שימוש dUTP בתיווך טרנספראז מסוף מבחני סיום ניק-תוויות (TUNEL) ו קספאז 3/7 כדי למדוד מות תאים באפידרמיס של צפרדעים עם צ'יטרידיומיקוסיס
16 במאי 2018
אנחנו לכמת מוות תאי אפידרמיס של צפרדעים עם צ'יטרידיומיקוסיס באמצעות שתי שיטות. ראשית, אנו משתמשים dUTP טרנספראז בתיווך מסוף ניק labelling-סוף (TUNEL) בחיי עיר היסטולוגיה כדי לקבוע את ההבדלים בין בעלי חיים נגועים קליניות, נגוע. שנית, אנו מבצעים ניתוח סדרות זמן של אפופטוזיס על זיהום באמצעות ניתוח חלבון קספאז 3/7.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבחון את ההשפעה של פתוגן פטרייתי דו-חיים batrachochytrium dendrobatidis על אפופטוזיס ומוות תאים ברקמת האפידרמיס של צפרדעים. שיטה זו יכולה לסייע לנו להבין מחלות של חיות בר כמו למשל אם זיהום גורם למוות של תאים, או להיפך, אם יש מנגנונים חיסוניים נגד זיהום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אותה על דגימות ביופסיה קטנות של רקמות כך שניתן יהיה לדגום שוב ושוב אנשים קטנים במהלך ההדבקה.
כדי להתחיל בהליך זה, הכינו שקופיות זכוכית הידרופיליות עם רקמת דגימה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לנטרל את חלקי הרקמות, שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם קסילן למשך חמש דקות כל אחת בצנצנת קופלין. לאחר מכן, שטפו את השקופיות עם 100% אתנול פעמיים למשך חמש דקות כל אחת.
לאחר מכן, שטפו את השקופיות עם 95% אתנול ו-70% אתנול למשך שלוש דקות כל אחת. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעם אחת עם PBS למשך חמש דקות. כדי להכין שקופיות בקרה ניסיוניות ושליליות, טפל ברקמה מראש על ידי הוספת חלבון K מדולל טרי ישירות לשקופיות.
דגרו את המגלשות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את השקופיות ב-PBS פעמיים למשך שתי דקות כל אחת. כדי להכין שקופיות בקרה חיוביות, טפל מראש ברקמה עם מאגר DN ולאחר מכן דגר את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.
לאחר מכן, ממיסים DNase אחד במאגר DN לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם למיליליטר. הוסף את תמיסת ה- DNase המוכנה לשקופיות. דגרו את המגלשות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, שטפו את המגלשות במים מזוקקים בצנצנת קופלין חמש פעמים למשך שלוש דקות כל אחת. להרוות את התגובה במי חמצן 3% ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את השקופיות ב-PBS פעמיים למשך שתי דקות כל אחת.
לאחר מכן, הוסף מאגר שיווי משקל לרקמה שעל השקופיות. יש לדגור למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הקש על עודפי הנוזל סביב חלק הרקמה.
לדלל את האנזים הטרמינלי דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז במאגר תגובה. לאחר מכן, הוסף אותו לרקמה בשקופיות הבקרה הניסיוניות והחיוביות. דגירה בתא לח למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הניחו את השקופיות בצנצנת קופלין המכילה את ריכוז העבודה של מאגר העצירה. מערבבים במשך 15 שניות ואז מדגרים את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות עם PBS שלוש פעמים למשך דקה אחת כל אחת והקישו על עודפי הנוזל.
לאחר מכן, הוסיפו את המצומד נגד דיגוקסיגנין, שחומם מראש לטמפרטורת החדר, ישירות על הרקמה. דגרו את המגלשות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא חשוך ולח. לאחר השלמת הדגירה, שטפו את השקופיות עם PBS ארבע פעמים למשך שתי דקות כל אחת.
הקש על עודפי נוזלים. לאחר מכן, הוסף אמצעי הרכבה לשקופיות. הוסף 15 מיקרוליטר של תמיסת DAPI למדיום ההרכבה בשקופיות.
מכסים כל שקופית בהחלקת כיסוי ואוטמים בלק. הניחו למגלשות להתייבש בחושך. בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, התבונן בשקופיות מיד עם סיום תהליך העמידה.
צלם תמונות 400 פעמים במרווחי זמן אקראיים לאורך כל חלק של העור. ספור תאים כחולים מוכתמים ב-DAPI כדי להבטיח שלפחות 100 תאים לכל קטע עור לכל בעל חיים נראים לעין. לאחר מכן, ספרו את מספר התאים החיוביים ל-TUNEL המופיעים כתאים בודדים אדומים עם קצוות תאים ברורים.
כדי להתחיל, השתמשו במיקרוסקופ אור הפוך 40 פעמים כדי לצלם כל אחת מאצבעות הצפרדע. צייר קווים סביב קצה קליפ הבוהן והשתמש בתוכנת הדמיה כדי להעריך את השטח בתוך הצורה. כדי להעריך את שטח הפנים של דגימת העור התלת מימדית, הכפל את השטח המשוער ב-pi.
כדי לחלץ חלבונים מדגימת בוהן צפרדע קפואה, הנח את הדגימה בצינור מיקרו-צנטריפוגה של מכסה בורג של 1.5 מיליליטר המכיל 100 מיקרוליטר של מאגר דגימה ושני חרוזי נירוסטה. השתמש במקצף חרוזים במהירות מקסימלית כדי לליז את התאים. לאחר מכן, הניחו את הצינור על קרח למשך שלוש דקות.
לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור כדי לאסוף את הסופרנטנט. כדי לבצע את בדיקת הקספאז 3/7 בצלחת של 384 בארות, הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר דגימה כריק ו-10 מיקרוליטר תמצית חלבון במשולש. לאחר מכן, פיפטה 10 מיקרוליטר של מגיב קספאז 3/7 זמין מסחרית לתמצית החלבון ולבארות ריקות.
לאחר מכן, יש לנער את הצלחת בעדינות למשך 15 שניות כדי לערבב את שני הריאגנטים. דוגרים בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות. לבסוף, השתמש בקורא צלחות זוהר כדי למדוד את הזוהר של הדגימה.
במחקר זה, החיות הנגועות מתארות באופן משמעותי יותר תאים חיוביים ל-TUNEL בהשוואה לחיות ביקורת, כפי שמודגם על ידי תאים מוכתמים באדום או ורוד. בחיות ביקורת, ישנם מעט תאים חיוביים ל-TUNEL, והם אינם מרוכזים באפידרמיס. בבעלי חיים נגועים, התאים החיוביים ל-TUNEL שכיחים יותר באפידרמיס.
תאים חיוביים ל-TUNEL מרוכזים יותר וצמודים ישירות למראות של תאים נגועים. כמו כן, ישנם תאים חיוביים ל-TUNEL נפוצים יותר מעל האפידרמיס ובשכבות האפידרמיס העמוקות יותר מהמקום שבו שכן הפתוגן הפטרייתי. בבעלי חיים נגועים, ישנם יותר תאים חיוביים ל-TUNEL בכל שלושת סוגי העור עם רמה גבוהה במיוחד בעור הירך והעור.
בבדיקת הקספאז, עוצמת ההדבקה נמצאת בקורלציה חיובית עם פעילות קספאז 3/7. בנוסף, פעילות קספאז 3/7 בבעלי חיים נגועים ולא נגועים השתנתה לאורך זמן. פעילות Caspase 3/7 פחתה בשבועות הראשונים לאחר החיסון ולאחר מכן עלתה לקראת סוף השבוע השביעי בבעלי חיים נגועים.
פעילות Caspase 3/7 נותרה קבועה בפרטים לא נגועים. בזמן ניסיון ההליך לבדיקת TUNEL, חשוב לקרוא את השקופיות באותו יום של הבדיקה כדי למנוע אובדן רגישות ולשמור את השקופיות במקום חשוך וקריר כדי להגן על הצבעים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות אפופטוזיס ומוות תאים באמצעות שתי שיטות זיהוי שונות בדגימות רקמה קטנות כמו עור דו-חיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את השפעת הפטריית הפתוגנית של דו-מינמיים Batrachochytrium dendrobatidis על אפופטוזיס ומוות תאי ברקמת העור של צפרדעים. באמצעות שימוש בהיסטולוגיה of TUNEL in situ ובניתוח חלבון caspase 3/7, המחקר שואף להבהיר את הקשר בין הזיהום לבין מות התאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מחלות ברים
- ביולוגיה של התא
רקע
- כיטרידיומיקוזיס (Chytridiomycosis) מהווה איום משמעותי על אוכלוסיות דו-חיים.
- הבנת מנגנוני מוות של תאים עשויה לסייע במאמצי שימור.
- אפופטוזיס עשוי למלא תפקיד בתגובה לזיהומים פטרייתיים.
- דגימות רקמה קטנות מאפשרות ניתוח חוזר לאורך תקופת הזיהום.
מטרת המחקר
- לכימות מוות של תאי עור בצאפדרים הinfected בכיטרידיומקוזיס.
- לקביעת הבדלים באפופטוזה בין צפרדעים נגועות לבלתי נגועות.
- לניתוח מהלך הזמן של האפופטוזה במהלך הזיהום.
שיטות שהושתמשו
- סימון קצוות חסרים באמצעות dUTP באמצעות טרמינל טרנספראז (TUNEL) לאנליזה היסטולוגית.
- אנליזת חלבוני Caspase 3/7 להערכת סדרות זמן.
- הכנת שקופיות זכוכית הידרופיליות עם דגימות רקמה.
- דפראפיניזציה של חיתוכי רקמה באמצעות שטיפות של קסילן ואתנול.
תוצאות עיקריות
- נצפו הבדלים בשיעורי האפופטוזיס בין צפרדעים נגועות לבין צפרדעים שאינן נגועות.
- ניתוח סדרות זמן חשף מגמות של מוות תאי במהלך ההדבקה.
- השיטות הוכיחו יעילות בניתוח דגימות רקמה קטנות.
- התובנות שנרכשו עשויות לתרום להבנת התגובות החיסוניות לזיהום.
מסקנות
- המחקר מספק נתונים בעלי ערך על השפעות ה-chytridiomycosis על תאי העור של צפרדעים.
- הבנת האפופטוזיס בהקשר זה עשויה לסייע באסטרטגיות לשימור חיות בר.
- מחקרים עתידיים יוכלו לבחון מנגנונים חיסוניים נגד זיהומים פטרייתיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מחקר זה מדגים כיצד ניתן להשתמש בבדיקות אפופטוזה להערכת נזק לרקמות המושרה על ידי פתוגנים במודלים של מחלות בבעלי בר, ובכך לספק מסגרת להסרת סיכונים מכניסטית בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות. באמצעות כימות מוות של תאי אפדרמיס בצפרדעים המודבקות ב-Batrachochytrium dendrobatidis, גישה זו תומכת בביטחון חזוי בהערכת אינטראקציות בין מאח and פתוגן ומספקת מידע לגילוי ביומרקרים תרגומיים. השימוש בביופסיות רקמה קטנות מאפשר דגימה לאורכית, שהיא קריטית למעקב אחר התקדמות המחלה והתערבות טיפולית במערכות פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי הבחנה בין אפופטוזיס המונע על ידי פתוגנים לבין מנגנוני הגנה של המאכסנר ברקמה אפידרמלית.
- ערך תפעולי: מספק נתונים על מוות תאי עם רזולוציה מרחבית באמצעות צביעת TUNEL, כדי להבהיר מנגנונים של פגיעה ברקמות במודלים של מחלות זיהומיות.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון במטרה על ידי קורלציה בין פעילות caspase 3/7 לעומס הזיהום לאורך זמן, מה שמאפשר ניתוח תגובה למספר ותיחום זמני.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: קובע פרוטוקולים סטנדרטיים לזיהוי אפו פטוזיס (apoptosis) בדגימות רקמה קטנות, מה שמאפשר סריקת תרכובות הניתנת לשחזור בתנאים של חומר מוגבל.
- ערך תפעולי: בדיקת Caspase 3/7 מציעה תאימות לסריקה בהספק גבוה (high-throughput) עבור ניסויי סדרת זמנים, בעוד ששיטת TUNEL מספקת תיקוף של דפוסי אפו פטוזיס מרחביים.
- מוכנות הבדיקה: מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומדידות לומינסנציה מייצרות פלטים כמותיים המתאימים לאופטימיזציה של הבדיקה ולשחזור בין מעבדות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין אפופטוזיס של העור לבין חומרת המחלה, ובכך תומך בהלימה של סמנים ביולוגיים בין תוצרי קריאה מולקולריים לבין התקדמות קלינית של הזיהום.
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות לגבי התקדמות מותאמת סיכונים על ידי מעקב אחר הדינמיקה של caspase 3/7 לאורך שלבי הזיהום במחקרי אורך.
- רצף תרגומי: מדגים כיצד ניתן לשלב בדיקות אפופטוזיס היסטולוגיות וביוכימיות כדי לחזק את התוקף הפרה-קליני במודלים של מחלות זיהומיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת קריאות של אפופטוזיס המנחות את תיקוף המטרה ואת זיהוי המולקולות המובילות, במיוחד במחקרים שבהם נגישות הרקמה מגבילה היסטולוגיה קונבנציונלית.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי השאלה האם חשיפה לנשג humedad מעוררת או מדכאת אפופטוזיס ברקמת המארח, ובכך מבהירה את מנגנוני הנזק הרקומתי.
- סריקה: בדיקת Caspase 3/7 מאפשרת סריקה כמותית וניתנת להרחבה של מודולטורים המשפיעים על אפופטוזיס בדגימות ביופסיה קטנות.
- אנליזה: פלטים לומניסנטיים ופלואורסצנטיים מספקים מדידות כמותיות ונורמליזיות להשוואת אפופטוזיס בין תנאים ובנקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פעילות אפופטוזיס מולקולרית לשינויים היסטופתולוגיים, ובכך תומך בתיקוף של ביומארקרים במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: השילוב של גישת TUNEL ו-caspase 3/7 מקיים פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לאפיון אפופטוזיס במחקרי מחלות זיהומיות וטוקסיקולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי הבחנה בין הלוקליזציה והקינטיקה של אפופטוזיס ברקמות נגועות לעומת רקמות בקרה.
- ערך תפעולי: פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת סלייסים (slides) ולדימות מבטיחים שחזוריות בין מעבדות ובין סדרות של דגימות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מוקדמת יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) באמצעות אספקת סממנים ביולוגיים מוקדמים למצבי עקה של רקמה ולהשפעת פתוגנים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מבוסס סיכון על ידי כימות של אפופטוזיס כמדד תפקודי למנגנון המחלה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהיסטולוגיה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומיצוי חלבונים מדגימות רקמה מוגבלות.
- תלוי בגישה לקריוסטט, מיקרוסקופ פלואורסצנטי וקורא פלטות לומנסצנטי עבור בדיקות TUNEL ו-caspase 3/7.
- מחייב סטנדרטיזציה בין המשתמשים לגבי חיתוך רקמות, תזמון צביעה והגדרות דימוג כדי לשמור על רגישות הבדיקה.
- התאמה למערכות מודל אחרות מחייבת תיקוף של חדירות הנוגדנים ונגישות האנזימים בסוגי רקמות שונים.
- מגבלה מעשית: ביופסיות קטנות מקצה הבהו הקיצוניות מגבילות את תבואת החלבון, דבר המחייב שיטות נורמליזציה חלופיות, כגון הערכת שטח פני השטח של העור באמצעות דימוג, כדי למנוע צריכה מוגברת של התמצית.
