Name: פרוטוקול MPLEx עבור ניתוחים מולטי-omic של דגימות אדמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: למדו את פרוטוקול MPLEx לחילוץ מקביל של מטבוליטים, חלבונים וליפידים מדגימות אדמה בודדות. שיטה זו מייעלת הכנת דגימות ומשפרת דיוק בניתוחי מסה ספקטרומטריה מולטי-אומיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות נתן ג'ונסון על סיועו בהכנת הדמויות. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית פאן-טכנולוגיות אשר ממומן על ידי של משרד האנרגיה האמריקני של Office הביולוגיים ומחקר סביבתי (תכנית גנומית של המדע), Microbiomes המעבר (מנטה) מעבדה מכוונות פיתוח מחקר היזמה המעבדה הלאומית הפסיפי, כמו גם את נבחרת מוסדות של הבריאות הלאומי מכון בריאות למדעי הסביבה (R01 ES022190) ו- NIH (P42 ES027704). KEBJ הייתי רוצה להודות R21 HD084788 עבור תמיכה כספית לפתח ולאמת טכניקות החילוץ רומן רב-omic. עבודה זו בוצעה ב W. R. ויילי סביבתיים מולקולרית מדעי מעבדה (EMSL), מתקן משתמש המדעי לאומי DOE-הפסיפי הלאומי מעבדה (PNNL). PNNL הוא מעבדה לאומית רב התוכנית המופעלת ע י Battelle על האלמונית תחת חוזה דה-AC06-76RL01830.

<ol><li>Hultman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+of+permafrost%2C+active+layer+and+thermokarst+bog+soil+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes.</a> Nature. 521, 208-212 (2015).</li>
<li>White, R. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moleculo+long-read+sequencing+facilitates+assembly+and+genomic+binning+from+complex+soil+metagenomes%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes.</a> mSystems. 1, (2016).</li>
<li>White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nprot.2016.148">The past, present and future of microbiome analyses.</a> Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).</li>
<li>Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+integrating+data+to+uncover+genotype-phenotype+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions.</a> Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).</li>
<li>Jansson, J. K., Baker, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-omic+future+for+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A multi-omic future for microbiome studies.</a> Nat Microbiol. 1, (2016).</li>
<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Options+and+considerations+when+selecting+a+quantitative+proteomics+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy.</a> Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).</li>
<li>Marx, V. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmeth.2285">Targeted proteomics.</a> Nat Methods. 10, 19-22 (2013).</li>
<li>Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 30, Unit 30 32 31-24 (2012).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).</li>
<li>Nakayasu, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPLEx%3A+a+Robust+and+Universal+Protocol+for+Single-Sample+Integrative+Proteomic%2C+Metabolomic%2C+and+Lipidomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses.</a> mSystems. 1, (2016).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Pomraning, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+analysis+reveals+regulators+of+the+response+to+nitrogen+limitation+in+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica.</a> BMC Genomics. 17, 138(2016).</li>
<li>Tisoncik-Go, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Omics+Analysis+of+Pathogenic+Host+Responses+during+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+Infection%3A+The+Crucial+Role+of+Lipid+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism.</a> Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).</li>
<li>Kyle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+biologically+significant+lipid+isomers+with+liquid+chromatography%2C+ion+mobility+spectrometry+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry.</a> Analyst. 141, 1649-1659 (2016).</li>
<li>Lovelace, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silymarin+Suppresses+Cellular+inflammation+by+inducing+reparative+stress+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nat+Prod%22%5BJournal%5D)">Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling.</a> J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diel+metabolomics+analysis+of+a+hot+spring+chlorophototrophic+microbial+mat+leads+to+new+hypotheses+of+community+member+metabolisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms.</a> Front Microbiol. 6, 209(2015).</li>
<li>Pomraning, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Metabolomic%2C+Lipidomic+and+microscopic+profiling+of+Yarrowia+lipolytica+during+lipid+accumulation+identifies+targets+for+increased+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis.</a> PLoS One. 10, e0123188(2015).</li>
<li>Huang, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fungus+gardens+of+leaf-cutter+ants+undergo+a+distinct+physiological+transition+during+biomass+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).</li>
<li>Deatherage Kaiser, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multi-Omic+View+of+Host-Pathogen-Commensal+Interplay+in+Salmonella-Mediated+Intestinal+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection.</a> PLoS One. 8, e67155(2013).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+modulates+metabolism+during+growth+under+conditions+that+induce+expression+of+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes.</a> Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).</li>
<li>Ansong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-omic+systems+approach+to+elucidating+Yersinia+virulence+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms.</a> Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).</li>
<li>Bordbar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-driven+multi-omic+data+analysis+elucidates+metabolic+immunomodulators+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation.</a> Mol Syst Biol. 8, 558(2012).</li>
<li>Hu, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+response+of+human+skin+tissue+to+low+dose+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation.</a> Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).</li>
<li>Perera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+virus+infection+perturbs+lipid+homeostasis+in+infected+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells.</a> PLoS Pathog. 8, e1002584(2012).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversed-phase+capillary+ultra-performance+liquid+chromatography-mass+spectrometry+%28UPLC-MS%29+method+for+comprehensive+top-down%2Fbottom-up+lipid+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling.</a> Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).</li>
<li>Sorensen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbations+in+the+lipid+profile+of+individuals+with+newly+diagnosed+type+1+diabetes+mellitus%3A+Lipidomics+analysis+of+a+Diabetes+Antibody+Standardization+Program+sample+subset%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset.</a> Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).</li>
<li>Diamond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+proteome+and+lipidome+profiles+reveal+hepatitis+C+virus-associated+reprogramming+of+hepatocellular+metabolism+and+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000719(2010).</li>
<li>Alquier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+GPR40+impairs+glucose-induced+insulin+secretion+in+vivo+in+mice+without+affecting+intracellular+fuel+metabolism+in+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets.</a> Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+accurate+mass+and+time+tag+approach+in+studies+of+the+human+blood+lipidome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).</li>
<li>Rasmussen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+virology+identifies+a+mitochondrial+fatty+acid+oxidation+enzyme%2C+dodecenoyl+coenzyme+A+delta+isomerase%2C+required+for+hepatitis+C+virus+replication+and+likely+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis.</a> J Virol. 85, 11646-11654 (2011).</li>
<li>Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+and+digestion+for+proteomic+analyses+using+spin+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters.</a> Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat Methods. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Zhou, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+sodium+dodecyl+sulfate-assisted+sample+preparation+method+for+LC-MS-based+proteomics+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications.</a> Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+abundance+of+type+III+secretion+system-inducing+signals+in+Arabidopsis+mkp1+enhances+resistance+against+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).</li>
<li>Chourey, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cellular+lysis%2Fprotein+extraction+protocol+for+soil+metaproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics.</a> J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).</li>
<li>Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+probabilities+and+generating+functions+of+tandem+mass+spectra%3A+a+strike+against+decoy+databases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases.</a> J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).</li>
<li>Kim, S., Pevzner, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS-GF%2B+makes+progress+towards+a+universal+database+search+tool+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics.</a> Nat Commun. 5, 5277(2014).</li>
<li>Cole, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototrophic+biofilm+assembly+in+microbial-mat-derived+unicyanobacterial+consortia%3A+Model+systems+for+the+study+of+autotroph-heterotroph+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions.</a> Front Microbiol. 5, (2014).</li>
<li>Isaacson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+extraction+techniques+for+enhanced+proteomic+analysis+of+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues.</a> Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

חשוב לציין כי לא כל המעבדות יהיו זמינות ציוד אז שיטות מסוימות, לדוגמה השלב פירוק, ניתן להתאים. כאן אנו משתמשים vortexing sonicating, אולם השימוש מכה חרוז גדול 50 מ ל יעבוד. אם איזה שהוא לופילייזר עם טמפרטורת אספן מסוגל-105 מעלות צלזיוס אינה זמינה, יכולים להיות מיובש דגימות תחת זרם חנקן. גם סוגי אדמה להשתנות במידה רבה, באפשרותך לכלול חול סחופת, קליי, כבול, חמרה (וכדומה), הם גם יכול להשתנות בהתאם pH, מליחות, העושר חומר אורגני. כל אחד סטיות אלה יכולים להשפיע על הפרוטוקול, ולכן חשוב להיות גמיש וכדי לבצע התאמות בעת ה...

הערכת קהילות מיקרוביאלית בקרקע יש השלכות חשובות להבנת שינוי האקלים ורכיבה פחמן. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו אולם קשיים, כגון חוסר הגנום ברצף עבור microbiota בסוגים שונים של אדמה והפונקציה לא ידוע של החלבונים זוהה רבים. כתוצאה אתגרים בשל קרקע להיות הקהילה מיקרוביאלי המורכבים ביותר הידוע עד כה1,2,3. ניתוח רב-omic, המשלבים נובע metagenomic ', ' metatranscriptomic ', ' metaproteomic ', metabolomic, lipidomic מחקרים, יושמו לאחרונה במחקרים קרקע רבים כדי להשיג הבנה טובה יותר לתוך החיידקים ההווה, תוך קבלת מידע מקיף אודות השינויים המולקולריים המתרחשים בשל הסביבה לפליטת1,4,5. אתגר אחד עם מחקרים מולטי-omic זה ספקטרומטר מסה (MS)-לפי מידות metaproteomic, metabolomic ו- lipidomic מצריכים בדרך כלל תהליך החילוץ ספציפיים עבור כל omic להיות MS התואם6,7 , 8 , 9. אלה נהלים מדויקים להפוך ביישום שלהם מאוד קשה או בלתי אפשרי כאשר רק כמות מוגבלת של המדגם הינו זמין. האתגרים הללו עוררו אותנו לחקור בו זמנית מטבוליט, חלבונים, שומנים בדם החילוץ (MPLEx) שיטה מסוגלת באמצעות אמצעי אחסון מדגם קטן או גושים, שיפור דיוק, מתן דגימת מהר יותר, ההכנות כל שלושה ניתוחים 10. נכון להיום, ישנם הליכים החילוץ אין קרקע חלופית להשגת כל המטרות הללו.
כדי לאפשר ריבוי העולמית-omic ניתוחים של דגימת אדמה יחיד, פרוטוקול החילוץ בממיסים אורגניים המבוססים על כלורופורם, מתנול, הפרדות צבע המים היה שימוש10. שיטה זו פותחה במקור עבור סך השומנים עקירות9,11 , ולאחרונה תוקן על החילוץ סימולטני של מטבוליטים, חלבונים, שומנים מדגם יחיד12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, שמאפשר הכמות המדגם פחות, השתנות ניסיוני10. פרוטוקול MPLEx, כלורופורם אינה miscible עם מים, אשר מספק את הבסיס עבור triphasic כימי ההפרדה של מדגם המרכיבים לתוך שברים נפרדים. פזה מימית בראש מכיל ולכן מטבוליטים הידרופיליות, ואחריו דיסק חלבון, ואז שכבה השומנים בשלב כלורופורם התחתון (איור 1). MPLEx מוחל על רוב קרקעות, חלקיקי הלכלוך מצטבר בתחתית מאוד של הצינורות דגימה, יכול להיות מושלך לאחר שנאספו כל השכבות. כל סוג הקרקע עשויות להיות שונות, עם זאת, ובשנת אדמה מאוד אורגני כגון כבול, שפכי אדמה נשאר השכבה האמצעית לא נופל לתחתית הצינור הדגימה. MPLEx מספקת מספר יתרונות כאשר בידוד המולקולה מספר סוגי מדגם זהה כגון כמויות מדגם קטן 1) יכול לשמש עבור ניתוחים רב-omic, 2) מולטי-omic ושילוב הירידה מדגם זהה השתנות ניסיוני הכולל, ואת 3) ניתן להכין במספרים גדולים של דגימות מהר יותר תפוקה גבוהה יותר מחקרים10. יחד יתרונות אלה הם חיוני למתן יותר יכולות מדידה להערכת דגימות. אדמה וקהילות מיקרוביאלי מורכבים שלהם.

<table><tbody><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' 650498</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של -20&deg; C ! אזהרה: לכלורופורם יש השפעות בריאותיות פוטנציאליות חריפות , גירוי בעור וכוויות כימיות אפשריות, גירוי במערכת הנשימה, עלול להשפיע על הכליות, הכבד והלב. הרכיבו משקפי מגן מתאימים, בגדים וכפפות, עבדו במכסה אדים.</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34860</td><td>מאוחסן ב-20&deg; C ! אזהרה: מתנול עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה, בעור ובעיניים, עלול לפגוע בעצבים, בכליות ובכבד. הרכיבו משקפי מגן מתאימים, בגדים וכפפות, עבדו במכסה אדים.</td></tr><tr><td>מים מטוהרים ממערכת</td><td>טיהור המים</td> Millipore <td>Milli-Q</td><td></td>.</tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6026</td><td>! זהירות: SDS גורם לרעילות חריפה והוא דליק. זה מגרה את העור, העיניים ודרכי הנשימה. הרכיבו כפפות ומשקפי בטיחות.</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי חלבון קרקע</td><td>MoBio, ערכת מיצוי חלבון קרקע NoviPure, Qiagen</td><td>30000-20</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>1M Trizma HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2694</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריכלורואצטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td>! אזהרה: TCA הוא קאוסטי, רעיל ועלול לגרום לכוויות בעור. הרכיבו כפפות ומשקפי בטיחות.</td></tr><tr><td>אצטון</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td></td>' <td>650501 מאוחסן בטמפרטורה של -20&deg; C ! אזהרה: אצטון עלול לגרום לגירוי בדרכי הנשימה ובעור ובעיניים. נוזל דליק ואדים. הרכיבו משקפי בטיחות, כפפות וחלוק מעבדה, עבדו במכסה אדים.</td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>208884</td><td>! זהירות אוריאה מגרה את העיניים והעור, השתמש בכפפות ומשקפי בטיחות</td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V528A</td><td>20&micro; g בקבוקונים</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון חומצה ביסינצ'ונינית</td><td>פירס</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פורמט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>09735</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34998</td><td>! אזהרה: אצטוניטריל הוא גורם לגירוי בעור ובעיניים. דליק מאוד. הרכיבו כפפות ומשקפי בטיחות. עבוד במכסה אדים.</td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T6508</td><td>! זהירות TFA מסוכן ביותר במקרה של מגע בעור, קשר עין, בליעה ושאיפה. עלול לגרום לנזק לרקמות במיוחד בריריות העיניים, הפה ודרכי הנשימה. מגע עם העור עלול לגרום לכוויות. ללבוש כפפות, מעיל מעבדה, משקפי בטיחות ולעבוד במכסה אדים.</td></tr><tr><td>מתוקסיאמין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>226904</td><td>! אזהרה: מתוקסיאמין הידרוכלוריד גורם לכוויות קשות ולנזק חמור לעיניים, עלול לגרום לרגישות במגע עם העור. הרכיבו משקפי בטיחות, כפפות וחלוק מעבדה, עבדו במכסה אדים.</td></tr><tr><td>פירידין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>270970</td><td>! אזהרה: פירידין עלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים, לדיכוי של מערכת העצבים המרכזית. אדים עלולים לגרום לשריפת הבזק. הרכיבו משקפי בטיחות, כפפות וחלוק מעבדה, עבדו במכסה אדים.</td></tr><tr><td>N-מתיל-N-(טרימתילסיליל)טריפלואורואצטמיד עם 1% טרימתילכלורוסילן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>69478</td><td>! זהירות MSTFA + 1% TMCS עלול לגרום לקורוזיה בעור, נזק חמור לעיניים ורעילות ספציפית של איברי מטרה. נוזל דליק ואדים. הרכיבו משקפי בטיחות, כפפות וחלוק מעבדה, עבדו במכסה אדים.</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q מערכת טיהור מים</td><td>Millipore</td><td></td><td>דגם MPGP04001</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex Genie 2</td></tr><tr><td>סוניקטור בדיקה</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>דגם FB505</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>דגם 5810R</td></tr><tr><td>צינור 50 מ"ל רוטור דלי מתנדנד</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל רוטור זווית קבועה</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-6-30</td><td></td></tr><tr><td>איזון</td><td>OHAUS</td><td></td><td>דגם V22PWE150IT</td></tr><tr><td>בקר פיפטה סרולוגי</td><td>Eppendorf</td><td>12-654-100</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל, 25 מ"ל פיפטות סרולוגיות מזכוכית</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-27F, 13-678-36D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer עם Thermotop</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015, 5308000003</td><td></td></tr><tr><td>0.9 &ndash; 2.0 מ"מ תערובת חרוזי נירוסטה</td><td>NextAdvance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>0.15 מ"מ חרוזי נופך</td><td>MoBio</td><td>13122-500</td><td></td></tr><tr><td>צלחת ערבוב מגנטית</td><td>FisherBrand</td><td>11-100-16SH</td><td></td></tr><tr><td>מוט ערבוב מגנטי</td><td>FisherBrand</td><td>14512130</td><td></td></tr><tr><td>רצועות נייר pH, pH טווח 0&ndash; 14</td><td>FisherBrand</td><td>M95903</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל, 50 מ"ל צינור צנטריפוגה פוליפרופילן חרוטי</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103 21-108</td><td>כלורופורם תואם</td></tr><tr><td>50 מ"ל מערבולת מצורף</td><td>MoBio</td><td>13000-V1-50</td><td></td></tr><tr><td>דלי קרח</td><td>FisherBrand</td><td>02-591-44</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית 27.25x70 מ"מ</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>לנשום ממברנות צלחת קלות יותר</td><td>Midwest Scientific</td><td>BERM-2000</td><td></td></tr><tr><td>מגבוני אלכוהול</td><td>מגוון ביוטק</td><td>BPWP-1000</td><td></td></tr><tr><td>חממת שייקר חימום</td><td>מדד, Incu-Shaker מיני</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסובב צינור רוטיסרי אנלוגי</td><td>SoCal BioMed, LLC</td><td>82422001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת הכנת דגימה בעזרת מסנן</td><td>FASP; Expedeon</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט</td><td>Biotek, EPOCH-20</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מעלות צלזיוס מקפיא</td><td>פישר</td><td>13986149-80</td><td></td></tr> <tr><td>מעלות צלזיוס מקפיא</td><td>סטירלינג אולטרה-קר</td><td>SU78OUE</td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive מלכודת יונים ספקטרומטר מסה</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7890A כרומטוגרף גז יחד עם מרובע יחיד ספקטרומטר מסה 5975C</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velo</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters NanoEquityTM UPLC מערכת</td><td>Millford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל בקבוק מדיה</td><td>FisherBrand</td><td>1395-250</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון מים</td><td></td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית MS בקבוקון דגימה ומוסיף</td>, <td>MicroSolv</td><td>9502S-WCV, 9502S-02ND</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית בקבוקון HPLC וכובעי הצמד</td><td>MicroSolv</td><td>9512C-0DCV, 9502C-10C-B</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 96 בארות</td><td>צלחת Agilent</td><td>5042-6454</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון זכוכית גדול 27.25x70 מ"מ</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>7934021</td><td></td></tr><tr><td>מרית ראש שטוח מנירוסטה מלוטשת</td><td>Spoonula; FisherBrand</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>מגבוני קים</td><td>קימברלי-קלארק</td><td>34721</td><td></td></tr><tr><td>XBridge C18, 250x4.6 מ"מ, 5 &mu; M עם עמוד שמירה 4.6x20 מ"מ</td><td>Waters</td><td>186003117, 186003064</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1100 series HPLC מערכת Agilent</td><td>Technologies</td><td>G1380-90000</td><td></td></tr><tr><td>1.7 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>Sorenson</td><td>11700</td><td></td></tr><tr><td>המילטון מזרקי זכוכית, 5 מ"ל, 50 ומיקרו; L ו-250&micro; L</td><td>המילטון</td><td>81517, 80975, 81175</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר</td><td>פישרברנד</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>נורות פיפטה פסטר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z111597</td><td></td></tr><tr><td>אמבטיה סוניקטור</td><td>ברנסון 1800 שואב</td><td></td><td></td>אולטרסאונד</tr><tr><td>צנטריפוגת ואקום</td><td>Labconco Centrivap מערכת</td><td></td><td></td>ריכוז עמידה לחומצה</tr><tr><td>עמודי MicroSpin, C18 סיליקה</td><td>קבוצת הקן</td><td>SEM SS18V</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול mplex עבור ניתוחים מולטי-omic של דגימות אדמה

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

ספקטרומטר מסה (MS)-מבוסס metaproteomic משולב, metabolomic ו- lipidomic (multi-omic) מחקרים משנים צורה של היכולת שלנו להבין ולאפיין קהילות חיידקים במערכות ביולוגיות וסביבתיות. מדידות אלה אפילו אתם מאפשרים ניתוח משופרת הקהילות מיקרוביאלית בקרקע מורכבים, אשר הם הכי מערכות מורכבות מיקרוביאלי ידוע עד כה. ניתוח רב-omic, אולם בעל מדגם הכנה אתגרים, מאז נפרד עקירות נדרשים בדרך כלל עבור כל מחקר omic, במיתון מגביר את זמן הכנה ואת משך דגימת נדרש. כדי לטפל מגבלה זו, שיטה 3 ב- 1 על החילוץ סימולטני של מטבוליטים, חלבונים ושומנים (MPLEx) מן הקרקע באותה דגימת זרע נוצר על ידי התאמת בגישה ממס מבוסס. פרוטוקול זה MPLEx הוכיחה להיות פשוטה וגם חזקים עבור סוגי דגימה רבים, גם כאשר מנוצל עבור כמויות מוגבלות של דגימות. אדמה מורכבים. שיטת MPLEx זמין במידה רבה גם את המידות מהירה multi-omic הדרושים כדי להשיג הבנה טובה יותר של חברי כל הקהילה מיקרוביאלי, תוך הערכת את השינויים המתרחשים בעת לפליטת ביולוגי וסביבתי.

כאשר פרוטוקול MPLEx שימש כדי לחלץ מולקולות של קנזס ערבה יליד האדמה (קרקע Mollisol), הבדיקות triplicate מספק תוצאות עבור 3376 פפטידים, ליפידים 105 ו 102 קוטבי מטבוליטים (כל המזהים הייחודיים). בזמן פרוטוקול MPLEx הייתה ומבוססת לחילוץ כללי של ליפידים, מטבוליטים12,13,14,15,16,17,<sup cl...

פרוטוקול מוצג עבור חילוץ מטבוליטים, חלבונים ושומנים דגימת אדמה אחד בו זמנית, המאפשר דגימת מופחתת הכנה פעמים ולאפשר מולטי-omic ניתוחים ספקטרומטר מסה של דגימות עם כמויות מוגבלות.

פרוטוקול MPLEx עבור ניתוחים מולטי-omic של דגימות אדמה

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

שיטה זו משמשת בתחומי הפרוטאומיקה, המטבולומיקה והליפידומיקה על ידי סיוע בהשגת מידע מקיף על השינויים המולקולריים המתרחשים בקהילות מיקרוביאליות הקשורות לקרקע עקב הפרעות סביבתיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהשגת אנליטים מרובים מדגימת קרקע אחת מגדילה את הדיוק והדיוק תוך הפחתת זמן הכנת הדגימה והמאמץ. כדי להתחיל, עבור כל דגימת אדמה של 20 גרם, שקלו 10 גרם לשני צינורות נפרדים של 50 מיליליטר תואמי מתנול/כלורופורם.השתמש בצינורות פלסטיק העשויים מ-PTFE, שכן כלורופורם ידלוף את רוב הפלסטיק ויזהם את הדגימות. הוסף כ -10 מיליליטר נירוסטה וחרוזי נופך שטופים בכלורופורם לכל צינור. לאחר מכן, תוך כדי קרח, הוסיפו ארבעה מיליליטר מים קרים טהורים לכל צינור, והעבירו את הדגימות בדלי קרח לתוך מכסה אדים.בעזרת פיפטה סרולוגית מזכוכית של 25 מיליליטר, הוסף במהירות 20 מיליליטר של כלורופורם קר כקרח שניים לאחד לנפח/נפח מתנול לצינורות. הדק את המכסים ומערבל את תערובת האדמה לתמיסה. הכלורופורם-מתנול מסייע בפירוק דופן התא של פרוקריוטים וגם משבית פעילויות אנזימטיות.לאחר מכן, חבר את הצינורות לחיבורי מערבולת צינור של 50 מיליליטר, ומערבולת אופקית למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס בתוך מקרר במידת האפשר. לאחר מכן, הניחו את הדגימות בתוך מקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס למשך כ-15 דקות על מנת לקרר אותן לחלוטין. לאחר מכן, באמצעות סוניקטור בדיקה בתוך מכסה אדים, סוניקציה של כל דגימה עם בדיקה של שישה מילימטרים, 1/4 אינץ' במשרעת של 60% למשך 30 שניות על קרח.לאחר סוניקציה, הניחו את הדגימות במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס, מכיוון שסוניקציה יכולה לייצר חום רב. לאחר חזרה על שלבי המערבולת האופקית, הסוניקציה וההקפאה, צנטריפוגה את הדגימות בכוח הכבידה פי 4,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בשלב זה, הדגימה תופרד לשכבת המטבוליט העליונה, שכבת הביניים של החלבון ושכבת השומנים התחתונה.הניחו את הדגימות על קרח. לאחר מכן, בתוך קולט אדים, השתמש בפיפטה סרולוגית מזכוכית של 10 מיליליטר כדי להעביר את שכבות המטבוליט העליונות משני הצינורות של 50 מיליליטר לבקבוקון זכוכית אחד גדול. כעת, הטה מעט את הצינור של 50 מיליליטר כדי לשחרר את שכבת החלבון כך שהיא צפה בחופשיות על שכבת השומנים התחתונה.לאחר מכן, בעזרת מרית מעבדה נקייה מנירוסטה, גרפו בזהירות את שתי שכבות החלבון, והניחו אותן יחד לצינור אחד חדש של 50 מיליליטר. בעזרת פיפטה סרולוגית מזכוכית של 25 מיליליטר, העבירו את שכבות השומנים התחתונות לבקבוקון זכוכית אחד גדול. הוסף 20 מיליליטר מתנול קר כקרח לשני הצינורות עם הפסולת ולצינור האחד עם שכבת החלבון.מערבל לזמן קצר את הצינורות, וצנטריפוגה את כדורי הפסולת ושכבת החלבון בכוח הכבידה פי 4,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, שפכו את המתנול למיכל פסולת מסוכנת בתוך קולט אדים. הקפיאו את כדורי החלבון והפסולת בחנקן נוזלי, וייבשו אותם בליופילייזר למשך כשעתיים.הוסף 20 מיליליטר של מאגר מסיסות חלבון במאגר טריס של 50 מילי-מולרי, pH 8.0, לכל אחד מכדורי הפסולת ו-10 מיליליטר לצינור הבין-שכבתי של החלבון. במכסה המנוע, בדוק סוניקציה של הדגימות במשרעת של 20% למשך 30 שניות כדי להביא אותן לתמיסה. מערבולת את הדגימות למשך שתי דקות.לאחר מכן, הנח את דגימת שכבת החלבון לתוך מסובב צינור מעבדה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להמיס את החלבון. מערבולת אופקית את דגימות הפסולת למשך 10 דקות נוספות כדי לליז את כל התאים השלמים שנותרו. לאחר מכן, סובב עם דגימות שכבת החלבון למשך 20 הדקות הנותרות.צנטריפוגה של כל הדגימות בכוח הכבידה פי 4,500 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ואוספת את הסופרנטנט מכל צינור לדגימה לשני צינורות של 50 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר של מאגר מסיסות לגלולה הבין-שכבתית של החלבון. לאחר מכן, סוניקט ומערבול את הגלולה בחזרה לתמיסה.לאחר הצנטריפוגה, שלבו באופן שווה את הסופרנטנטים לתוך שני הצינורות של 50 מיליליטר עם כדורי הפסולת, וצנטריפוגה את הצינורות ברוטור דלי בזווית קבועה בכוח הכבידה פי 8,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על מנת לזרוק את כל הפסולת שנותרה. חלקו את הסופרנטנטים לשני צינורות של 50 מיליליטר. לאחר מכן, בעזרת פיפטה סרולוגית מזכוכית של 10 מיליליטר, הוסף 7.5 מיליליטר TCA לכל צינור.מערבול את הדגימות לתמיסה. לאחר מכן, הכניסו את הדגימות למקפיא שלילי של 20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד לילה. כדי לזרוק את החלבון המשקע, צנטריפוגה את הדגימה בכוח הכבידה פי 4,500 וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ושפכו את הסופרנטנט לפסולת.הוסף 10 מיליליטר של 100% אצטון קר כקרח לכל כדור חלבון. מערבל את הצינורות, ומשלב כמו כדורים לצינור אחד. צנטריפוגה ואז לשפוך את האצטון.בעזרת נפח אצטון קטן יותר, שטפו את הגלולה פעמיים, והעבירו את המתלה לצינור של 1.5 או שני מיליליטר לסיבוב הסופי. שפכו את הסופרנטנט לפסולת, והניחו לגלולה להתייבש הפוך על מגבון נייר במכסה אדים למשך כ-20 דקות. בהתאם לגודל הגלולה, הוסף 100 עד 200 מיקרוליטר ממאגר המסת החלבון.סוניקט ומערבל את הגלולה לתמיסה. שימו לב שהדגימה עשויה להיות צמיגה עקב חומרים הומיים המשקעים יחד עם החלבון, אשר יוסרו עם צנטריפוגה לאחר מכן. לבסוף, יש לנער את הדגימה באינקובטור או בשייקר ב-300 סל"ד ו-40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כדי להמיס את החלבון לתמיסה לפני שתמשיך לעיכול חלבון או הקפאה מהירה לעיבוד עתידי.באמצעות פרוטוקול MPLEx שהודגם בסרטון זה, 3,376 פפטידים, 105 ליפידים ו-102 מטבוליטים קוטביים הופקו מאדמת הערבה המקומית של קנזס, ומיצוי החלבונים של הפרוטוקול מושווה לערכות מיצוי חלבונים ומיצוי SDS באמצעות LC-MS/MS בשלב הפוך. כאשר משווים בתחילה שלושה שכפולים של ערכת מיצוי החלבון המסחרית ושיטות SDS, רק 12% מהפפטידים חופפים בין שתי הטכניקות, מה שמראה את המורכבות של הקהילה המיקרוביאלית והשפעות מיצוי שונות. בהשוואה של MPLEx עם ערכת מיצוי חלבון מסחרית ותמציות SDS, כ-38% מהפפטידים שנצפו בשיטת MPLEx זוהו גם בעת שימוש במיצוי SDS ו/או ערכה מסחרית.בהתחשב במספר המינים בקהילת חיידקי הקרקע של קנזס והמטאגנום שלה, החפיפה של זיהויי פפטידים היא סבירה. כפי שמוצג כאן, הישימות הרחבה של גישת MPLEx הוערכה בעבר באמצעות הארכיאון S.acidocaldarius, קונסורציום חד-ציאנובקטריאלי, רקמת קליפת המוח של העכבר, שתן אנושי ועלים מ-A.thaliana. בכל המקרים, מספר החלבונים שנצפו בשיטת MPLEx היה דומה לזה של הביקורת, מה שמצביע על התועלת שלה עבור סוגי דגימות רבים ושונים.אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשיג חלבונים, מטבוליטים ושומנים מדגימת אדמה אחת. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להיות גמיש, מכיוון שכל סוגי הקרקע שונים. לדוגמה, גודל שכבת החלבון ישתנה, בהתאם לביומסה של הקרקע ולחומרים הומיים הקיימים באדמה.אל תשכח שעבודה עם כלורופורם עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה במכסה אדים בעת ניסיון הליך זה.

the-mplex-protocol-for-multi-omic-analyses-of-soil-samples

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

אנו מתארים שיטה זמנית לצורך זיהוי של מיקרואורגניזמים בתוך מדגם באמצעות חרוזי ניאון oligonucleotide מצמידים. Amplicon מכל האורגניזמים בתוך מדגם הוא הכלאה בפני פאנל של בדיקה, בשילוב חרוזים. מכשיר Luminex או Bio-Plex משמש עבור כל שאילתת חרוז חרוז סוג האות הכלאה.

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

חומצות שומן פוספוליפידים לספק מידע על המבנה של קהילות חיידקי אדמה. אנו מציגים שיטות חילוץ מתוך דגימות קרקע בתערובת כלורופורם חד פאזיים, חלוקה של שומני חילוץ באמצעות עמודות מיצוי שלב מוצק, methanolysis לייצר אסטרים מתיל חומצות שומן, אשר מנותחים על ידי גז כרומטוגרפיה נימים.

הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות

מחקר זה מציג שיטה החפירה לחקירת הידרולוגיים מתחת לפני הקרקע, גיאוכימיים, וההטרוגניות מיקרוביולוגיות של lysimeter אדמה. Lysimeter מדמה hillslope המלאכותי שהיה בתחילה בתנאי הומוגניות היה נתון כ -5,000 מ"מ של מים במשך שמונה מחזורים של השקיה ב תקופה של 18 חודשים.

חפירה באדמה Lysimeter עבור ההידרולוגי מצמידים, גיאוכימיות, וחקירות מיקרוביולוגיות

המאמר מתאר שיטה מגדילה את התפוקה תוך איזון המאמץ והדיוק של מיצוי שומנים מתוך קרום התא של מיקרואורגניזמים לשימוש באפיון שתי ליפידים סה"כ ואת השפע היחסי של שומנים מחוון כדי לקבוע מבנה הקהילה מיקרוביאלית הקרקע במחקרים עם דוגמאות רבות.

ליפיד הפקת וניתוח שיטה לאפיון קרקע חיידקים בניסויים עם דוגמאות רבות

Nanopore טכנולוגיה עבור רצפי מולקולות יש אפליקציות רחב במדעי החיים, כולל זיהוי של פתוגנים, ניטור בטיחות מזון, אנליזה גנומית, ניטור סביבתי metagenomic אפיון בקטריאלי עמידות לאנטיביוטיקה. במאמר זה, הוכח נוהל metagenomic אדמה רצפי DNA לצורך זיהוי מינים בטכנולוגיה רצף nanopore.

Nanopore רצפי DNA לניתוח Metagenomic אדמה

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

זיהוי של וריאציות גנטיות לתרום מחלות אנושיות מורכבות מאפשר לנו לזהות מנגנונים חדשניים. . הנה, נדגים הגישה מולטיפלקס genotyping של המועמד גנים או מסלול מפענוח ממקסם את הכיסוי במחיר נמוך, הוא נוטה מחקרי עוקבה מבוסס.

ג'ין המועמד בדיקות במחקרים קליניים עוקבה ועם Genotyping מרובבת ספקטרומטר מסה

חפירה של שורשי צמחים מן השדה, כמו גם עיבוד של דגימות לתוך endosphere, rhizosphere ואדמה מתוארים בפירוט, כולל הפקת דנ א ושיטות ניתוח הנתונים. נייר זה נועד לאפשר מעבדות אחרות שימוש בטכניקות אלה לצורך המחקר של קרקע, endosphere, rhizosphere microbiomes.

בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה ומהירה של culturing שמרים ואת התבנית Aspergillus fumigatus מקבוצות גדולות של דגימות קרקע תוך 7 ימים בלבד. ניתן לשנות את השיטות בקלות כך שיתאימו למגוון של מדיות דגירה וטמפרטורות לפי הצורך לניסויים.

בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית

למדו את פרוטוקול MPLEx לחילוץ מקביל של מטבוליטים, חלבונים וליפידים מדגימות אדמה בודדות. שיטה זו מייעלת הכנת דגימות ומשפרת דיוק בניתוחי מסה ספקטרומטריה מולטי-אומיים.

פרוטוקול MPLEx עבור ניתוחים מולטי-omic של דגימות אדמה

גלה סרטונים נוספים