פרוטוקול MPLEx עבור ניתוחים מולטי-omic של דגימות אדמה

שיטה זו משמשת בתחומי הפרוטאומיקה, המטבולומיקה והליפידומיקה על ידי סיוע בהשגת מידע מקיף על השינויים המולקולריים המתרחשים בקהילות מיקרוביאליות הקשורות לקרקע עקב הפרעות סביבתיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהשגת אנליטים מרובים מדגימת קרקע אחת מגדילה את הדיוק והדיוק תוך הפחתת זמן הכנת הדגימה והמאמץ. כדי להתחיל, עבור כל דגימת אדמה של 20 גרם, שקלו 10 גרם לשני צינורות נפרדים של 50 מיליליטר תואמי מתנול/כלורופורם.

השתמש בצינורות פלסטיק העשויים מ-PTFE, שכן כלורופורם ידלוף את רוב הפלסטיק ויזהם את הדגימות. הוסף כ -10 מיליליטר נירוסטה וחרוזי נופך שטופים בכלורופורם לכל צינור. לאחר מכן, תוך כדי קרח, הוסיפו ארבעה מיליליטר מים קרים טהורים לכל צינור, והעבירו את הדגימות בדלי קרח לתוך מכסה אדים.

בעזרת פיפטה סרולוגית מזכוכית של 25 מיליליטר, הוסף במהירות 20 מיליליטר של כלורופורם קר כקרח שניים לאחד לנפח/נפח מתנול לצינורות. הדק את המכסים ומערבל את תערובת האדמה לתמיסה. הכלורופורם-מתנול מסייע בפירוק דופן התא של פרוקריוטים וגם משבית פעילויות אנזימטיות.

לאחר מכן, חבר את הצינורות לחיבורי מערבולת צינור של 50 מיליליטר, ומערבולת אופקית למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס בתוך מקרר במידת האפשר. לאחר מכן, הניחו את הדגימות בתוך מקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס למשך כ-15 דקות על מנת לקרר אותן לחלוטין. לאחר מכן, באמצעות סוניקטור בדיקה בתוך מכסה אדים, סוניקציה של כל דגימה עם בדיקה של שישה מילימטרים, 1/4 אינץ' במשרעת של 60% למשך 30 שניות על קרח.

לאחר סוניקציה, הניחו את הדגימות במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס, מכיוון שסוניקציה יכולה לייצר חום רב. לאחר חזרה על שלבי המערבולת האופקית, הסוניקציה וההקפאה, צנטריפוגה את הדגימות בכוח הכבידה פי 4,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בשלב זה, הדגימה תופרד לשכבת המטבוליט העליונה, שכבת הביניים של החלבון ושכבת השומנים התחתונה.

הניחו את הדגימות על קרח. לאחר מכן, בתוך קולט אדים, השתמש בפיפטה סרולוגית מזכוכית של 10 מיליליטר כדי להעביר את שכבות המטבוליט העליונות משני הצינורות של 50 מיליליטר לבקבוקון זכוכית אחד גדול. כעת, הטה מעט את הצינור של 50 מיליליטר כדי לשחרר את שכבת החלבון כך שהיא צפה בחופשיות על שכבת השומנים התחתונה.

לאחר מכן, בעזרת מרית מעבדה נקייה מנירוסטה, גרפו בזהירות את שתי שכבות החלבון, והניחו אותן יחד לצינור אחד חדש של 50 מיליליטר. בעזרת פיפטה סרולוגית מזכוכית של 25 מיליליטר, העבירו את שכבות השומנים התחתונות לבקבוקון זכוכית אחד גדול. הוסף 20 מיליליטר מתנול קר כקרח לשני הצינורות עם הפסולת ולצינור האחד עם שכבת החלבון.

מערבל לזמן קצר את הצינורות, וצנטריפוגה את כדורי הפסולת ושכבת החלבון בכוח הכבידה פי 4,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, שפכו את המתנול למיכל פסולת מסוכנת בתוך קולט אדים. הקפיאו את כדורי החלבון והפסולת בחנקן נוזלי, וייבשו אותם בליופילייזר למשך כשעתיים.

הוסף 20 מיליליטר של מאגר מסיסות חלבון במאגר טריס של 50 מילי-מולרי, pH 8.0, לכל אחד מכדורי הפסולת ו-10 מיליליטר לצינור הבין-שכבתי של החלבון. במכסה המנוע, בדוק סוניקציה של הדגימות במשרעת של 20% למשך 30 שניות כדי להביא אותן לתמיסה. מערבולת את הדגימות למשך שתי דקות.

לאחר מכן, הנח את דגימת שכבת החלבון לתוך מסובב צינור מעבדה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להמיס את החלבון. מערבולת אופקית את דגימות הפסולת למשך 10 דקות נוספות כדי לליז את כל התאים השלמים שנותרו. לאחר מכן, סובב עם דגימות שכבת החלבון למשך 20 הדקות הנותרות.

צנטריפוגה של כל הדגימות בכוח הכבידה פי 4,500 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ואוספת את הסופרנטנט מכל צינור לדגימה לשני צינורות של 50 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר של מאגר מסיסות לגלולה הבין-שכבתית של החלבון. לאחר מכן, סוניקט ומערבול את הגלולה בחזרה לתמיסה.

לאחר הצנטריפוגה, שלבו באופן שווה את הסופרנטנטים לתוך שני הצינורות של 50 מיליליטר עם כדורי הפסולת, וצנטריפוגה את הצינורות ברוטור דלי בזווית קבועה בכוח הכבידה פי 8,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על מנת לזרוק את כל הפסולת שנותרה. חלקו את הסופרנטנטים לשני צינורות של 50 מיליליטר. לאחר מכן, בעזרת פיפטה סרולוגית מזכוכית של 10 מיליליטר, הוסף 7.5 מיליליטר TCA לכל צינור.

מערבול את הדגימות לתמיסה. לאחר מכן, הכניסו את הדגימות למקפיא שלילי של 20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד לילה. כדי לזרוק את החלבון המשקע, צנטריפוגה את הדגימה בכוח הכבידה פי 4,500 וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ושפכו את הסופרנטנט לפסולת.

הוסף 10 מיליליטר של 100% אצטון קר כקרח לכל כדור חלבון. מערבל את הצינורות, ומשלב כמו כדורים לצינור אחד. צנטריפוגה ואז לשפוך את האצטון.

בעזרת נפח אצטון קטן יותר, שטפו את הגלולה פעמיים, והעבירו את המתלה לצינור של 1.5 או שני מיליליטר לסיבוב הסופי. שפכו את הסופרנטנט לפסולת, והניחו לגלולה להתייבש הפוך על מגבון נייר במכסה אדים למשך כ-20 דקות. בהתאם לגודל הגלולה, הוסף 100 עד 200 מיקרוליטר ממאגר המסת החלבון.

סוניקט ומערבל את הגלולה לתמיסה. שימו לב שהדגימה עשויה להיות צמיגה עקב חומרים הומיים המשקעים יחד עם החלבון, אשר יוסרו עם צנטריפוגה לאחר מכן. לבסוף, יש לנער את הדגימה באינקובטור או בשייקר ב-300 סל"ד ו-40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כדי להמיס את החלבון לתמיסה לפני שתמשיך לעיכול חלבון או הקפאה מהירה לעיבוד עתידי.

באמצעות פרוטוקול MPLEx שהודגם בסרטון זה, 3,376 פפטידים, 105 ליפידים ו-102 מטבוליטים קוטביים הופקו מאדמת הערבה המקומית של קנזס, ומיצוי החלבונים של הפרוטוקול מושווה לערכות מיצוי חלבונים ומיצוי SDS באמצעות LC-MS/MS בשלב הפוך. כאשר משווים בתחילה שלושה שכפולים של ערכת מיצוי החלבון המסחרית ושיטות SDS, רק 12% מהפפטידים חופפים בין שתי הטכניקות, מה שמראה את המורכבות של הקהילה המיקרוביאלית והשפעות מיצוי שונות. בהשוואה של MPLEx עם ערכת מיצוי חלבון מסחרית ותמציות SDS, כ-38% מהפפטידים שנצפו בשיטת MPLEx זוהו גם בעת שימוש במיצוי SDS ו/או ערכה מסחרית.

בהתחשב במספר המינים בקהילת חיידקי הקרקע של קנזס והמטאגנום שלה, החפיפה של זיהויי פפטידים היא סבירה. כפי שמוצג כאן, הישימות הרחבה של גישת MPLEx הוערכה בעבר באמצעות הארכיאון S.acidocaldarius, קונסורציום חד-ציאנובקטריאלי, רקמת קליפת המוח של העכבר, שתן אנושי ועלים מ-A.thaliana. בכל המקרים, מספר החלבונים שנצפו בשיטת MPLEx היה דומה לזה של הביקורת, מה שמצביע על התועלת שלה עבור סוגי דגימות רבים ושונים.

אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשיג חלבונים, מטבוליטים ושומנים מדגימת אדמה אחת. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להיות גמיש, מכיוון שכל סוגי הקרקע שונים. לדוגמה, גודל שכבת החלבון ישתנה, בהתאם לביומסה של הקרקע ולחומרים הומיים הקיימים באדמה.

אל תשכח שעבודה עם כלורופורם עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה במכסה אדים בעת ניסיון הליך זה.