקסה 647 בתערובת.</li>
		<li>תשטוף את הנוגדנים משני עם PBST לפחות 3 x 5 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
דאפי (4', 6-diamidino-2-phenylindole) נגד הכתם מכשירי הרכבה
	<ol>
<li>לדלל דאפי (1:20, 000) ב- PBST בגורם המכיל של שקופיות, למשל, 10 µL של דאפי ב 200 מ של PBST.</li>
		<li>מכתים את השקופיות בגורם המכיל של דאפי למשך 3 דקות.</li>
		<li>לשטוף את דאפי עם PBST למשך לפחות 5 x 5 דקות.</li>
		<li>לטעון את השקופיות הרכבה בינונית. מכסים את השקופיות עם coverslips. זהירות: דאפי היא רעילה, מסוכנים; זה צריך להיות שטופלו עם טיפול והוא מסולק בבקבוק פסולת מסוכנת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. מיקרוסקופ פלואורסצנטי
הערה: פרוטוקול מוכתמים immunofluorescent דיווח מעל יאפשר SCs ויזואליזציה עם גם שדה רחב פלורסנט או קונאפוקלית מיקרוסקופ. זה יכול להיות מאתגר בתחילה לזהות SCs... להלן כמה צעדים מומלצים שעשויים להיות לעזר.
<ol><li>השתמש דאפי ערוץ הגדלה נמוכה מטרות להמחיש את המקטעים של השקופיות.</li>
	<li>מתג ההגדלה מנמוך לגבוה. להתבונן SCs, לפחות 20 X מטרה נדרש).</li>
	<li>שמתשהל סינון כפול עבור 488 (FITC) / 555 (Rhodamine) כדי לצפות גם Pax7 וגם Laminin אותות בו-זמנית כדי לזהות SCs. תחת הגדרה זו, האות של Pax7 מכתים יש ניגוד יותר רעשי הרקע.</li>
	<li>במהירות לסירוגין את הערוץ של FITC כדי דאפי לזהות כראוי SCs. כל SCs צריך להיות Pax7 דאפי-חיובי.</li>
</ol>

<ol><li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li>
<li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li>
<li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+insect+eye+to+vertebrate+muscle%3A+redeployment+of+a+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li>
<li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li>
<li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+the+engines+of+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li>
<li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+therapeutic+potential+and+roadblocks%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li>
<li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li>
<li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration%3A+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li>
<li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li>
<li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence%3A+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li>
<li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול הנ ל מבוססת על שיטה של Pax7/MF20 מכתים על שרירי השלד דג זברה12. הפתרונות בשימוש וחסימת צעדים הן זהות או דומות. הנוגדנים בשימוש זהים. השלבים מנוכי עונתיות התבססו על התכונות של רקמת שריר עכבר ו- SCs. ראשית, Laminin נוגדן נוסף בתערובת שיעזרו להמחיש, לאשר את המיקום של SCs. זה היה מועיל במיוחד לספור את מספר SCs תחת המיקרוסקופ בעת שימוש הקוביה סינון כפול של 488/555; זה שיפור משמעותי את האות Pax7 SC-derived להתבלט רקע autofluorescent רועש. שנית, מאחר הנוגדן Pax7 בשימוש נוגדן העכבר, הוספנו שלב ח...

שרירי השלד הוא מורכב של תאי שריר multinucleated, הנקרא myotubes, המסודרות myofibers, המניבות כוח ותנועות דרך ציר. שרירי השלד ביותר, למעט כמה שרירים ואסטתיים, נגזרות מבנה עובריים זמני בשם somite1. קודמן myogenic תאים delaminate מ somite אפיתל להפוך myoblasts. Myoblasts נוספות להבדיל לתוך השריר כי הפתיל כדי להפוך myotubes כדי ליצור myofibers רב nucleated. התהליך הנ ל נקרא myogenesis והוא מאופיין על ידי מוסדר חנותם בקרת ביטוי גנים. מבשרי myogenic אקספרס Pax3 ו- Pax7, ואילו myoblasts אקספרס אלוהים ו/או Myf5 ונייטרלים אקספרס2,myogenin ו- myosins3. השריר הוא תהליך שבו myofibers להיות גדולים יותר על ידי שילוב myonuclei יותר קיימים סיבים (היפרפלזיה) ועל ידי עלייה סיבי השריר (היפרטרופיה) בגודל4. במהלך השריר, יש מקור בר-קיימא של תאי myogenic יש מאפייני תא גזע בכך שהם יכולים להבדיל ולחדש את עצמי. תאים אלה מכונים תאי לוויין לפי מיקומם הפיזי בין הנדן הבזליים5sarcolemma (קרום התא של myofiber). SCs נמרצות לתרום לצמיחה שרירים על הבמה לנוער (2-3 השבועות הראשונים של עכברים כמחנכת), אבל להיות השבתה הדרגתית ב נח שריר למבוגרים6. למרבה הפלא, הם יכולים להיות מופעל מחדש בתגובה שריר פצעה, להבדיל לתוך תאי שריר חדשים כדי לתקן את השריר הפגוע7.
מאפייני תא גזע לבצע חקר SCs הרלוונטיים עבור שריר בסיסיים בביולוגיה והן טיפולים של מחלות שריר8. כתוצאה מכך, עבר שטח של חקירה אינטנסיבית בעשורים האחרונים. התקדמות עצומה נעשתה בניתוח את הגנטיקה ואת אפיגנטיקה SCs9,10. מעורב בידוד וזיהוי SCs בחיי עיר היו שפותח וטכניקות אופטימיזציה לאורך הדרך11. צביעת immunofluorescent מאפשר זיהוי SCs באמצעות נוגדנים ספציפיים, כולל זה עבור Pax7. עם זאת, המחסור ואת גודל קטן של ה-SCs בשילוב עם auto-פלורסצנטיות חזקה של רקמת שריר השלד למבוגרים לדקלם את הפריט החזותי מאתגר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מוכתמים immunofluorescent הממוטבות עבור העכבר שריר Pax7, המבוסס על שיטה קיימת עבור דג זברה שריר12. בנוסף, נוגדן Laminin המסומנת fluorophore ברורים הוא מועסק כדי לזהות הנדן הבזליים שתחתיו ה-SCs ממוקמים. פרוטוקול זה מאפשר באופן עקבי את החזיית SCs Pax7-חיובית, מבשרי myogenic תחת כל נבדק בתנאים פיזיולוגיים ושלבים התפתחותיים.

<table><tbody><tr><td>methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T.) תרכובת</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי</td><td>62550-01</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco, Themo Fisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>TED PELLA</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>תרמו פישר</td><td>0 1-6201</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment עז נגד עכבר IgG (H+L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>20x ציטראט מאגר</td><td>תרמו פישר</td><td>00 500</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 נוגדן עכבר חד-שבטי (IgG1) (סופרנטנט)</td><td>מחקר התפתחותי בנק היברידומה</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ארנב פוליקלונלי למינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>MF20 נוגדן עכבר חד-שבטי (IgG2b) (supernatant)</td><td>מחקר התפתחותי היברידומה בנק</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG1 נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG2b נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21242</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Leica CM1860 cryostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6000 מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td>פלואורסצנטי רחב שדה</tr><tr><td>Leica DMR מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td>פלואורסצנטי שדה רחב</tr><tr><td>Zeiss LSM510 מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קונפוקלי Zeiss LSM780 מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td>קונפוקלי</tr><tr><td>Cuisinart סיר</td><td></td> <td>לחץ אלקטרוני</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי immunofluorescence עם pax7 ו- laminin נוגדנים

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence היא שיטה יעילה המסייעת לזהות סוגי תאים שונים במקטעי רקמות. ללימוד האוכלוסייה התא הרצוי, נוגדנים עבור תאים מסוים סמנים מוחלים על רקמות חלקים. בשרירי השלד למבוגרים, תאי לוויין (SCs) הם תאי גזע שתורמים שריר תיקון והתחדשות. לכן, חשוב להמחיש ולאתר האוכלוסייה בלוויין תא בתנאים פיזיולוגיים שונים. נח שרירי השלד, SCs שוכנים בין הנדן הבזליים קרום פלזמה myofiber. סימן נפוץ לזיהוי SCs את myofibers או תרבית תאים הוא החלבון לזווג תיבת Pax7. במאמר זה, פרוטוקול immunofluorescence Pax7 אופטימיזציה במקטעי שרירי השלד מוצג זה ממזער שאינם ספציפיים מכתים ורקע. עוד נוגדן מזהה חלבון (laminin) של הנדן הבזליים נוספה גם כדי לסייע בזיהוי SCs-בדומה פרוטוקולים יכול לשמש גם כדי לבצע כפולים או משולשים תיוג עם Pax7, נוגדנים חלבונים נוספים של עניין.

השלבים לעיל, SCs ניתן לאבחן בהצלחה בסעיפים למבוגרים מנוחתו השריר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). למרות לרקמת שריר למבוגרים יש חזקה אוטומטי-קרינה פלואורסצנטית בסוג מסוים של סיבים, אלקסה סדרת צבעים בהירים ניתן להתגבר על רעשי הרקע ואת האות בולטת (איור 1 א', ב'; ראשי חץ). שני הפוטונים מיקרוסקופיה קונפוקלית לוכדת תמונה נקייה יחסית (איור 1B) מאשר במיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב (<strong...

זיהוי מדויק של תאים הלוויין חיוני ללמוד את הפונקציות שלהם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. מאמר זה מציג פרוטוקול כדי לזהות תאים הלוויין במקטעי שרירי השלד למבוגרים מאת מבוססי immunofluorescence מכתים.

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לזהות תאי לוויין של שרירי שלד בוגרים באמצעות אימונופלואורסצנטיות. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח הקשורות למספר והתפלגות תאי גזע השריר במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שניתן לזהות תאי גזע של שריר בסביבתם הפיזיולוגית במניפולציה מוגבלת בלבד.מי שתדגים את ההליך תהיה פאיזה נאז, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הכינו אמבט חנקן נוזלי על ידי שפיכת חנקן נוזלי לבקבוק דיואר. לאחר מכן, שפכו 10 מיליליטר מתילבוטן לכוס פלסטיק של 20 מיליליטר והעבירו את הכוס לאמבט החנקן הנוזלי.הנח את שריר השוקה הקדמי המנותח על המשטח השטוח של בוכנת מזרק פלסטיק קטנה. לאחר מכן, כסו את השריר המנותח בכמה טיפות של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית או O.C.T.הסר את המתילבוטן מאמבט החנקן הנוזלי, ולאחר מכן הפשיר את פני השטח באמצעות ידיות של זוג מספריים. טבלו במהירות את הרקמה המכוסה ב-O.C.T במתילבוטן המומס כדי להקפיא אותו.לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לנתק את הרקמה המוטבעת מהבוכנה ולהעביר אותה לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, אחסן את צינור המיקרו-צנטריפוגה בחנקן הנוזלי. כדי להתחיל בחיתוך קריוסטט, הוסף טיפה של תרכובת O.C.T על מרכז מחזיק הדגימה של קריוסטט ואפשר לו להתמצק חלקית.לאחר מכן, הדביקו את הרקמה המוטמעת בתרכובת ה-O.C.T כשצד הקרסול כלפי מטה וצד הברך כלפי מעלה. לאחר מכן, הרכיב את מחזיק הדגימה על הקריוסטט וחתוך את הרקמה במרווחים של 10 מיקרומטר. אסוף ארבעה עד שמונה קריוסקטים על כל שקופית מצופה כפור.יבש את החלקים בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות, ואז אסוף את השקופיות בקופסת שקופיות ואחסן אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר שקופית מקופסת השקופיות וחמם אותה לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש בעט חוסם נוזלים כדי לסמן אזור סביב החתכים כדי למנוע זרימת נוזלים מהצד.במכסה אדים, הוסף 300 עד 500 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד לאזור המסומן. דגרו את השקופית בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לתקן את החלקים. לאחר מכן, שטפו את הפרפורמלדהיד מהמגלשה עם PBS במיכל שקופיות.כדי להתחיל באחזור אנטיגן, מלא מיכל שקופיות ב-200 מיליליטר של מאגר ציטראט והעביר את השקופית למיכל. לאחר מכן, העבירו את מיכל השקופיות לסיר לחץ בלחץ גבוה למשך 10 דקות. שלב אחזור האנטיגן הוא אופציונלי אם החלקים מיובשים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות וממשיכים מיד.אז שלב אחזור האנטיגן אינו הכרחי. אך אם החלקים מיובשים בטמפרטורת החדר במשך יותר משלוש שעות ואז מאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס, נדרש שלב אחזור האנטיגן. לאחר מכן, יש לקרר את מיכל השקופיות מתחת למים זורמים למשך 10 דקות.לאחר מכן העבירו את השקופית למיכל חדש עם 200 מיליליטר PBST ושטפו עם PBST. הוסף למגש מגבוני מעבדה ספוגים במים, ולאחר מכן שים לב לשקופית השטופה עם עט PAP והנח אותה במגש. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לשקופית.לאחר מכן מכסים את המגש ומדגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שלב החסימה חשוב מאוד מכיוון שהנוגדן Pax7 בו נעשה שימוש הוא נוגדן חד-שבטי של עכבר. שלב חסימת העכבר על העכבר מפחית את הכריכות הלא ספציפיות.לאחר מכן, שטפו את השקופית עם PBST במיכל השקופיות והחזירו אותה למגש. הוסף 200 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים ראשונית לשקופית ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, שטפו את השקופית עם PBST, ולאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים משניים ודגרו בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה.לאחר תקופת הדגירה יש לשטוף את השקופית עם PBST. מדללים DAPI במיכל שקופיות ודוגרים את השקופית במיכל למשך שלוש דקות. לאחר מכן, שטפו את ה-DAPI עם PBST למשך חמש דקות.לבסוף, הרכיב את השקופית עם אמצעי הרכבה והחל כיסוי. במחקר זה, תאי לוויין נראים בהצלחה בקטעי שריר מנוחה בוגרים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. רעשי הרקע הנראים בדרך כלל ברקמת שריר בוגרת וסוגים מסוימים של סיבים מופחתים על ידי שימוש בחסימת עכבר על עכבר.אותות האימונוסטיין הספציפיים משופרים על ידי שימוש בנוגדנים משניים המצומדים בצבעי אלקסה בהירים. מיקרוסקופ קונפוקלי דו-פוטוני לוכד תמונה חדה יותר בהשוואה למיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל שדה רחב. ניתן ליישם את אותו פרוטוקול גם על רקמת שריר מעכברים צעירים, עוברי עכברים ורקמות שריר בוגרות פצועות.רקמות שריר צעירות ועובריות מתארות תאי לוויין פעילים יותר או קודמנים מיוגניים של Pax7 עם גרעינים גדולים יחסית. כך קל יותר לדמיין את תאי הלוויין של עכברים צעירים יותר מאשר של עכברים בוגרים. ברקמת השריר הפגועה נראים תאים פעילים יותר חיוביים ל-Pax7.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שלא ניתן לבטל לחלוטין רעש המגיע מאוטופלואורסצנטיות וקישור חיסוני לא ספציפי של עכבר על עכבר, אך עם פרוטוקול זה ניתן להפחית את הרעש במידה רבה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות תאי לוויין בהקפאת שרירים.

identification-skeletal-muscle-satellite-cells-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בידוד והתרבות של myofibers הוא תקן...

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

בתרבות חוץ גופית מערכות הוכיחו הכרחיות להבנה של myogenesis חוליות שלנו. עם זאת, הרבה עדיין לא למד על פיתוח שרירי שלד nonmammalian וצמיחה, במיוחד במינים הבזליים. פרוטוקול יעיל וחזק לבידוד בתאי גזע בוגרים של רקמה זו, התאים המבשר myogenic (MPCs), ושמירה על ההתחדשות העצמית שלהם, שגשוג, ובידול בהגדרת תרבות העיקרית מאפשר זיהוי של מנגנוני פיקוח שימור ומסתעפים לאורך שושלות חוליות.

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

סוגי התאים הדבקים העיקריים שמקורם בשריר אנושי הם תאים מיוגניים ופיברובלסטים. כאן, אוכלוסיות התאים מועשרות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי המבוסס על אנטיגן CD56. תיוג חיסוני לאחר מכן עם נוגדנים ספציפיים ושימוש בטכניקות ניתוח תמונה מאפשר כימות של מאפיינים ציטופלזמיים וגרעיניים בתאים בודדים.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי לוויין משרירי ראש מסועפים של חולדה בת 9 שבועות. מקורם של השרירים בקשתות ענפיות שונות. לאחר מכן, תאי הלוויין מתורבתים על ציפוי נקודתי בגודל מילימטר כדי לחקור את ההתמיינות שלהם. גישה זו מונעת התרחבות ומעבר של תאי לוויין.

בידוד ואפיון של תאי לווין משרירי עכברוש ראש Branchiomeric

Autophagy פעיל קשורה התחדשות שריר פרודוקטיבי, אשר חיוני עבור תא גזע שריר (MuSC) ההפעלה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לזיהוי באתרה של LC3, סמן autophagy ב MyocS חיובי Myocs של קטעים רקמות שריר מן שליטה ועכברים שנפגעו.

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

אנו מתארים בשיטה vivo לחקור את אובדן פונקציונלי של גן ספציפי בתאי לווין באמצעות שילוב של קרדיאטוקסין בתיווך הפציעה של שריר השלד ואת הזריקה של siRNA הספק.

ניתוח תא לווין פונקציה במהלך התחדשות שריר השלד על ידי פציעה קרדיאטוקסין הזרקה של העצמי הספק siRNA ב Vivo

כאן, אנו מציעים שיטה ביעילות להשיג סיבי שריר בודד בשלב מוקדם לאחר לידה התפתחותית מ homozygous מוטציה Lamin δ 8-11 מודל העכבר, מודל חמור מאוד עבור השרירים נייל-דרייפוס ניוון שרירים (edmd).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

בפרוטוקול זה מתוארת שיטת ניתוח מבחנה וניתוח תפקודי לתאי גזע שריריים, המשמרת את רוב האינטראקציות שלהם עם הנישה האנדוגנית שלהם.

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

שרירי השלד מורכבים ממספר סוגי תאים, כולל תאי גזע תושבים, שלכל אחד מהם תרומה מיוחדת להומאוסטזיס והתחדשות שרירים. כאן מתוארת התרבית הדו-ממדית של תאי גזע שריריים ונישת תאי השריר בסביבה ex vivo המשמרת רבים מהמאפיינים הפיזיולוגיים, in vivo וסביבתיים.

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לבידוד והעשרת מיובלסטים ראשוניים משרירי השלד של עכברים בוגרים ויילודים באמצעות ניתוק רקמות, סינון רציף, ציפוי מוקדם ותנאי תרבית מוגדרים, המאפשר הקמה ותחזוקה של תרביות מיובלסטים שמקורן בתאי לוויין ליישומים ניסיוניים במורד הזרם.

בידוד תאי לוויין שריר השלד למחקרי מיוגנזה במבחנה

למדו לזהות תאי לוויין בשרירי השלד הבוגרים באמצעות שיטת Immunofluorescence עם נוגדנים ל-Pax7 ו-Laminin. פרוטוקול זה מאפשר חקר תאי גזע שריריים בסביבתם הפיזיולוגית הטבעית עם מינימום מניפולציה.

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

גלה סרטונים נוספים