מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות
6 במאי 2018
פרוטוקול זה מאפשר לקורא לנתח מלח מרה-induced ביופילמים בתוך פתוגנים המעית באמצעות גישה רב פנים כדי ללכוד באופי הדינמי של biofilms חיידקי על-ידי הערכת הדבקות, היווצרות מטריצה חוץ-תאית חומר הפולימרים, פיזור.
המטרה הכוללת של פרוטוקול היווצרות והערכה של ביופילם זה היא לקבוע את היכולת של פתוגנים חיידקיים במעיים ליצור ביופילם, במיוחד בתנאים המדמים מעבר במערכת העיכול וחשיפה למלחי מרה. השיטות יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפתוגנזה החיידקית, כגון יכולתם של פתוגנים מעיים לשרוד את תנאי מלח המרה הקשים של מערכת העיכול. היתרון העיקרי של הטכניקות הוא שהתוצאות המשולבות משלושת הבדיקות תומכות באפיון מעמיק של היווצרות ביופילם בתגובה לחשיפה למלח מרה עבור כל פתוגן.
לראשונה עלה לנו הרעיון לשיטות המשולבות, בהתחשב בצורך לכמת באופן מלא את היווצרות הביופילם המושרה על ידי מלח מרה ב-Shigella flexneri. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהיבטים של הבדיקה יכולים להגביל את יכולת השחזור. אז אנא שימו לב לשלבים הקריטיים, כדי להבטיח שחזור.
ידגימו את ההליכים חברים מהמעבדה שלי, קורטני ניצ'רסון, פוסט-דוקטורנט, ואלחנדרו יאנוס, עמית מחקר קליני. ראשית, סמן שני צינורות של 1.5 מיליליטר כ-TSB ו-TSB פלוס BS. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של TSB או TSB בתוספת BS לצינורות המתאימים. לאחר מכן, חסנו את הצינורות ב-20 מיקרוליטר תרבית לילה בדילול של אחד עד 50.
לאחר מכן הוסף 130 מיקרוליטר של אמצעי בקרה לא מחוסנים לכל אחת משלוש הבארות בצלחת סטרילית, שקופה, בעלת תחתית שטוחה, מטופלת בתרבית רקמות, 96 בארות. זה יהיה הפקד הריק. הוסף 130 מיקרוליטר של תרבית מחוסנת לכל אחת משלוש הבארות.
לאחר הוספת הבקרה והתרבית המחוסנת בבארות המתאימות, דגרו את צלחת 96 הבארות למשך ארבע עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, באופן סטטי. לאחר סיום הדגירה, הגדר את הבקרה כריקה בקורא הצלחות. לאחר מכן, שאפו את מדיום התרבות מכל באר.
לאחר מכן שטפו בעדינות את הבארות פעם אחת עם 200 מיקרוליטר PBS סטרילי. לאחר הכביסה יש לשאוף את ה- PBS ואז להפוך את הצלחת לייבוש למשך כ -20 דקות. חשוב מאוד להקפיד על הסרה עדינה של המדיה ושטיפה עדינה, כדי להבטיח שמטריצת ה-EPS לא תופרע.
לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של 0.5% סגול קריסטל לכל אחת מבארות הניסוי והבקרה. לאחר מכן דגרו את הצלחת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות יש לשטוף את הבארות פעם אחת עם 400 מיקרוליטר מים מזוקקים.
הוסף 200 מיקרוליטר מים מזוקקים כדי לשטוף את הבארות חמש פעמים. לאחר כל חמש השטיפות יש להפוך את הצלחת ולתת לה להתייבש לחלוטין, מוגנת מפני האור. על מנת להשיג תוצאות עקביות, חשוב שהדגימות ייבשו היטב לפני שתמשיך.
לאחר ייבוש הצלחת לחלוטין, השתמש ב -200 מיקרוליטר של אתנול 95% כדי להכתים את הבארות. לאחר מכן השאירו את הצלחת על השייקר למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, על מנת למנוע אידוי. לאחר 30 דקות, רשום את ה-OD 540 בקורא הלוחות.
לזיהוי כמותי למחצה של EPS, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר את מדיום התרבות לצלחת ברורה של 96 בארות. לאחר מכן השתמש ב -200 מיקרוליטר של מגיב קיבוע כדי לתקן את הצלחת השחורה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. כעת רשום את קריאת OD 600 על ידי הגדרת הפקד היטב כריק לסטנדרטיזציה.
לאחר מכן רשום את קריאת המדיום התרבותי בזמן שהאוכלוסייה החסידה מתקנת. לאחר השלמת הקיבוע, הסר את המגיב והשליך פנימה את הפסולת המסוכנת. לאחר מכן השתמש ב -200 מיקרוליטר PBS סטרילי כדי לשטוף בעדינות את הבארות פעמיים.
לאחר הכביסה יש לשאוף את ה- PBS. לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של 25 מיקרוגרם למיליליטר של ConA-FITC. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
לאחר הדגירה יש לשטוף בעדינות את הבארות עם 200 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן הוסיפו 150 מיקרוליטר PBS לכל באר, ורשמו את הקרינה ב-488 ננומטר. לאחר הכנת ריאגנטים טריים, יש לחמם את ה-PBS, PBS עם גלוקוז, PBS עם מלחי מרה, ו-PBS עם גלוקוז ומלחי מרה ל-27 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן רשום את ערכי OD 600 מלוח הביופילם הלילה בקורא הלוחות על ידי הגדרת הפקד כריק. לאחר מכן, שאפו את מדיום התרבות באמצעות קו ואקום, מבלי להפריע לאוכלוסייה הדביקה על משטח הפלסטיק. שוטפים בעדינות את הבארות פעמיים עם 200 מיקרוליטר PBS סטרילי.
לאחר שטיפה עם PBS, הוסיפו 130 מיקרוליטר של PBS שחומם מראש, PBS עם גלוקוז, PBS עם מלחי מרה, ו-PBS עם מלחי מרה וגלוקוז לכל אחת משלוש הבארות, ואז דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, הוציאו את הצלחת מהחממה. פיפטה הסופרנטנט יוצא לצלחת סטרילית טרייה של 96 בארות.
לבסוף, הכינו 1 עד 10 דילולים סדרתיים של הסופרנטנט עם PBS בצלחת 96 הבארות, או בבלוק דילול. לאחר מכן השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר חמישה מיקרוליטר מכל דילול על לוחות אגר LB. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
למחרת, ספרו את מספר המושבות. עלילת העמודות מתקבלת כדי לכמת את היווצרות הביופילם התלויה במלח מרה בפתוגנים אנטריים. זה נעשה על ידי התוויית ערכי OD 540 של הזנים הבודדים בנוכחות ובהיעדר מלחי מרה במדיום.
התרשים מראה עלייה משמעותית בהיווצרות הביופילם עבור רוב זני הפתוגן, למעט Enteroaggrative E.Coli. לאחר מכן, ה-EPS המיוצר במהלך היווצרות הביופילם מזוהה על ידי קביעת כמות ה-ConA-FITC שנשמרה על ידי ה-EPS. תרשים הבר מראה קריאת פלואורסצנטיות מוגברת משמעותית בנוכחות מלחי מרה.
זה מאשר ייצור EPS לפתוגן Shigella flexneri. כאן, צביעה תלויה ב-ConA-FITC של מטריצת ה-EPS גבוהה משמעותית כאשר היא נחשפת למלחי המרה. זה מצביע על היווצרות ביופילם חיידקי, המאופיין במטריצת EPS עשירה בפוליסכרידים.
One X PBS ו-DAPI משמשים כדי להראות ספציפיות תלויה ב-FITC ונוכחות של ה-DNA החיידקי, בהתאמה. לבסוף, מספר היחידות היוצרות מושבה נספר כדי לנתח את הפיזור התלוי במלח המרה של חיידקים מהביופילם. התרשים מראה שהחיידקים מתפזרים בקלות מהביופילמים ב-PBS ו-PBS עם גלוקוז.
עם זאת, חשיפת החיידקים למלחי מרה מעכבת באופן דרסטי את פיזורם מהביופילמים. בדיקות אלו פותחו כדי ללכוד ולכמת את הביופילמים האלימים החולפים שנוצרו על ידי פתוגנים אנטריים, במיוחד Shigella flexneri, בתגובה לחשיפה למלח מרה במעי הדק לפני זיהום במעי הגס. ייתכן שיהיה צורך להתאים שינויים בבדיקות, כגון סוגי אמצעי הבסיס, הרכב מלחי המרה המשמשים ותנאי גידול חיידקים, עבור פתוגנים שונים, בהתאם לאתר הזיהום במערכת העיכול.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע כל אחת מהבדיקות כדי להעריך ביסודיות את היווצרות הביופילם בזן החיידקים או המוטנטיים המעניין שלך. זכור שעבודה עם הפתוגנים וחלק מהפתרונות יכולה להיות מסוכנת ביותר. תמיד יש לקחת בחשבון אמצעי זהירות כגון שיטות טיפול וסילוק מתאימות בעת ביצוע בדיקות אלו.
יתר על כן, הכנת מצע מלח מרה טרי, בקרות נאותות והבטחת שחזור ניסיוני חיוניים לניתוח הנתונים ולאישור פנוטיפ הביופילם המושרה על ידי מלח מרה. הטכניקות, שהן יישומים ייחודיים ויצירתיים בתפוקה גבוהה של שיטות מסורתיות, יאפשרו כימות מתאים של התהליך הרב-גוני והדינמי של היווצרות ביופילם המושרה על ידי מלח מרה בפתוגנים אנטריים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מאפשר את ניתוח היווצרות הביופילם המושרה על ידי מלחים של מרה בפתוגנים מעיים, תוך התמקדות בהיצמדות, ביצירת מטריצת חומרים פולימריים חוץ-תאיים (EPS) ובפיזור. מטרתו היא לאפיין ביופילם חיידקי בתנאים המדמים מעבר במערכת העיכול.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- פתוגנזה
- מחקר ביופילם
רקע
- פתוגנים חיידקיים של מערכת העיכול יכולים להוות ביופילמים בדרכי העיכול.
- מלחים של חומצי מרה מהווים סביבה קשה להישרדות חיידקים.
- הבנת היווצרות הביופילמים חיונית לטיפול בפתוגנזה חיידקית.
- השיטות המשולבות משפרות את אפיון התגובות של הביופילם.
מטרת המחקר
- לקביעת יכולתן של פתוגנים של מערכת העיכול להיווצרות ביופילמים בתנאי מלחים של מרה.
- לתמיכה באפיון מעמיק של היווצרות ביופילמים.
- מענה לשאלות מפתח בפתוגנזה חיידקית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הערכת ההיצמדות למשטחים.
- הערכה של היווצרות מטריקס של חומרים פולימריים חוץ-תאיים.
- ניתוח של פיזור הביופילם.
- בדיקות משולבות לקבלת תוצאות מקיפות.
תוצאות עיקריות
- אפיון מפורט של היווצרות ביופילם בתגובה למלחים של חומצות מרה.
- זיהוי שלבים קריטיים להשגת הדירות (reproducibility) בבדיקות.
- תובנות לגבי מנגנוני ההישרדות של פתוגנים במעי.
- ביסוס ההשערה בנוגע לעמידות הביופילם בסביבות קשות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק מסגרת חזקה לחקר דינמיקת ביופילם.
- שלבים קריטיים חיוניים להבטחת השחזוריות.
- הממצאים תורמים להבנת ההישרדות הבקטריאלית בדרכי העיכול.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
פרוטוקול זה מאפשר לצוותי מו"פ בביופארמה להעריך היווצרות ביופילם המושרה על ידי מלחים של חומצי מרה בפתוגנים של מערכת העיכול, מנגנון ארס (virulence) מרכזי התומך בהישרדות הפתוגן במהלך המעבר במערכת העיכול. על ידי כימות ההיצמדות, ייצור חומרים פולימריים חוץ-תאיים (EPS) ופיזור תחת חשיפה למלחים של חומצי מרה, השיטה מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית לאישור יעדים (target validation) בגילוי תרופות אנטי-אינפקטיביות. גישת הרב-בדיקה בעלת התפוקה הגבוהה תומכת בביטחון ניבוי בזיהוי תרכובות או התערבויות גנטיות המשבשות את עמידות הביופילם, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות בשלבי הפיתוח המוקדמים של פורטפוליו המוצרים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי קישור חשיפה למלחים של חומצי מרה למסלולי הישרדות המתווכים על ידי ביופילם בפתוגנים כגון Shigella flexneri.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדידה כמותית של היווצרות ביופילם כקריאה פנוטיפית של virulentce.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי אפיון ייצור מטריצת EPS ועיכוב פיזור, ובכך מסייע בתעדוף מטרות עבור אסטרטגיות נגד ביופילם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקה המשכית על ידי ביסוס תנאים לשחזור של יצירת ביופילם בפורמט של פלטה עם 96 בארות.
- פלט כמותי: מייצרת מדידות סטנדרטיות באמצעות OD 540 של קריסטל ויולט להערכת היצמדות ופלואורסצנציית ConA-FITC עבור EPS, מה שמאפשר סריקת תרכובות כנגד פנוטיפים של ביופילם המושרים על ידי מלחים של מרה.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תומכת ביכולת הרחבה (scalability) ובהתאמה לנתיבי פתוגנים שונים, ומאפשרת הערכה עקבית של יצירת ביופילם בשבטי מעי תחת תנאים מבוקרים של מלחים של מרה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תגובת דחק רלוונטית קלינית המתרחשת במהלך מעבר במעי, בהלימה עם מודלים פרה-קליניים של זיהום מעי.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאי גילוי מוקדמים לתיקוף פרה-קליני באמצעות אספקת מדדי ביופילם כמותיים המתואמים עם הישרדות הפתוגן.
- החלטות מותאמות סיכון: מאפשר הערכה של עיכוב פיזור תחת מלחים של מרה, תכונת וירולנציה מרכזית, כדי לספק מידע עבור מועמדים להמשך או הפסקה (go/no-go) המכוונים לשיבוש ביופילם.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות על מטרות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ובכך מספקת תיקוף פנוטיפי של יצירת ביופילם כמנגנון virulent לפני המעבר למחקרי יעילות פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי היווצרות ביופילם המושרה על ידי מלחים של חומצות מרה כמנגנון הישרדות, מה שמאפשר הבהרה של מסלולים ביולוגיים והורדת סיכונים ביולוגיים של מטרות וירולנציה.
- סינון: מספק מוכנות של הבדיקה ופלט כמותי הניתן לשחזור (היצמדות באמצעות OD 540, EPS באמצעות פלואורסצנציה) לצורך הערכה מהימנה של תרכובות בסריקות ראשוניות ומשניות.
- אנליזה: מספק קריאות המוכנות לניתוח סטטיסטי ממדידות של בארות בשלוש חזרות, מה שמקל על השוואה בין זנים ובחירת פגיעות (hits) בהתבסס על עיכוב ביופילם או שחזור פיזור.
- מחקר תרגומי: מקשר פנוטיפים של ביופילם להמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול של גורם סטרס גסטרו-אינטסטנלי מרכזי, ובכך תומך בהערכת וירולנציה המותאמת לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: קובע פרוטוקול סטנדרטי ומודולרי שניתן להתאימו למגוון פתוגנים והרכבי מלחים של חומצות מרה, ובכך מפחית פיתוח כפול של בדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי כימות יצירת ביופילם כגורם קובע של וירולנציה תחת תנאים רלוונטיים פתופיזיולוגיים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות שלבים קריטיים מוגדרים (שטיפה עדינה, ייבוש, הסרת צבע) ומדידות רב-פרמטריות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור הפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות אנטי-וירולנציה, ובכך מפחית כשלונו של השלב המאוחר בשל עמידות המתווכת על ידי ביופילם שלא טופלה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות זיהוי תרכובות המשחזרות פיזור או מעכבות ייצור EPS, המשפיעות באופן ישיר על הוירולנציה בסביבות של מלחים של חומצות מרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות מיקרוביולוגיות, טיפול סטרילי בפתוגנים וביצוע בדיקות מבוססות פלטה.
- תלוי בקוראי פלטות ספקטרופוטומטריים ופלואורסצנטיים המסוגלים לזיהוי OD 540, OD 600, ועירור/פליטה באורך גל של 488 nm.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של שלבים קריטיים, כגון עדינות השטיפה וזמן הייבוש, כדי למנוע הפרעה למטריצת ה-EPS ולהבטיח עקביות בנתונים.
- דורש התאמה של מצע הבסיס והרכב מלחות המרה כאשר ממדלים נישות גסטרו-אינטסטינליות שונות או זני פתוגנים שונים.
- מגבלה מעשית: רגישות הבדיקה לשונות פרוצדורלית מחייבת הקפדה קפדנית על שלבי הפרוטוקול לצורך כימות הדיר בביצועי היווצרות ופיזור של ביופילם.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Title
1:08
Solid-phase Adherence Assay
3:55
Extracellular Polymeric Substance Matrix Detection
5:20
Dispersion Assay
7:07
Results: Use of Solid-phase Adherence and Extracellular Polymeric Substance Matrix Formation to Detect Biofilm Formation and Dispersion
8:43
Conclusion
