ספציפית, איתור מדויק של spp. הפתוגן ירוק הדרים Candidatus liberibacter באמצעות PCR המקובלת על דגימות רקמה עלה הדרים
29 ביוני 2018
ירוק הדר היא מחלה הרסנית במיוחד להשפיע על גידולי הדרים באופן גלובלי. המוצג כאן שיטה פשוטה משתמש PCR, דנ א גנומי, הפקת רקמת העלה הדר לצורך זיהוי ומדויקים המחלה ירוק הדרים, Candidatus liberibacter spp.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות במדויק את הפתוגן הירוק של הדרים Candidatus liberibacter spp. ברקמת עלי הדר. שיטה זו מאפשרת לחקלאי הדרים ולחוקרים לזהות במהירות ובדייקנות את נוכחותו של פתוגן האחראי לגרימת ירק הדרים.
המדגים את ההליך יהיה איאן פאלמר, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. שיטה זו יעילה, חסכונית וניתנת להתאמה לניתוח כמותי. בנוסף, ניתן לבצע אותו עם רמה מינימלית של ניסיון וציוד במעבדה.
ראשית השתמש במספריים נקיים כדי לחתוך עלה טרי שלם מעץ הדר, והניח בשקית כריך ניילון נקייה. לאחר מכן מצננים מרגמה ועלי, על ידי הוספת כמות קטנה של חנקן נוזלי. לאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך חתיכות קטנות מרקמת העלה, בגודל של כסנטימטר רבוע.
מניחים את חתיכות העלים במכתש כדי להקפיא אותם מיד. התחל לטחון במהירות את רקמת העלים עם המרגמה, עד שהחנקן הנוזלי מתאדה, ונשארת אבקה ירוקה דקה. לאחר מכן מצננים מרית מתכת בחנקן נוזלי, למשך 10 עד 15 שניות.
לאחר מכן השתמש במרית הקרה כדי לגרוף את רקמת הקרקע מהטיט בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. השתמש בפיפט של 1000 מ"ל כדי להוסיף 600 מ"ל של תמיסת גרעינים לדגימה. לאחר מכן מערבל את הדגימה למשך שנייה עד שלוש שניות.
דגרו את הצינור בחום של 65 מעלות צלזיוס, באמבט מים למשך 15 דקות. לאחר סיום תקופת הדגירה, השתמש בפיפט של 10 מ"ל כדי להוסיף 3 מ"ל של תמיסת RNA לליקאט כדי להסיר RNA. לאחר מכן מערבבים את תכולת הצינור על ידי הפיכתו פעמיים עד חמש פעמים.
דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחממת ארון. לאחר 15 דקות הוסף לדגימה 200 מ"ל של תמיסת משקעים חלבון. מערבולת את הצינור במהירות גבוהה למשך 20 שניות.
לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-13000G למשך שלוש דקות. במהלך הצנטריפוגה הוסף 600 מ"ל של איזופרופנול הנשמר בטמפרטורת החדר, לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל. לאחר סיום הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט מצינור הצנטריפוגה, לצינור המכיל איזופרופנול.
השלך את הגלולה. הפוך את הצינור כדי שהדנ"א יהיה גלוי כמו חוט דמוי גדיל. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-13000G למשך דקה בטמפרטורת החדר.
שפכו את הסופרנטנט לאחר צנטריפוגה. לאחר מכן הוסף 600 מ"ל של אתנול 70% לגלולה. הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את הגלולה.
צנטריפוגה את הצינור ב-13000G למשך דקה אחת. לאחר סיום הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנטנט. לאחר מכן הפוך את הצינור כשהמכסה פתוח על נייר סופג לייבוש באוויר למשך 15 דקות.
לאחר הייבוש הוסף 100 מ"ל של תמיסת הידרציה מחדש של DNA לגלולה. דגרו את תרחיף ה-DNA ב-65 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך שעה. הקש על הצינור מעת לעת תוך כדי ערבוב.
הוסף 1 מ"ל מים מטוהרים במיקרו-קובטה. קרא את המים כריקים בספקטרופוטומטר. לאחר מכן הוסף 1 מ"ל מהדגימה במיקרו-קובטה.
הנח את המיקרו-קובטה על הספקטרופוטומטר, וקבל את ריכוז ה-DNA. היוו את תגובת ה-PCR על ידי הוספת כל הריאגנטים, ו-100 ננוגרם של DNA גנומי בצינור PCR של 50 מ"ל. מערבבים את הריאגנטים על ידי החלקה עדינה של הצינור, ואחריו צנטריפוגה מהירה.
הנח את צינור ה-PCR בתרמו-סייקלר והפעל את התוכנית. להכנת ג'ל האגרוז, שקלו 0.4 גרם אבקת אגרוז. לאחר מכן הוסיפו את אבקת האגרוז לבקבוק ארלנמאייר של 200 מ"ל, והתאימו את הנפח ל-50 מ"ל עם מאגר 1X TAE.
מחממים במיקרוגל את תערובת האגרוז בעוצמה גבוהה למשך כ -1.5 דקות. ניעור כל 30 שניות עד שהאגרוז נמס לחלוטין. לאחר מכן, הוסף 2.5 מ"ל של 10 מיליגרם למיליליטר של אתידיום ברומיד לאגרוז הנוזלי.
לאחר מכן יש לנער את הבקבוק כדי לערבב את האתידיום ברומיד, ולשפוך במהירות את ג'ל האגרוז הנוזלי בתבנית ג'ל ישרה. הכנס מיד מסרק ג'ל סטנדרטי של 12 שיניים. הניחו לג'ל להתקרר כ -20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסירו את מסרק הג'ל.
כעת הנח את הג'ל המוצק ביחידת האלקטרופורזה המלאה במאגר 1X TAE. טען את דגימת ה-DNA המוגברת הכוללת ו-5 מ"ל של DNA מאוחר יותר בבארות נפרדות על הג'ל. הפעל את יחידת האלקטרופורזה, ב-90 וולט קבוע למשך 35 דקות.
לאחר מכן הסר את הג'ל מיחידת האלקטרופורזה. לאחר מכן, הניחו את הג'ל על טרנסמאלייטור UV. צלם את התצלומים של דפוסי רצועות הג'ל בטרנס-אילומינטור ב-302 ננומטר.
כדי לזהות את החיידק הירוק, ה-DNA הגנומי המוגבר של ה-PCR המתקבל מדגימות נגועות ולא נגועות עובר אלקטרופוריזציה. בג'ל רצועות אלה המתאימות ל-500 זוגות בסיסים מצביעות על נוכחות של אזור ספציפי של ה-DNA הריבוזומלי Las16S בחיידק CL asiaticas. רצועות אלה המתאימות ל-700 זוגות בסיסים מצביעות על נוכחות של LAA2/LAJ5, ומכניסות את הקיים ברצף ה-DNA של אופרון בטא ריבוזומלי 16S בחיידק.
רצועות נפרדות אלה ב-400 זוגות בסיסים מצביעות על הגברה של הגן F-box הדרים בלבד, המתייחס לבקרת ההגברה הפנימית. כדי להחשיב את התוצאות שלנו כתקפות, נדרשת נוכחות של פס זה. נהפוך הוא, נוכחות של רצועה בלבד ב-400 זוגות בסיסים, אך היעדר הרצועות האחרות ב-500 ו-700 זוגות בסיסים מעיד על רקמת הדרים בריאה.
לאחר שליטה בטכניקה זו ניתן לבצע תוך כארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. הליך זה עשוי להיות מותאם כדי לאפשר ביצוע של שיטות כמותיות יותר, כגון RTQPCR כדי לזהות את כמות הפתוגן הקיימת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לזיהוי מדויק של הפתוגן הגורם למחלת הפיסול של ההדרים (citrus greening), Candidatus liberibacter spp., ברקמת עלה של הדרים. הפרוצדורה עושה שימוש ב-PCR ובמיצוי DNA גנומי, ומאפשרת זיהוי מהיר עבור חקלאים וחוקרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- פתולוגיה של צמחים
- גנומיקה
- מדעי החקלאות
רקע
- ההסמקה הירוקה של ההדרים (Citrus greening) היא מחלה הרסנית המשפיעה על גידולי הדרים ברחבי העולם.
- הפתוגן האחראי הוא .Candidatus liberibacter spp
- גילוי מדויק הוא קריטי לניהול המחלה ולצמצום השפעותיה.
- שיטה זו תוכננה להיות יעילה ונגישה עבור משתמשים שונים.
מטרת המחקר
- מתן שיטה מהימנה לזיהוי הפתוגן הגורם למחלת ה-citrus greening.
- סיוע למגדלי הדר בזיהוי נוכחותו של הפתוגן.
- קידום המחקר על מחלת ה-citrus greening.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- PCR (Polymerase Chain Reaction) לזיהוי פתוגנים.
- הפקת DNA גנומי מרקמת עלי הדר.
- נדרש ניסיון וציוד מעבדה מינימליים.
- כלכלי וניתן להתאמה לניתוח כמותי.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת זיהוי מהיר ומדויק של הפתוגן.
- הודגם על ידי Ian Palmer, סטודנט לתארים מתקדמים.
- הוכחה כי היא יעילה ואמינה עבור המשתמשים.
- תומכת במחקר שוטף ובפרקטיקות חקלאיות.
מסקנות
- שיטה זו היא כלי בעל ערך לגילוי מחלת ה-citrus greening.
- היא משפרת את יכולתם של חקלאים וחוקרים לנהל את המחלה.
- מעודדת מחקרים נוספים על בריאות גידולי ההדרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גילוי מוקדם וספציפי של פתוגנים צמחיים כגון Candidatus liberibacter spp. הוא קריטי לצמצום אובדן יבולים ולהגנה על שרשראות האספקה החקלאיות. שיטה זו, המבוססת על PCR, מאפשרת זיהוי מהיר וחסכוני של הפתוגן הגורם להכתמה הירוקה של ההדר ברקמות עלה, ובכך תומכת בקבלת החלטות להתערבות בזמן. באמצעות אספקת כלי אבחוני שניתן להרחבתו, היא מגבירה את הביטחון החזוי באסטרטגיות לניהול מחלות עבור משקי הדרים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר זיהוי ספציפי של .Candidatus liberibacter spp באמצעות הגברה של DNA ריבוזומלי Las16S ורצפי אינסרט LAA2/LAJ5, ובכך תומך בתיקוף המטרה במחקר של פתוגנים בצמחים.
- ערך תפעולי: משתמש ב-PCR קונבנציונלי עם דרישות מינימליות לציוד, מה שמאפשר סריקה מהירה של דגימות רקמת הדרים לנוכחות הפתוגן.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: יוצר פסי אמפליקון נפרדים ב-500 bp וב-700 bp לזיהוי פתוגנים, עם בקר פנימי של 400 bp (גן F-box של הדרים) להבטחת תקינות הבדיקה ולהפחתת תוצאות שגויות שליליות.
- ערך תפעולי: ניתן להתאמה לניתוח כמותי כגון RT-qPCR, המאפשר מדידת עומס פתוגנים וסטנדרטיזציה של הבדיקה בין סדרות של דגימות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בתיקוף מערכות רלוונטיות למחלה על ידי זיהוי פתוגן ברקמת עלה של הדר לפני הופעת תסמינים, ובכך מקל על מחקרים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של אינטראקציות בין מאח ופתוגן.
- ערך תפעולי: מאפשר שחזור של תוצאות זיהוי בין מעבדות השונות הודות לפרוטוקולים סטנדרטיים של מיצוי DNA ו-PCR, ובכך תומך בשיתוף פעולה רב-תחומי בביוטכנולוגיה חקלאית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ותומכת בבדיקת השערות ובצמצום סיכונים ביולוגיים במחקר על פתוגנים של צמחים, לפני המעבר למחקרים מכניסטיים או תרגומיים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי אישור נוכחות פתוגן ברקמת הדרים, ובכך מבהירה את הבסיס הביולוגי של מחלת הפיסול (citrus greening).
- סריקה: מספקת DNA גנומי מרקמת עלה המוכן לבדיקה, מה שתומך בזיהוי פתוגן הדיר ובהתאמה כמותית ליישומים של סריקה.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של ריכוז DNA באמצעות ספקטרופוטומטריה וזיהוי איכותני של הפתוגן באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל, מה שמאפשר ניתוח השוואתי בין דגימות נגועות לבריאות.
- מחקר תרגומי: תומכת ברצף מהגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של פתוגנים בדגימות רקמה, דבר המנחה החלטות קידום מבוססות סיכון בניהול המחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת תהליך עבודה אבחנתי בר-שימוש חוזר למעקב אחר פתוגנים בהדרים, שניתן ליישם לאורך עונות שונות ובאזורים גיאוגרפיים שונים עם שינויים מינימליים בפרוטוקול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בזיהוי פתוגנים באמצעות הגברה ספציפית של יעדי DNA של .Candidatus liberibacter spp, ובכך מפחית עמימות מכניסטית באטיולוגיה של המחלה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והשחזור דרך שלבי מיצוי DNA, PCR ואלקטרופורזה של ג'ל מוגדרים, מה שמאפשר תוצאות עקביות בין משתמשים ומעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת יותר (go/no-go) בניהול גידולים על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של צמחים נגועים, ובכך מפחית סיכון ביולוגי וכלכלי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע לתיעדוף מותאם סיכונים של מאמצי הפחתת המחלה על ידי זיהוי נוכחות הפתוגן לפני שנגרם נזק נרחב לגידולים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בסיסית בביולוגיה מולקולרית בטכניקות של מיצוי DNA, PCR ואלקטרופורזה של ג'ל.
- תלוי בגישה לציוד מעבדה סטנדרטי הכולל צנטריפוגה, תרמוסייקלר, ספקטרופוטומטר ומכשיר UV transilluminator.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות וכימות ה-DNA כדי להבטיח רגישות זיהוי עקבית בין דגימות רקמה שונות.
- יש להתחשב בריכוז משתנה של הפתוגן ברקמת הדרים, מה שעשוי להשפיע על גבולות הגילוי ולחייב חזרות של הדגימות במקרים של titer נמוך.
- מוגבל בשל חוסר היכולת לגדל *Candidatus liberibacter* spp. בתרבית in vitro, מה שהופך את הזיהוי מבוסס ה-PCR לחיוני עבור זיהוי ותיקוף של הפתוגן.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Isolation of Genomic DNA from Plant Tissue
5:04
Perform PCR on Genomic DNA Samplesand Electrophoresis of the Amplified DNA II. Isolation of Genomic DNA from Plant Tissueon an Agarose Gel
7:34
Results: PCR Amplification of Genomic DNA to Identify the Citrus Greening Bacterium
8:52
Conclusion
