Name: ספציפית, איתור מדויק של spp. הפתוגן ירוק הדרים Candidatus liberibacter באמצעות PCR המקובלת על דגימות רקמה עלה הדרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: למד זיהוי מדויק של פתוגן הירוקון בהדרים Candidatus liberibacter בדגימות עלי הדרים באמצעות PCR. שיטה זו מאפשרת לחקלאים ולחוקרים לזהות במהירות את הנגיף הפוגע ביבולי ההדרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

וימשיג, ע מ ו צ ש פ; החקירה, ח ג, ג' C ו- F ש צ; משאבים, צ ש פ; כתיבת - הטיוטה המקורית, א פ א; כתיבה – סקירה & עריכה, פ א א, י ג, ה ג, S. T ל' ו צ ש פ; ויזואליזציה, ה ג; פיקוח, צ ש פ; מימון הרכישה, צ ש F ול' ש פ
פרוייקט הנתמך על ידי דרום קרוליינה שיפור המורה איכות ההשכלה הגבוהה המדינה מענק שכותרתו שיפור האמצעי ציונים מורים למדע של הידע של הצמח תהליכים, מבנים, פונקציות באמצעות מעורבות במחקר מדעי הצמח (צמח מדע)
קרנות הוענק על ידי יונייטד משביעה את משרד החינוך (CFDA מספר 84.367B)
המחברים רוצה להודות ד ר וואנג Nian באוניברסיטת פלורידה למתן דגימות דנ א גנומי מן נגוע סיננסיס הדר ולנסיה.

1. לבודד דנ א גנומי מרקמות הצמח באמצעות ערכת חילוץ גנומית
<ol><li>להשיג את רקמת העלה הדר על ידי חיתוך רענן כל העלים מעץ הדרים באמצעות מספריים נקי, ולמקם העלה לשקית פלסטיק נקי אוכל. הערה: התיק המכיל את רקמת העלה יוצבו במקרר 4 ° C או על קרח במיכל מבודד בהקדם האפשרי לאחר אוסף כדי למנוע קלקול.</li>
	<li>להוסיף כמות קטנה של חנקן נוזלי להרגע ומכתש. בעוד הם הם מצמרר, להשתמש במספריים לחתוך חתיכה קטנה של רקמת העלה, כ 1 אינץ ' רבוע בגודל. מקם את הרקמה לחתוך המליטה לעצור באופן מיידי את זה. להוסיף עוד חנקן נוזלי, במידת הצורך. הערה: כפפות מבודדות צריך תמיד להיות משוחק תוך טיפול בחנקן נוזלי.</li>
	<li>במהירות לטחון את רקמת הצמח לאבקה בסדר בעזרת המרגמה. המשך שחיקה עד החנקן הנוזלי מתאדה לגמרי, נותרה אבקה ירוקה.</li>
	<li>בקצרה צינת מרית מתכת בחנקן נוזלי עבור s 10-15, לאחר מכן סקופ הרקמה הקרקע בתוך המליטה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL, בעזרת המרית.</li>
	<li>להוסיף 600 µL של פתרון פירוק גרעיני (ראה טבלה של חומרים) באמצעות פיפטה µL 1000 ו מערבולת המדגם עבור s 1-3, ואז דגירה באמבט מים 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
	<li>להוסיף 3 µL של פתרון RNase lysate באמצעות פיפטה 10µL, להפוך את הצינור 2 - 5 פעמים כדי לערבב את זה, דגירה-37 מעלות צלזיוס חממה בארון למשך 15 דקות. הערה: אפשר לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של חלבון משקעים פתרון, מערבולת על מהירות גבוהה עבור 20 s ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 13,000 g x כדי ליצור גלולה המשרד. בעוד הוא להיות centrifuged לדוגמה, להוסיף µL 600 של אלכוהול איזופרופיל בטמפרטורת החדר צינור microcentrifuge mL 1.5 טריים.</li>
	<li>באמצעות פיפטה µL של 1000, הסר בזהירות את תגובת שיקוע מדגם centrifuged, העברת אותו הצינור microcentrifuge mL 1.5 טריים המכילים אלכוהול איזופרופיל. עכשיו יכול להיות מושלך בגדר. הערה: להימנע מזיהום את תגובת שיקוע עם חלבונים על ידי השארת כמות מזערית של תגובת שיקוע מעל בגדר.</li>
	<li>היפוך הצינור עד ה-DNA הופך לגלוי כמו מסה של חוט כמו קווצות ולאחר מכן צנטריפוגה-13,000 g x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Decant את תגובת שיקוע, להוסיף 600 µL של 70% אתנול בגדר, להפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את ה-DNA, צנטריפוגה-13,000 g x עבור 1 דקות.</li>
	<li>בזהירות תשאף האתנול, עוזב בגדר DNA חופשי, ואז פתח, היפוך ברכבת התחתית, נח על נייר סופג. האוויר יבש בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
	<li>להוסיף 100 µL של ה-DNA התייבשות פתרון בגדר דנ א מיובשים, ולאחר מכן דגירה הדנ א באמבט מים 65 ° C עבור 1 h, תוך כדי ערבוב מדי פעם על-ידי הקשה ברכבת התחתית.</li>
	<li>מקום 1 µL של מים מטוהרים על microcuvette ולאחר להכניס אותו לתוך ספקטרופוטומטרים כדי לשמש מקום ריק. חשב את ריכוז הדנ א הנוכחי על-ידי הצבת µL 1 מדגם microcuvette ולאחר הוספת ספקטרופוטומטרים. ריכוז ה-DNA (ng/µL) יכול להיות גורם דילול מחושב כמו (260-320) × × 50 ng/µL. הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. ניתן לאחסן את הדגימה ב 4 º C.</li>
</ol>2. לבצע את ה-PCR על דגימות דנ א גנומי
<ol><li>לשלב 10 µL 2 x PCR מאסטר לערבב (ראה טבלה של חומרים), µL 1 קדימה פריימר (pM 10/µL), 1 µL הפוך פריימר (pM 10/µL) (ראה טבלה 2 רצפים פריימר), 100 ננוגרם של דנ א גנומי שחולצו מן המדגם, וטיהרו מים (עד 20 נפח סופי µL) ב 50 µL PCR צינור קפיצי לערבב, בקצרה צנטריפוגה.</li>
	<li>להכניס את הצינור PCR thermocycler ולהפעיל בהתאם (ראה טבלה 1). הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. במידת הצורך, לאחסן מדגם ב 4 ° C בתום התגובה.</li>
</ol>3. ה-DNA מוגבר בג'ל Agarose electrophorese
<ol><li>שוקל 0.4 g agarose אבקת ולהוסיף אותו יחד עם מאגר x TAE 1 נקי 200 מל Erlenmeyer את הבקבוק, מילוי עד 50 מ.</li>
	<li>מבשלים במיקרוגל בחום גבוה למשך דקות 1.5, רועדת בכל 30 s, עד agarose הוא להתמוססות מלאה. הערה: כפפות מבודדות לענידה לטיפול agarose נוזלי כדי למנוע כוויות.</li>
	<li>להוסיף 2.5 µL של 10 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד agarose נוזלי ו- shake לערבב ולאחר מכן שופכים את הג'ל agarose נוזלי לתוך תבנית ג'ל ברמה. להוסיף במהירות מסרקים ג'ל 12-שן רגילה לאחר שמזג.</li>
	<li>לאפשר את הג'ל להתקרר למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר את הג'ל מסרקים, ולמקם את הג'ל לתוך קופסת ג'ל ברמה מלא עם מאגר x TAE 1.</li>
	<li>שימוש של micropipette, לטעון את דגימות ה-DNA מוגבר הכולל לתוך בארות. להוסיף 5 µL של ה-DNA סולם (ראה טבלה של חומרים) לבאר נפרד מדגימות שלך.</li>
	<li>Electrophorese את הדגימות במשך 35 דקות קבועה 90 V, ולאחר מכן להסיר את הג'ל ולמקם transilluminator UV.</li>
	<li>צילום ולנתח את הג'ל פסי צבע דפוס תוך שימוש UV transillumination-302 ננומטר.</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

חן הואן, איאן ארתור פאלמר, ג'יאן חן, מינג צ'אנג, סטיבן ל' תומפסון, Fengquan Liu ו פו צ'ינג ג'נג מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

. זה קריטי כי כל השלבים עוקבים בדיוק כדי להשיג את התנאים האופטימליים ניסיוני רקמת כל העלה שימש במהלך הפגנה זו; עם זאת, ניתן לשנות בפרוטוקול תיאורטית לכלול כל סוג של רקמת הצמח. בעבר, חוקרים מופק דנ א גנומי רקמת הווריד של העלה, יותר מאשר רקמת העלה כולו, השיגו תוצאות דומות11. אם הלהקה התואם הגן FBOX הדר נכשל להופיע, התוצאה אינה חוקית, ייתכן שיש אחד או יותר של מספר שגיאות טכניות בהליך הפעלה. השגיאות הנפוצות כוללות: באמצעות מים מזוהמים או לא סטריליים, טיפים micropipette או צינורות microcentrif...

הדר ירוק, הידוע גם בשם huanglongbing, גרמה לאובדן משמעותי של עצי הדר. במקרה זה פלורידה, שבו המחלה היא תחזית כדי לגרום 70% לירידה בייצור של פלורידה כתום תיבות של 244 מיליון תיבות עונת 1997-1998 70 מיליון תיבות עד 2016-2017 עונה1 מעל 90% של עצי הדר בפלורידה הם נגועים2, ההערכה היא כי תעשיית הדר פלורידה מאבד כמיליארד דולר בשנה עקב מחלות הדרים, שבו הדר ירוק ממלא תפקיד מרכזי3. ירוק הדר מופצת בעיקר על ידי פולשני psyllid אסיה הדרים Diaphorina קמחית, אבל גם יכול להיות להתפשט על-ידי הארכת רקמות הנגוע. המחלה גורמת הצהבה של ורידים, עלה הצהובים סימטרית mottling, defoliation מוקדמת, dieback זרד, שורש, ומוות של הצמח. חשוב לציין, המחלה גורמת תחנת הדר כדי לייצר פרחים מחוץ לעונה, אשר לעתים נדירות מייצרים פירות. הפרי המיוצר על ידי צמחים נגועים הדר הן ילדותי, ירוק ומריר טעימות4.
מטרת שיטה זו היא מדויקת ואת לזהות במדויק את החיידק תאי Candidatus liberibacter spp., סוכן סיבתי של ירוק הדרים, שחיו במרחק שיפה של עצי הדר נגוע5. דנ א גנומי מופק מרקמות העלה כולו, אשר מכיל חיידקים חיים. את הדנ א הגנומי שחולצו משמש כתבנית עבור PCR קונבנציונאלי, איפה oligonucleotides משלימים לרצף rDNA מטוסי אף-16 של החיידק משמשים כדי להגביר את הרצף הזה. Oligonucleotides משלים FBOX גן הדרים משמשים פקד הגברה פנימית. בחרנו להשתמש בשיטה זו, כי הוכח כדי להיות מוצלחת מחקר קודמות6.
בשיטה זו יש יתרון ברור של להיות פשוטה, זולה יחסית, ומסוגל לבצע במעבדה ביוכימיה בדרך כלל מאובזר בכל. בנוסף, ה-PCR נשאר שיטת ומדויקים מדויק ביותר עבור זיהוי הפתוגן הזה, בשל הקושי culturing הזאת הפתוגן7, ואת היכולת של המחלה לשרוד להתרבות במשך שנים בתוך המארח אסימפטומטיים8. מבחני ה-PCR מיוחדים שונים רבים השתמשו בהצלחה לזהות את הפתוגן; עם זאת, PCR קונבנציונאלי נשאר וזמינותו הפשוטה ביותר לצורך זיהוי מדויק וספציפי, במיוחד בתוך מארחים ללא תסמינים8.

<table><tbody><tr><td>אשף ערכת טיהור DNA גנומי</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>מקור לפתרונות ליזיס גרעינים, RNase, משקעי חלבון ו-DNA</td></tr><tr><td>חנקן</td><td>נוזלי מוצרי אוויר</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler pro עם לוח בקרה</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W</td> מיקרוגל <td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424 צנטריפוגה שולחנית</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 אמבט מים דיגיטלי</td><td>פישר מדעי</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>מרית מתכת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z283274</td><td></td></tr><tr><td>מרגמה ועלי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z247464</td><td></td></tr><tr><td>LSE מערבולת מיקסר</td><td>קורנינג</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי 10 &mu; טיפים L</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי 200 &mu; טיפים L</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי 1250 &mu; טיפים L</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr><tr><td>ערכת פיפטור בנפח משתנה</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>פישר כימי</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>בסיס טריס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>&mu; קובט</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>מגש יציקה ומסרקים הניתנים לערמה</td><td>Carolina</td><td>213655</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac ספק כוח בסיסי</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT System</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487EDU</td><td></td></tr><tr><td>ביוספקטרומטר בסיסי</td><td>Eppendorf</td><td>6135000009</td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל צינורות PCR</td><td>פישר מדעי</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq ירוק PCR מאסטר מיקס</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>פריימר קדימה</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>פריימר הפוך</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr>מים, <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>בדרגת PCR</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ סולם DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

ספציפית, איתור מדויק של spp. הפתוגן ירוק הדרים candidatus liberibacter באמצעות pcr המקובלת על דגימות רקמה עלה הדרים

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

הדר ירוק, הידוע גם בשם huanglongbing, היא מחלה הדר הרסני ravaging החוות הדרים באופן גלובלי. מחלה זו גורמת עלה הצהובים סימטרית mottling וריד הצהבה, defoliation, שורש דעיכה, בסופו של דבר, למותו של הצמח הדרים. כאשר נגוע, הצמחים הדר יש קצב גדילתם ומפיקים פרחים מחוץ לעונה. הפרחים האלה נדירות מניבים פרי, ואלו המניבים פירות הדר קטן, מריר, חריגה זה לא רצוי. מחלה זו היא התפשטה את psyllid הדר אסיאתי, Diaphorina קמחית, ועל ידי משתילים רקמת הדר נגועים. המחלה יש תקופת הדגירה ארוכה ומשתנה בתוך המפעל הדרים – לפעמים שנים, לפני הופעת התסמינים. ניסיונות תרבות פתוגן זה במבחנה כבר נכשל, ייתכן שעקב הנמוך ואת ריכוז לא אחידה של המחלה בתוך נגוע רקמות הדרים, או כי קשה לשכפל את הסביבה תנאים להצטיינות הצמיחה של הפתוגן. . זה קשה מאוד לזהות את המחלה לפני שהיא התפשטה, בשל תקופת הדגירה ארוכה שלו ואת היכולת של חוקרי תרבות את הפתוגן. כתוצאה מכך, המחלה רק הופכת נראית לעין לאחר השמדת לפתע התשואה כולה של חקלאי הדרים. המובאת כאן היא שיטת איתור מדויק וספציפי הפתוגן ירוק הדרים, Candidatus liberibacter spp. באמצעות ערכת חילוץ דנ א גנומי PCR. שיטה זו היא פשוט, יעיל, חסכוני, ו וישימה אנליזה כמותית. בשיטה זו ניתן להתאים לשימוש על כל רקמות הדרים; עם זאת, זה פוטנציאל מוגבל לפי הסכום של פתוגן נוכח הרקמה. ובכל זאת, שיטה זו לאפשר חקלאים הדר לזהות צמחים נגועים הדר קודם לכן, לבלום את התפשטות המחלה ההרסנית הזאת לפני זה יכול להתפשט עוד יותר.

תוצאה חיובית התשואות להקה ברורים המתאימים 500 bp טיריה Liberibacter Candidatus Las606/Lss6, ו/או להקה ברורים המתאימים ל- 700 bp Laa2/Laj5, מוסף בβ ribosomal מטוסי אף-16 אופרון9. הלהקה בקרת הגברה פנימית להופיע גם 400 bp. הלהקה הזאת מקביל הגברה של ג'ין FBOX הדר10, חייב להופיע על תוצאה להיחשב חוקיים (איור 1 , <strong class="xfig...

ירוק הדר היא מחלה הרסנית במיוחד להשפיע על גידולי הדרים באופן גלובלי. המוצג כאן שיטה פשוטה משתמש PCR, דנ א גנומי, הפקת רקמת העלה הדר לצורך זיהוי ומדויקים המחלה ירוק הדרים, Candidatus liberibacter spp.

ספציפית, איתור מדויק של spp. הפתוגן ירוק הדרים Candidatus liberibacter באמצעות PCR המקובלת על דגימות רקמה עלה הדרים

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות במדויק את הפתוגן הירוק של הדרים Candidatus liberibacter spp. ברקמת עלי הדר. שיטה זו מאפשרת לחקלאי הדרים ולחוקרים לזהות במהירות ובדייקנות את נוכחותו של פתוגן האחראי לגרימת ירק הדרים.המדגים את ההליך יהיה איאן פאלמר, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. שיטה זו יעילה, חסכונית וניתנת להתאמה לניתוח כמותי. בנוסף, ניתן לבצע אותו עם רמה מינימלית של ניסיון וציוד במעבדה.ראשית השתמש במספריים נקיים כדי לחתוך עלה טרי שלם מעץ הדר, והניח בשקית כריך ניילון נקייה. לאחר מכן מצננים מרגמה ועלי, על ידי הוספת כמות קטנה של חנקן נוזלי. לאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך חתיכות קטנות מרקמת העלה, בגודל של כסנטימטר רבוע.מניחים את חתיכות העלים במכתש כדי להקפיא אותם מיד. התחל לטחון במהירות את רקמת העלים עם המרגמה, עד שהחנקן הנוזלי מתאדה, ונשארת אבקה ירוקה דקה. לאחר מכן מצננים מרית מתכת בחנקן נוזלי, למשך 10 עד 15 שניות.לאחר מכן השתמש במרית הקרה כדי לגרוף את רקמת הקרקע מהטיט בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. השתמש בפיפט של 1000 מ"ל כדי להוסיף 600 מ"ל של תמיסת גרעינים לדגימה. לאחר מכן מערבל את הדגימה למשך שנייה עד שלוש שניות.דגרו את הצינור בחום של 65 מעלות צלזיוס, באמבט מים למשך 15 דקות. לאחר סיום תקופת הדגירה, השתמש בפיפט של 10 מ"ל כדי להוסיף 3 מ"ל של תמיסת RNA לליקאט כדי להסיר RNA. לאחר מכן מערבבים את תכולת הצינור על ידי הפיכתו פעמיים עד חמש פעמים.דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחממת ארון. לאחר 15 דקות הוסף לדגימה 200 מ"ל של תמיסת משקעים חלבון. מערבולת את הצינור במהירות גבוהה למשך 20 שניות.לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-13000G למשך שלוש דקות. במהלך הצנטריפוגה הוסף 600 מ"ל של איזופרופנול הנשמר בטמפרטורת החדר, לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל. לאחר סיום הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט מצינור הצנטריפוגה, לצינור המכיל איזופרופנול.השלך את הגלולה. הפוך את הצינור כדי שהדנ"א יהיה גלוי כמו חוט דמוי גדיל. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-13000G למשך דקה בטמפרטורת החדר.שפכו את הסופרנטנט לאחר צנטריפוגה. לאחר מכן הוסף 600 מ"ל של אתנול 70% לגלולה. הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את הגלולה.צנטריפוגה את הצינור ב-13000G למשך דקה אחת. לאחר סיום הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנטנט. לאחר מכן הפוך את הצינור כשהמכסה פתוח על נייר סופג לייבוש באוויר למשך 15 דקות.לאחר הייבוש הוסף 100 מ"ל של תמיסת הידרציה מחדש של DNA לגלולה. דגרו את תרחיף ה-DNA ב-65 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך שעה. הקש על הצינור מעת לעת תוך כדי ערבוב.הוסף 1 מ"ל מים מטוהרים במיקרו-קובטה. קרא את המים כריקים בספקטרופוטומטר. לאחר מכן הוסף 1 מ"ל מהדגימה במיקרו-קובטה.הנח את המיקרו-קובטה על הספקטרופוטומטר, וקבל את ריכוז ה-DNA. היוו את תגובת ה-PCR על ידי הוספת כל הריאגנטים, ו-100 ננוגרם של DNA גנומי בצינור PCR של 50 מ"ל. מערבבים את הריאגנטים על ידי החלקה עדינה של הצינור, ואחריו צנטריפוגה מהירה.הנח את צינור ה-PCR בתרמו-סייקלר והפעל את התוכנית. להכנת ג'ל האגרוז, שקלו 0.4 גרם אבקת אגרוז. לאחר מכן הוסיפו את אבקת האגרוז לבקבוק ארלנמאייר של 200 מ"ל, והתאימו את הנפח ל-50 מ"ל עם מאגר 1X TAE.מחממים במיקרוגל את תערובת האגרוז בעוצמה גבוהה למשך כ -1.5 דקות. ניעור כל 30 שניות עד שהאגרוז נמס לחלוטין. לאחר מכן, הוסף 2.5 מ"ל של 10 מיליגרם למיליליטר של אתידיום ברומיד לאגרוז הנוזלי.לאחר מכן יש לנער את הבקבוק כדי לערבב את האתידיום ברומיד, ולשפוך במהירות את ג'ל האגרוז הנוזלי בתבנית ג'ל ישרה. הכנס מיד מסרק ג'ל סטנדרטי של 12 שיניים. הניחו לג'ל להתקרר כ -20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסירו את מסרק הג'ל.כעת הנח את הג'ל המוצק ביחידת האלקטרופורזה המלאה במאגר 1X TAE. טען את דגימת ה-DNA המוגברת הכוללת ו-5 מ"ל של DNA מאוחר יותר בבארות נפרדות על הג'ל. הפעל את יחידת האלקטרופורזה, ב-90 וולט קבוע למשך 35 דקות.לאחר מכן הסר את הג'ל מיחידת האלקטרופורזה. לאחר מכן, הניחו את הג'ל על טרנסמאלייטור UV. צלם את התצלומים של דפוסי רצועות הג'ל בטרנס-אילומינטור ב-302 ננומטר.כדי לזהות את החיידק הירוק, ה-DNA הגנומי המוגבר של ה-PCR המתקבל מדגימות נגועות ולא נגועות עובר אלקטרופוריזציה. בג'ל רצועות אלה המתאימות ל-500 זוגות בסיסים מצביעות על נוכחות של אזור ספציפי של ה-DNA הריבוזומלי Las16S בחיידק CL asiaticas. רצועות אלה המתאימות ל-700 זוגות בסיסים מצביעות על נוכחות של LAA2/LAJ5, ומכניסות את הקיים ברצף ה-DNA של אופרון בטא ריבוזומלי 16S בחיידק.רצועות נפרדות אלה ב-400 זוגות בסיסים מצביעות על הגברה של הגן F-box הדרים בלבד, המתייחס לבקרת ההגברה הפנימית. כדי להחשיב את התוצאות שלנו כתקפות, נדרשת נוכחות של פס זה. נהפוך הוא, נוכחות של רצועה בלבד ב-400 זוגות בסיסים, אך היעדר הרצועות האחרות ב-500 ו-700 זוגות בסיסים מעיד על רקמת הדרים בריאה.לאחר שליטה בטכניקה זו ניתן לבצע תוך כארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. הליך זה עשוי להיות מותאם כדי לאפשר ביצוע של שיטות כמותיות יותר, כגון RTQPCR כדי לזהות את כמות הפתוגן הקיימת.

specific-accurate-detection-citrus-greening-pathogen-candidatus

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

מקור: גולה, ס. ואחרים. ניתוח חוזר של מספר משתנה רב-לוקוס של החיידק הפתוגני לדג Yersinia ruckeri באמצעות Multiplex PCR ואלקטרופורזה קפילרית. J. Vis. Exp. (2019).פרוטוקול זה מחלץ DNA גנומי מ-Yersinia ruckeri על ידי השעיית מושבות מבודדות במים אולטרה-טהורים ויישום חום ללירוק התאים. צנטריפוגציה מפרידה בין הסופרנטנט המכיל DNA לפסולת תאים, ומניבה תבנית DNA המתאימה לגנוטיפינג וניתוח אפידמיולוגי מבוסס PCR.

הפקת DNA גנומי מרקמת עלי צמח שנדבקה בחיידקים פתוגניים

מקור: צ'ן, ה. ואחרים. זיהוי ספציפי ומדויק של פתוגן ההקרנה של ההדר Candidatus liberibacter spp. באמצעות PCR קונבנציונלי על דגימות רקמת עלי הדר. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את חילוץ ה-DNA הגנומי הכולל מרקמת עלי הדר שנדבקה בחיידק פתוגני. הפרוטוקול מאפשר שחזור DNA אמין לגילוי מבוסס PCR בהמשך של הפתוגן המוגבל בפלום.

חילוץ DNA כולל מעלים לזיהוי זיהום חיידקי

כימות צמיחת פתוגנים הוא כלי רב עוצמה לאפיון תגובות חיסוניות שונות של Arabidopsis thaliana (להלן: Arabidopsis). השיטה המתוארת כאן מציגה בדיקת חדירת מזרק אופטימלית לכימות Pseudomonas syringae pv. מקוליקולה גידול ES4326 בעלים בוגרים של Arabidopsis.

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

PCR מקוננת היא טכניקה רגיש, ספציפית, וברור כי ניתן להחיל על שנתות ש-DNA תמציות כדי לחקור Borrelia burgdorferi, סוכן סיבתי של מחלת ליים. הניסוי הראשוני של ה-PCR משתמשת תחל גנים ספציפיים כדי ליצור amplicons ארוכה, אשר לאחר מכן הופכים תבניות עבור ריאקציה עוקבות באמצעות תחל פנימי.

זיהוי החיידק מחלת ליים, Borrelia Burgdorferi, בשנתות באמצעות PCR מקוננים

הנייר הזה מדווח הפרוטוקול עבור וזמינותו זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק מבוסס על טכנולוגיית בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה). הפרוטוקול דורש הכשרה מינימלית מעבדה, לכן, ניתן ליישם באתר בנקודות של ערך היבוא צמח כגון הקנתה ושדות תעופה.

בתיווך לולאה Assay איזותרמי הגברה (מנורה), עבור זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק

פיתחנו שיטה לזיהוי zoospores capsici Phytophthora במקורות מים באמצעות שיטת הפקת DNA נייר מסנן יחד עם לולאה בתיווך isothermal תוגבר (LAMP) essay שניתן לנתח בתחום או במעבדה.

זיהוי של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה בתיווך איזותרמית

בעבודה זו פותחה שיטת זיהוי מהירה, רגישה וניידת עבור Candidatus Liberibacter asiaticus המבוססת על הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a.

זיהוי קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס הניתן לפריסה בשטח באמצעות הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a

הנדסנו, יצרנו ותיקפנו מכשיר שמעבד במהירות רקמות עץ הדר עשירות בקליפת עץ הדר. בהשוואה לשיטות הנוכחיות, מחלץ רקמות Budwood (BTE) הגדיל את תפוקת הדגימה והפחית את עלויות העבודה והציוד הנדרשות.

אוטומציה של עיבוד Citrus Budwood לזיהוי פתוגנים במורד הזרם באמצעות הנדסת מכשירים

כתב יד זה מתאר מכשיר עירוי צמחי ישיר חדשני לבדיקת יעילותן של מולקולות כנגד החיידק (Candidatus Liberibacter asiaticus) או וקטור החרקים שלו (Diaphorina citri, Kuwayama) הקשורים בשילוב למחלת ההדרים Huanglongbing.

מכשיר עירוי ישיר להעברת מולקולות בצמחים

בפרוטוקול זה, מבחן CRISPR/Cas12a משולב להגברת פולימראז רקומבינאז מודגם לזיהוי הפתוגן הצמחי הפולש, Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical race 4.

בדיקת הגברה משולבת של פולימראז רקומבינאז CRISPR/Cas12a לאיתור Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

כאן, אנו מתארים הליך פשוט ומהיר לזיהוי DNA מפתוגנים של דבורים, כגון Lotmaria passim ו-Nosema ceranae, באמצעות ליזיס תאים מוכן להגברה, הגברת פולימראז רקומבינאז ומבחני CRISPR/Cas12a.

זיהוי DNA באתר של טפילים טריפנוזומטיים ו-nosema ceranae באמצעות ליזה אלקליין בשילוב עם מערכת RPA/CRISPR/Cas12a

למד זיהוי מדויק של פתוגן הירוקון בהדרים Candidatus liberibacter בדגימות עלי הדרים באמצעות PCR. שיטה זו מאפשרת לחקלאים ולחוקרים לזהות במהירות את הנגיף הפוגע ביבולי ההדרים.

ספציפית, איתור מדויק של spp. הפתוגן ירוק הדרים Candidatus liberibacter באמצעות PCR המקובלת על דגימות רקמה עלה הדרים

גלה סרטונים נוספים