Name: מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: חקור את יכולתם של פתוגנים מעיים ליצור ביופילמים בתנאי מלח מרה קשים. הפרוטוקול משלב שלוש שיטות לכימות הידבקות, מטריצת חומר פולימרי חוץ-תאי ופיזור ביופילם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים חנין B. רייצ'ל, אלחנדרו יאנוס-Chea לקבלת סיוע טכני. אנו מודים אנתוני ט Maurelli, בריאן פ הארלי, אלסיו פאסנו, ברט אי Swierczewski ו בובי Cherayil על זנים השתמשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה K22AI104755 גרנט מחלות זיהומיות (C.S.F.). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

1. הכנת נוגדנים
<ol><li>מלחי מרה בינוני: כדי להכין ציר סויה tryptic (TSB) המכיל מלחי מרה 0.4% (משקל/נפח), resuspend 200 מ ג של מלחי מרה ב 50 מ ל TSB בלוק. מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. הפוך בינוני טריים מדי שבוע. הערות: מלחי מרה בשימוש שגרתי הוא תערובת 1:1 של cholate נתרן, סודיום deoxycholate מבודד gallbladders ovine ושור. כפי שמתואר בעבר4, הנוכחות של גלוקוז היה צורך מלח מרה-induced ביופילמים. TSB הוסיפה גלוקוז ביחס מרק לוריא-Bertani (LB); לכן, היה מספיק כדי לגרום ביופילמים שיגלה , פתוגנים אחרים המעית מנותח. בהתאם לחיידקים להיות מנותח, ריכוזי גלוקוז שונים או דרישות סוכר שונים יש צורך בהזמנה.</li>
	<li>0.5% w/v קריסטל ויולט במים: להמיס 2.5 גר' קריסטל ויולט במים מזוקקים 500 מ"ל. מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>Concanavalin A (ConA) מצומדת כדי fluorescein isothiocyanate (FITC): לשקם את המניה ב- 1 x PBS. לדלל את המניה 10 mg מרוכז עם μL 400 ל- PBS 1 x כדי ריכוז סופי של 25 µg/mL, להגן מפני אור.</li>
	<li>PBS + גלוקוז: להמיס 0.2 גרם גלוקוז ב- PBS 1 x 10 מ"ל (2% w/v גלוקוז הסופי). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להפוך טרי ביום של שימוש.</li>
	<li>PBS + מלחי מרה: להמיס 40 מ"ג ב- PBS 1 x 10 מ"ל (0.4% w/v מלחי מרה הסופי). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להפוך טרי ביום של שימוש.</li>
	<li>PBS + גלוקוז, מלחי מרה: להמיס מלחי מרה 40 מ"ג ו- 0.2 גר' גלוקוז ב- PBS 1 x 10 מ"ל (מלחי מרה w/v 0.4% ו- 2% w/v גלוקוז הסופי). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להפוך טרי ביום של שימוש.</li>
	<li>להכין פלטות אגר ליברות.</li>
	<li>פורמלדהיד/גלוטראלדהיד תיקון: 810 להוסיף µL פורמלדהיד (37% מניות פתרון, הריכוז הסופי של 3%) ו- 125 µL גלוטראלדהיד (25% מניות פתרון, הריכוז הסופי של 0.25%) כדי PBS 1 x 14 מ ל. לערבב היטב ולאחסן ב 4 º C. התיקון צריך להיות קר לשימוש הנכון. התראה: התיקון הוא רעיל ואינו דורש סילוק פסולת מסוכנת.</li>
	<li>פתרון antifade mountant: להשתמש בפתרון antifade mountant המכיל 4, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כתם לעכב photobleaching דוגמאות מיקרוסקופ immunofluorescent בעת fluorescently מכתים את ה-DNA של החיידק.</li>
</ol>2. הכנה של חיידקים
<ol><li>לגדול תרבויות לילה של זנים חיידקי להיבדק ע י מזריקים 3 מ"ל של TSB עם מושבה בודדת, מבודד היטב בשפופרת תרבות סטרילי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-225 rpm עבור לילה דגירה (16-24 שעות). הערה: זנים צריך להיות restreaked מן המקפיא מניות כל 2 כדי 4 שבועות, מתוחזק על צלחות לא ישן יותר משבועיים.</li>
</ol>3. מוצק-שלב הדבקות Assay
הערה: זו assay מכמתת חסיד חיידקים באמצעות שיטת צלחת 96-ובכן. חיידקים גדלים באופן סטטי לוחות שטוחים. הכביסה מתבצע כדי להסיר חיידקים שאינם מחסידי, חיידקים חסיד מוכתמים קריסטל ויולט. הכתם קריסטל ויולט נקשר פפטידוגליקן בתוך הקיר תא החיידק, יכול להיות solubilized באמצעות אתנול. המספר של חיידקים חסיד נקבע בהתבסס על קריסטל ויולט השמירה.
<ol><li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + מלחי מרה (BS).</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.</li>
	<li>לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (ב- 1:50 דילול).</li>
	<li>בצלחת 96-ובכן סטרילי, נקי, שהונעו, שטופלו תרביות רקמה, להוסיף µL 130/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג מדיה (TSB ו TSB + BS) להיבדק.</li>
	<li>להוסיף µL 130/טוב של תרבות חוסנו משלוש בארות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה דולר.</li>
	<li>תקופת דגירה של 4-24 h ב 37 ° C באופן סטטי.</li>
	<li>שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר600. הגדר הבארות שליטה כמו 'blank'. לאשר שאמצעי שליטה ברור ללא עדות של עכירות. אם כל עכירות מזוהה, למחוק את הניסוי. הערכים600 OD יכול לשמש כדי לנרמל את הנתונים אם ישנם הבדלים משמעותיים בשיעור צמיחה בין זני חיידקים.</li>
	<li>הסר את המדיום תרבות באמצעות קו ואקום על ידי הטיית בעדינות את הצלחת ואת לאט כ רפה בעברית המדיום בקצה התחתון של הבאר. יש להקפיד לאסוף את כל המדיום תרבות מבלי לשבש את פעולת האוכלוסייה חיידקי חסיד ממוקם על משטח הפלסטיק. אם EPS מטריקס הופק במהלך זמן הדגירה, המטריצה ניתן לאבחן כמו התמיסה לבן. נא לא להפריע המטריקס EPS.</li>
	<li>יש לשטוף בעדינות הבארות פעם אחת עם 200 µL PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום.</li>
	<li>היפוך את הצלחת לייבש. הקדישו לפחות 20 דקות לייבוש. הערה: מאז biofilm יש לייבשם ביסודיות לפני צביעת, הפרוטוקול ניתן מושהה בשלב זה לכמה שעות או אפילו לילה. זמן ייבוש נוסף לא תשנה את ההליך מכתימים בזמן ייבוש לא שלם ישפיעו על כימות של תוצאות, הפארמצבטית.</li>
	<li>להוסיף 150 µL של 0.5% קריסטל ויולט. כל ניסיוני ושליטה טוב.</li>
	<li>תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לשטוף את בארות פעם אחת עם 400 µL של מים מזוקקים. אמצעי האחסון הוסיף מסייע להסיר את הכתם שיורית קריסטל ויולט צדי הבארות. להסיר בכביסה עם הקו ואקום.</li>
	<li>לשטוף את בארות חמש פעמים עם 200 µL של מים מזוקקים. להסיר בכביסה עם הקו ואקום. הערה: שטיפה חשוב כמת. כאשר הבארות ריק הם ברורים מים מזוקקים אינם מכילים כל כתם שיורי קריסטל ויולט, המשך לשלב הבא.</li>
	<li>היפוך את הצלחת לייבש, מוגן מפני אור. להבטיח ייבוש מוחלט של צלחת כאמור לעיל.</li>
	<li>Destain הבארות עם 200 µL של 95% אתנול. דגירה על הלוחית אהבת בשייקר למשך 30 דקות. כדי למנוע אידוי, במיוחד בטמפרטורות גבוהות יותר, לבצע שלב זה ב 4 º C.</li>
	<li>שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר540. הערה: אורך הגל עבור ספיגת המרבי של קריסטל ויולט נמצא ליד 590 ננומטר. בספרות מדווח על טווח שבין יתר540 - OD5954,13,14,15,16 עבור ספיגת קריסטל ויולט; כך לבחור אורך גל הזמינים בהתבסס על הקורא צלחת.</li>
</ol>4. EPS מטריצת זיהוי
הערה: מבחני חינם אלה לכמת והמחש EPS. בשני, EPS מזוהה באמצעות לקטין לאגד סוכרים. החלבון fluorescently מצומדת מאפשר כימות (שלב 4.1) או הפריט החזותי (שלב 4.2).
<ol><li>גילוי חצי כמותית של EPS<ol>
<li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + BS.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.</li>
		<li>לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (1:50 דילול).</li>
		<li>בצלחת 96-ובכן סטרילי, שחור, שהונעו, שטופלו תרביות רקמה, להוסיף µL 130/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג בינוני להיבדק. להוסיף µL 130/טוב של תרבות חוסנו הבארות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה דולר.</li>
		<li>תקופת דגירה של 4-24 h ב 37 ° C באופן סטטי.</li>
		<li>להעביר את המדיום תרבות צלחת ברור 96-ובכן עם פיפטה, באופן אידיאלי פיפטה רב-ערוצי. להיות זהירים כדי לאסוף את כל המדיום תרבות מבלי לשבש את פעולת האוכלוסייה חסיד ו/או EPS הממוקמת על משטח הפלסטיק. להפריש.</li>
		<li>לתקן את הצלחת שחור למשך 15 דקות ב RT באמצעות µL 200/טוב של הפורמלדהיד/גלוטראלדהיד ב- 1 x PBS.</li>
		<li>ואילו האוכלוסייה חסיד מתקן, להעריך את השבר supernatant מהשלב 4.1.6. שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר600. הגדר הבארות שליטה כמו 'blank'. לאשר שאמצעי שליטה ברור ללא עדות של עכירות. אם כל עכירות מזוהה, למחוק את הניסוי.<ol>
<li>לחלופין, ניתן לבצע וזמינותו כולו בצלחת התחתונה ברור שחור. בנסיבות אלה, ניתן לרשום את הערכים600 OD, המדיום תרבות יכול להימחק לאחר מכן לפני שתמשיך לשלב 4.1.7. הערכים600 OD יכול לשמש כדי לנרמל את הנתונים במקרה ישנם הבדלים משמעותיים בשיעור צמיחה בין זני חיידקים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הסר את התיקון והיפטרו ב פסולת מסוכנת.</li>
		<li>יש לשטוף בעדינות הבארות פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום על ידי הטיית בעדינות את הצלחת לאט כ רפה בעברית לשטוף את קצה התחתון של הבאר.</li>
		<li>להוסיף 150 µL/טוב של 25 µg/mL ConA-FITC ולאחר תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.</li>
		<li>בעדינות לשטוף פעמיים עם µL 200 ל- PBS.</li>
		<li>להוסיף 150 µL ל- PBS מכל קידוח. להקליט את זריחה-488 ננומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מיקרוסקופיה קונפוקלית ויזואליזציה של ייצור EPS, חישוב עובי biofilm<ol>
<li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + BS.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.</li>
		<li>לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (ב- 1:50 דילול).</li>
		<li>להגדיר את צלחת 24-ובכן סטרילי עם 12 מ מ סטרילי סביב coverslips זכוכית דקה. להוסיף µL 400/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג בינוני להיבדק.</li>
		<li>להוסיף 400 µL של תרבות חוסנו בארות כפילויות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה.</li>
		<li>תקופת דגירה של 4-24 h ב 37 ° C באופן סטטי.</li>
		<li>באופן חזותי אשר הצמיחה TSB תנאי, צמיחה, EPS התמיסה (לבן) ב- TSB + מצב BS, אין צמיחה ו/או לבן התמיסה בבארות שליטה סטרילי. להסיר את supernatants.</li>
		<li>לתקן למשך 15 דקות ב RT באמצעות µL 200/טוב של פורמלדהיד/גלוטראלדהיד פתרון ב- 1 x PBS.</li>
		<li>להסיר את התיקון, להיפטר של פסולת מסוכנת.</li>
		<li>יש לשטוף בעדינות הבארות פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום.</li>
		<li>להוסיף 150 µL/טוב של 25 µg/mL ConA-FITC ולאחר תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.</li>
		<li>בעדינות לשטוף פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS.</li>
		<li>הר antifade mountant פתרון עם דאפי. הערה: הפתרון הוא פתרון הר מוכנות מראש, המבוססים על גליצרול המכיל דאפי לשמירה על התווית פלורסנט בזמן בו זמנית מכתימה את ה-DNA בתאי חיידקים להמחשת כמו counterstain. בצע את הנחיות והמלצות של ערכת עבור הדגירה פעמים לפני הדמיה דגימות. ניתן לבצע את דאפי מכתים הליך לפני החלת הפתרון antifade mountant שאינו מכיל דאפי.</li>
		<li>להעריך על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. במיקרוסקופ קונפוקלי, הגדר את הלייזר 495 ננומטר/519 nm עירור/פליטה להמחשת FITC. הגדר לייזר השני 360 nm/460 nm עירור/פליטה להמחיש דאפי. אתר את biofilm על-ידי התמקדות בערוץ דאפי. להשתמש בערוצים דאפי והן FITC כדי לקבוע את עובי מלא ולהגדיר העליון והדמיה נמוך גבולות. שיא מלא עובי Z-מחסנית תמונות על-ידי לכידת תמונות כל מיקרומטר 0.25 לאחר הגדרת ההיקפים העליון והתחתון של הערימה-z. לקבלת מידע נוסף אודות מיקרוסקופיה קונפוקלית, נא להפנות פרסומים על-ידי פדוק. et al. 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>בנייה מחדש של תמונות תלת-ממד ב- ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) כדי להמחיש את מלא ביופילמים ולחשב את עובי biofilm. העובי הממוצע השיג עבור ס flexneri מלח מרה biofilms המושרה היה מיקרומטר 144.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. פיזור Assay
הערה: ב- assay הזה, פירוק של biofilm באמצעות פיזור חיידקים מזוהה. כאן, biofilms בוגרת נקבעו, לאחר מכן (בדרך כלל ביום למחרת), התקשורת, הוחלפו PBS או שיושלם PBS. הרכיב supernatant מוערך אז כדי quantitate את המספר של חיידקים יש לזהויות biofilm.
<ol><li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + BS.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.</li>
	<li>לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (ב- 1:50 דילול).</li>
	<li>בצלחת 96-ובכן סטרילי, נקי, שהונעו, שטופלו תרביות רקמה, להוסיף µL 130/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג מדיה להיבדק.</li>
	<li>להוסיף µL 130/טוב של תרבות חוסנו משלוש בארות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה דולר.</li>
	<li>דגירה באופן סטטי את הצלחת. בשביל 4-24 h ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לפני שתמשיך, לחמם את PBS, PBS + גלוקוז, PBS + מלחי מרה, ואת PBS + מלחי מרה + הגלוקוז ל- 37 מעלות צלזיוס. להכין את אלה ריאגנטים טריים מדי יום.</li>
	<li>שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר600. הגדר הבארות שליטה כמו 'blank'. לאשר שהמדיום ברור ללא עדות של עכירות. אם כל עכירות מזוהה, למחוק את הניסוי. הערכים600 OD יכול לשמש כדי לנרמל את הנתונים אם ישנם הבדלים משמעותיים בשיעור צמיחה בין זני חיידקים.</li>
	<li>הסר את המדיום תרבות באמצעות שורת ואקום. יש להקפיד לאסוף את כל המדיום תרבות מבלי לשבש את פעולת האוכלוסייה חסיד ממוקם על משטח הפלסטיק.</li>
	<li>יש לשטוף בעדינות הבארות פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום.</li>
	<li>החלף לשטוף את µL 130/טוב של הבאות לתוך שלוש בארות: PBS, PBS + גלוקוז, PBS + מלחי מרה, ו- PBS + מלחי מרה + גלוקוז. נוגדנים אלה חייב להיות מראש ומחוממת ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר בזהירות את הצלחת מן החממה 37 º C. להעביר את supernatants צלחת 96-ובכן טרי, סטרילי.</li>
	<li>בעזרת בלוק צלחת או דילול 96-ובכן, להכין 10-fold (1:10) דילולים טורי של תגובת שיקוע לתוך PBS סטרילי. הערה: הסדרה דילול צריך לנוע בין מדולל 10-6 בהתאם המתח חיידקי להיבדק. ניתן לבצע ניסויים פיילוט כדי לקבוע טווח דילול אופטימלית.</li>
	<li>צלחת 5 µL של כל דילול על גבי אגר LB באמצעות פיפטה רב-ערוצי נקודה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לספור מושבות על היום הבא, חשבון עבור הגורם דילול בקביעת המושבה שחזור ויוצרים יחידות (CFU). כדי לחשב את פיזור אחוז ביחס 1 x שליטה PBS (מוגדר ב- 100%), לחלק את התאוששות CFU כל תנאי הטיפול על ידי השחזור CFU 1 x PBS הבקרה מדגם. הערה: השגרה לוחות מדיה עבור חיידקים מזן עניין יכול גם לשמש. לדוגמה, יכול להיות מצופה שיגלה על צלחות קונגו אדום. ודא הצלחות יבש על טכניקות ספוט-ציפוי המתאים.</li>
</ol>

המחברים יש אין גילויים.

ניתוח של ביופילמים הוא מאתגר בשל אופיו הדינמי של biofilms ולהבדלים בין זנים, חומרים, מעבדות מבחני. . הנה, מספר אסטרטגיות מוצגים כדי לקבוע ביופילמים ב פתוגנים המעית בעקבות חשיפה מלחי מרה עם תובנה ניסיוני הניתנים לקידום הפארמצבטית. ישנם שיקולים נוספים כדי להבטיח הפארמצבטית. בראש ובראשונה, אנו ממליצים על ביצוע עצמאי לפחות שלושה ניסויים כל אחד עם triplicates טכני כדי לאשר תצפיות מובהקות סטטיסטית עקב וריאציית יכול להתרחש. שנית, השימוש של פקדים חיוביות ושליליות היא חיונית כדי להבטיח הפארמצבטית של וזמינותו. מומלץ מאוד להשתמש המ...

ביופילמים היא אסטרטגיית חשוב הישרדות חיידקי הנגרמת במהלך בתנאי סביבה קשים. חשיפה תרכובות אחרים כמו אנטיביוטיקה או שינויים מזין או זמינות חמצן גורם לחוץ בחיידק זה ניתן להקל באמצעות ביופילמים. ממבנה biofilm מאופיין על ידי חיידקי מצורף משטח או חיידקים אחרים, והוא מלווה את הפרשת מטריקס EPS מורכב בעיקר סוכרים1,2,3. ביופילמים הוא תהליך דינמי שבו מפל של אירועים במרקחת היווצרות בוגרת הקהילה חיידקי חסיד1,2,3. החיידקים מייצרים adhesins כדי להקל על קובץ מצורף מוקדם תוך הזזת adhesin ביטוי גנים פרופילים כדי לחזק את הקובץ המצורף במהלך ההבשלה biofilm. במקביל, ייצור EPS מתרחשת את המעיל הקהילה חיידקי במטריצה כדי להגן על התאים מפני הלחץ הראשוני. חיידקים בתוך את biofilm הם לאט גדל; ככזה, יטחנו את רוב אנטיביוטיקה לא יעילה. יתר על כן, הגידול איטי חוסך אנרגיה עד שינוי המצב לטובת התפתחות חיידקים1,2,3. אחרי התנאים הקשים חלפו, חיידקים לפזר את biofilm והמשך חיים פלנקטוניים1,2,3. באופן מסורתי, biofilms הם נצפו על משטחים, מייצגים אתגר קליני מתמשך בשל זיהום המאגרים המצויים על צנתרים ו בדיור התקנים1,2,3.
ביופילמים תוארה לאחרונה מספר גורמים מחוללי המעית; חיידקים להדביק את המעי הדק או הגס4. עבור מינים שיגלה , זיהום מתרחש במעי הגס האנושי לאחר מעבר דרך רוב מערכת העיכול. במהלך המעבר דרך המעי הדק, שיגלה הוא נחשף מרה; חומר משפילים השומנים ניקוי ומופרש אל המעי כדי להקל על עיכול שומנים בזמן בו זמנית להרוג חיידקים רוב5. פתוגנים המעית יכולת ייחודית להתנגד ההשפעות אחרים של מרה6. הניתוח האחרונה שלנו מנוצל vivo-כמו שילובים של גלוקוז ושל מלחי מרה להפגין ביופילמים חזקים ב ס flexneri , כמו גם מינים אחרים של שיגלה, פתוגניים Escherichia coli, ו סלמונלה4. בעבר, סלמונלה enterica serovar Typhi הוצגה כדי ליצור ממבנה biofilm הנוצרות על-ידי המרה עקב קולוניזציה ייחודי של כיס המרה במהלך זיהום כרוני7,8,9, 10. בנוסף, מחקר קודם עם ויבריו11, קמפילובקטר12 הפגינו ביופילמים בתגובה מרה. לכן, הבדיקות מורחב התצפיות היווצרות biofilm מרה-induced פתוגנים אחרים, מסייעות לקיים הפגנה של פתוגן המעית שנשמרת תגובה מרה. בניגוד כרונית biofilms שבו שעתוק גנים חיידקיים מוגבל, הזדקנות ביולוגית התא יכול להתרחש1,2,3, אנו מציעים כי biofilm מרה-induced המעית הוא יותר ארעי בטבע. זה ארעיים, biofilm מידבק ולחתימה על ידי פירוק מהיר (כפי שניתן לראות ב וזמינותו נפיצה), משופרת ביטוי גנים התקפה אלימה נצפתה ב biofilm האוכלוסייה4,6. 
כמו ביופילמים הוא תהליך דינמי הגיוון הרב והשימוש של מלחי מרה כמו גורם ייזום היה רק תיאר לאחרונה גורמים מחוללי המעית ביותר, הכלים ואת טכניקות המשמשות הם יישומים ייחודיים ויצירתיים של שיטות מסורתיות. כך, המובאים כאן הם שלוש אסטרטגיות ללא תשלום כדי לכמת את מספר מאפיינים חשובים של מלח מרה-induced ביופילמים, כולל חיידקי הדבקות, הפקה של המטריקס EPS, פיזור של חיידקים קיימא מ biofilm. טכניקות אלה כבר נעזרו בעיקר למחקר עם שיגלה; לכן, הערכה של פתוגנים המעית אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה. יחד עם זאת, נתונים חיוביים של כל שלושת מבחני תמיכה זיהוי של biofilms ולהקים לשחזור פרוטוקולים עבור מלח מרה-induced ביופילמים.

<table><tbody><tr><td>מרק סויה טריפטי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>22092-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>קריסטל סגול</td><td>סיגמא</td><td>C6158-50</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A FITC</td><td>Sigma</td><td>C7642-10 מ"ג</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>מלחי מרה</td><td>סיגמא</td><td>B8756-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>LB אגר</td><td>סיגמא</td><td>L7533-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית 14 מ"ל, 17 x 100 מ"מ, פלסטיק, סטרילי</td><td>פישר</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield אנטי-דהייה קשיח עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F1635-500</td><td></td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות עם תחתית שטוחה (שקופות)</td> <td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות עם תחתית שטוחה (שחור)</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות עם תחתית שטוחה (שקופות)</td> <td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית 12 מ"מ, עגול</td><td>פישר</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות 96 בארות</td><td>Spectramax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות פלואורסצנטיות</td><td>Biotek Synergy 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קונפוקלי או פלואורסצנטי מיקרוסקופ</td><td>ניקון A1 מיקרוסקופ</td><td></td><td></td>קונפוקלי</tr><tr><td>37&deg; חממת רועד C</td> ניו <td>ברונסוויק סיינטיפיק סיינטיפיק אקסלה E25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&deg; חממת צלחת C</td><td>Thermolyne Series 5000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

ביופילמים הוא תהליך דינמי, multistage, המתרחשת אצל חיידקים תחת תנאי סביבה קשים או בזמנים של מתח. עבור המעית פתוגנים, תגובה משמעותית מתח מושרה במהלך ההעברה במערכת העיכול ועל מרה חשיפה, מרכיב נורמלי של מערכת העיכול האנושית. כדי להתגבר על ההשפעות אחרים של מרה, פתוגנים המעית רבים יוצרים ממבנה biofilm המשוערות להתיר הישרדות כאשר הם מגיעים דרך המעי הדק. כאן אנו מציגים מתודולוגיות להגדרת ביופילמים דרך הדבקות מוצק-שלב מבחני וכן זיהוי מטריצה חוץ-תאית חומר פולימריים (EPS) ופריטים חזותיים. יתר על כן, הערכת פיזור biofilm מוצג כדי לחקות את הניתוח של אירועים מפעילה שחרור של חיידקים במהלך תהליך זיהום. קריסטל ויולט מכתים משמש כדי לזהות חיידקים חסיד assay הדבקות תפוקה גבוהה 96-ובכן צלחת. הערכת ייצור EPS נקבעת על-ידי שני מבחני, כלומר מיקרוסקופ מכתים של מטריקס EPS, ניתוח כמותי למחצה עם לקטין איגוד fluorescently מצומדת רב-סוכר. לבסוף, פיזור biofilm נמדדת דרך המושבה ספירות, ציפוי. נתונים חיוביים של מספר מבחני תמיכה אפיון biofilms and יכול להיות מנוצל כדי לזהות מלח מרה-induced ביופילמים בתוך זני חיידקים אחרים.

איור 1, ביופילמים הנגרמת ברוב של הגידול שנבדקו פתוגנים המעית שישה הבאים בתקשורת המכיל מלחי מרה. עלייה משמעותית בחיידקים חסיד לאחר חשיפה מלחי מרה הוא ציין זנים כמעט כל נבדק. החריג הוא enteroaggregative e. coli (EAEC); עם זאת, שים לב התבוננות Δaaf מוטציה4המושרה. התוצאות מצביעות על מנגנונים נוספים הדבקות הם המושרה על ידי חשיפה מלחי מרה ב EAEC בהיעדרו של הדבקות aggregative fimbriae אני (AAF / אני)<sup class="xre...

פרוטוקול זה מאפשר לקורא לנתח מלח מרה-induced ביופילמים בתוך פתוגנים המעית באמצעות גישה רב פנים כדי ללכוד באופי הדינמי של biofilms חיידקי על-ידי הערכת הדבקות, היווצרות מטריצה חוץ-תאית חומר הפולימרים, פיזור.

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול היווצרות והערכה של ביופילם זה היא לקבוע את היכולת של פתוגנים חיידקיים במעיים ליצור ביופילם, במיוחד בתנאים המדמים מעבר במערכת העיכול וחשיפה למלחי מרה. השיטות יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפתוגנזה החיידקית, כגון יכולתם של פתוגנים מעיים לשרוד את תנאי מלח המרה הקשים של מערכת העיכול. היתרון העיקרי של הטכניקות הוא שהתוצאות המשולבות משלושת הבדיקות תומכות באפיון מעמיק של היווצרות ביופילם בתגובה לחשיפה למלח מרה עבור כל פתוגן.לראשונה עלה לנו הרעיון לשיטות המשולבות, בהתחשב בצורך לכמת באופן מלא את היווצרות הביופילם המושרה על ידי מלח מרה ב-Shigella flexneri. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהיבטים של הבדיקה יכולים להגביל את יכולת השחזור. אז אנא שימו לב לשלבים הקריטיים, כדי להבטיח שחזור.ידגימו את ההליכים חברים מהמעבדה שלי, קורטני ניצ'רסון, פוסט-דוקטורנט, ואלחנדרו יאנוס, עמית מחקר קליני. ראשית, סמן שני צינורות של 1.5 מיליליטר כ-TSB ו-TSB פלוס BS. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של TSB או TSB בתוספת BS לצינורות המתאימים. לאחר מכן, חסנו את הצינורות ב-20 מיקרוליטר תרבית לילה בדילול של אחד עד 50.לאחר מכן הוסף 130 מיקרוליטר של אמצעי בקרה לא מחוסנים לכל אחת משלוש הבארות בצלחת סטרילית, שקופה, בעלת תחתית שטוחה, מטופלת בתרבית רקמות, 96 בארות. זה יהיה הפקד הריק. הוסף 130 מיקרוליטר של תרבית מחוסנת לכל אחת משלוש הבארות.לאחר הוספת הבקרה והתרבית המחוסנת בבארות המתאימות, דגרו את צלחת 96 הבארות למשך ארבע עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, באופן סטטי. לאחר סיום הדגירה, הגדר את הבקרה כריקה בקורא הצלחות. לאחר מכן, שאפו את מדיום התרבות מכל באר.לאחר מכן שטפו בעדינות את הבארות פעם אחת עם 200 מיקרוליטר PBS סטרילי. לאחר הכביסה יש לשאוף את ה- PBS ואז להפוך את הצלחת לייבוש למשך כ -20 דקות. חשוב מאוד להקפיד על הסרה עדינה של המדיה ושטיפה עדינה, כדי להבטיח שמטריצת ה-EPS לא תופרע.לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של 0.5% סגול קריסטל לכל אחת מבארות הניסוי והבקרה. לאחר מכן דגרו את הצלחת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות יש לשטוף את הבארות פעם אחת עם 400 מיקרוליטר מים מזוקקים.הוסף 200 מיקרוליטר מים מזוקקים כדי לשטוף את הבארות חמש פעמים. לאחר כל חמש השטיפות יש להפוך את הצלחת ולתת לה להתייבש לחלוטין, מוגנת מפני האור. על מנת להשיג תוצאות עקביות, חשוב שהדגימות ייבשו היטב לפני שתמשיך.לאחר ייבוש הצלחת לחלוטין, השתמש ב -200 מיקרוליטר של אתנול 95% כדי להכתים את הבארות. לאחר מכן השאירו את הצלחת על השייקר למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, על מנת למנוע אידוי. לאחר 30 דקות, רשום את ה-OD 540 בקורא הלוחות.לזיהוי כמותי למחצה של EPS, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר את מדיום התרבות לצלחת ברורה של 96 בארות. לאחר מכן השתמש ב -200 מיקרוליטר של מגיב קיבוע כדי לתקן את הצלחת השחורה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. כעת רשום את קריאת OD 600 על ידי הגדרת הפקד היטב כריק לסטנדרטיזציה.לאחר מכן רשום את קריאת המדיום התרבותי בזמן שהאוכלוסייה החסידה מתקנת. לאחר השלמת הקיבוע, הסר את המגיב והשליך פנימה את הפסולת המסוכנת. לאחר מכן השתמש ב -200 מיקרוליטר PBS סטרילי כדי לשטוף בעדינות את הבארות פעמיים.לאחר הכביסה יש לשאוף את ה- PBS. לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של 25 מיקרוגרם למיליליטר של ConA-FITC. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.לאחר הדגירה יש לשטוף בעדינות את הבארות עם 200 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן הוסיפו 150 מיקרוליטר PBS לכל באר, ורשמו את הקרינה ב-488 ננומטר. לאחר הכנת ריאגנטים טריים, יש לחמם את ה-PBS, PBS עם גלוקוז, PBS עם מלחי מרה, ו-PBS עם גלוקוז ומלחי מרה ל-27 מעלות צלזיוס.לאחר מכן רשום את ערכי OD 600 מלוח הביופילם הלילה בקורא הלוחות על ידי הגדרת הפקד כריק. לאחר מכן, שאפו את מדיום התרבות באמצעות קו ואקום, מבלי להפריע לאוכלוסייה הדביקה על משטח הפלסטיק. שוטפים בעדינות את הבארות פעמיים עם 200 מיקרוליטר PBS סטרילי.לאחר שטיפה עם PBS, הוסיפו 130 מיקרוליטר של PBS שחומם מראש, PBS עם גלוקוז, PBS עם מלחי מרה, ו-PBS עם מלחי מרה וגלוקוז לכל אחת משלוש הבארות, ואז דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, הוציאו את הצלחת מהחממה. פיפטה הסופרנטנט יוצא לצלחת סטרילית טרייה של 96 בארות.לבסוף, הכינו 1 עד 10 דילולים סדרתיים של הסופרנטנט עם PBS בצלחת 96 הבארות, או בבלוק דילול. לאחר מכן השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר חמישה מיקרוליטר מכל דילול על לוחות אגר LB. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.למחרת, ספרו את מספר המושבות. עלילת העמודות מתקבלת כדי לכמת את היווצרות הביופילם התלויה במלח מרה בפתוגנים אנטריים. זה נעשה על ידי התוויית ערכי OD 540 של הזנים הבודדים בנוכחות ובהיעדר מלחי מרה במדיום.התרשים מראה עלייה משמעותית בהיווצרות הביופילם עבור רוב זני הפתוגן, למעט Enteroaggrative E.Coli. לאחר מכן, ה-EPS המיוצר במהלך היווצרות הביופילם מזוהה על ידי קביעת כמות ה-ConA-FITC שנשמרה על ידי ה-EPS. תרשים הבר מראה קריאת פלואורסצנטיות מוגברת משמעותית בנוכחות מלחי מרה.זה מאשר ייצור EPS לפתוגן Shigella flexneri. כאן, צביעה תלויה ב-ConA-FITC של מטריצת ה-EPS גבוהה משמעותית כאשר היא נחשפת למלחי המרה. זה מצביע על היווצרות ביופילם חיידקי, המאופיין במטריצת EPS עשירה בפוליסכרידים.One X PBS ו-DAPI משמשים כדי להראות ספציפיות תלויה ב-FITC ונוכחות של ה-DNA החיידקי, בהתאמה. לבסוף, מספר היחידות היוצרות מושבה נספר כדי לנתח את הפיזור התלוי במלח המרה של חיידקים מהביופילם. התרשים מראה שהחיידקים מתפזרים בקלות מהביופילמים ב-PBS ו-PBS עם גלוקוז.עם זאת, חשיפת החיידקים למלחי מרה מעכבת באופן דרסטי את פיזורם מהביופילמים. בדיקות אלו פותחו כדי ללכוד ולכמת את הביופילמים האלימים החולפים שנוצרו על ידי פתוגנים אנטריים, במיוחד Shigella flexneri, בתגובה לחשיפה למלח מרה במעי הדק לפני זיהום במעי הגס. ייתכן שיהיה צורך להתאים שינויים בבדיקות, כגון סוגי אמצעי הבסיס, הרכב מלחי המרה המשמשים ותנאי גידול חיידקים, עבור פתוגנים שונים, בהתאם לאתר הזיהום במערכת העיכול.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע כל אחת מהבדיקות כדי להעריך ביסודיות את היווצרות הביופילם בזן החיידקים או המוטנטיים המעניין שלך. זכור שעבודה עם הפתוגנים וחלק מהפתרונות יכולה להיות מסוכנת ביותר. תמיד יש לקחת בחשבון אמצעי זהירות כגון שיטות טיפול וסילוק מתאימות בעת ביצוע בדיקות אלו.יתר על כן, הכנת מצע מלח מרה טרי, בקרות נאותות והבטחת שחזור ניסיוני חיוניים לניתוח הנתונים ולאישור פנוטיפ הביופילם המושרה על ידי מלח מרה. הטכניקות, שהן יישומים ייחודיים ויצירתיים בתפוקה גבוהה של שיטות מסורתיות, יאפשרו כימות מתאים של התהליך הרב-גוני והדינמי של היווצרות ביופילם המושרה על ידי מלח מרה בפתוגנים אנטריים.

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Assay מתאר אמצעי מהיר למדוד היווצרות biofilm מוקדם חיידקים ופטריות. שיטה זו משתמשת צלחת microtiter כמו לתשתית להיווצרות חיידקים biofilm ו biofilm היא דמיינו באמצעות סגול זן קריסטל. Assay מספק גם assay איכותי או כמותי ליצירת biofilm מוקדם.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

Biofilms חיידקים הם בדרך כלל מהווים ידי subpopulations שונים של תאים מיוחדים. מתא בודד ניתוח subpopulations אלה מחייב שימוש כתבים ניאון. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לחזות ולפקח subpopulationswithin...

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

מקור: טיי, ס. ב. ואחרים. הפרעה אנטי-וירולנטית של ביופילמים פתוגניים באמצעות לקטונאזות מהונדסות לכיבוי קוורום.  J. Vis. Exp. (2016)הסרטון מדגים שיטה לכימות ביומסה ביופילמית בחיידק פתוגני, תוך השוואת מערכות ביקורת לא מטופלות לדגימות שטופלו באנזים שמדביר קווארום. האנזים משבש את איתות החיידקים במהלך הדגירה המוקדמת, ומפחית את ההיצמדות של התא. לאחר שטיפה והמשך דגירות, בארות הבקרה יוצרות ביופילמים צפופים, בעוד שבארות מטופלות מראות היווצרות מופחתת. צבע קטיוני משמש לצביעת הביופילם, ונמדד ספיגה להערכת...

כימות דיכוי ביופילם המושר על ידי אנזימים בחיידקים פתוגניים

הסרטון מדגים בדיקת היצמדות בשלב מוצק להערכת היווצרות ביופילם. בצלחת מרובת בארות, חיידקים במדיה בתוספת מלח מרה נצמדים למשטחים מוצקים, ויוצרים ביופילמים, אשר אושרו על ידי קולורימטריה באמצעות צביעה סגולה קריסטלית וטיפול באתנול.

בדיקת היצמדות לשלב מוצק להערכת היווצרות ביופילם

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת פלואורסצנטיות לכימות היווצרות ביופילם המושרה על ידי מלח מרה. עם הוספת מלחי מרה בתרבית של חיידק אנטרי פתוגני, ייצור ביופילם מזוהה באמצעות לקטין פלואורסצנטי הנקשר לרב-סוכרים במטריצת החומר הפולימרי החוץ תאי (EPS) של הביופילם.

בדיקה לחקר היווצרות ביופילם המושרה על ידי מלח מרה באמצעות זיהוי מטריצת EPS

הסרטון מציג בדיקת פיזור ביופילם באמצעות צלחת מרובת בארות. חיץ וטיפול בגלוקוז מפרקים את הביופילם, משחררים חיידקים, בעוד מלחי מרה גורמים ללחץ, ושומרים על חיידקים בחומר הפולימרי החוץ תאי המגן. פיזור גבוה יותר עם חיץ וגלוקוז מאשר פירוק מוצלח של ביופילם, המוערך על ידי מדידת יחידות יוצרות מושבה.

איתור פירוק ביופילם באמצעות בדיקת פיזור

מחקר זה מציג את הפיתוח של מתודולוגיות הניתנות לשחזור לחקר מעכבי ביופילם והשפעותיהם על Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לגדול ואיכותי לנתח biofilms חיידקים על עובש פטרייתי על ידי מיקרוסקופ confocal אלקטרונים.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר גישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות להערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים בתעשיית החלב. גישה זו עשויה לשמש גם לבדיקת יעילותן של פורמולציות ביולוגיות או כימיות חדשות לשליטה בביופילמים.

הערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים חלביים בגישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות

פרוטוקול זה מתאר את הכנת החיסון, כימות הביופילם על לוחות מיקרוטיטר באמצעות צבע סגול גבישי, הספירה בת קיימא בביופילמים והדמיה של ביופילמים של אסינטובקטר.

אסטרטגיות כימות, הערכת כדאיות והדמיה עבור ביופילמים של Acinetobacter

חקור את יכולתם של פתוגנים מעיים ליצור ביופילמים בתנאי מלח מרה קשים. הפרוטוקול משלב שלוש שיטות לכימות הידבקות, מטריצת חומר פולימרי חוץ-תאי ופיזור ביופילם.

מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות

גלה סרטונים נוספים