כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

המטרה הכוללת של שיטות צביעה אלו היא לכמת את שפע השומנים התוך תאיים ולהעריך את התפלגות השומנים בין רקמות שונות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במטבוליזם של שומנים, כגון כיצד מווסתים שומנים מבחינה גנטית וביוכימית ואילו מצבי מחלה זה מווסת את הומאוסטזיס השומנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה יחסית וזולה לביצוע.

כדי לבצע צביעת שומנים אדומים של הנילוס, תולעי צלחת על Nematode Growth Medium או NGM זרעו עם יומן מאוחר OP50 E.coli ומגדלות את התולעים ב-20 מעלות צלזיוס עד שלב L4 מוקדם. שוטפים את התולעים במילימטר אחד של תמיסת PBST ומעבירים את מתלה התולעת לצינור מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את התולעים בכוח הכבידה פי 560 למשך דקה אחת.

לאחר מכן הסר את הסופרנטנט וחזור על שטיפת ה-PBST עד לפינוי ה-E.coli מהמתלה. לאחר מכן, לגלולת התולעת, הוסף 100 מיקרוליטר של 40% איזופרופנול או 60% לצביעה של ORO ודגר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. תוספת איזופרופנול חיונית לחדירה נכונה של התולעים לפני הצביעה.

צנטריפוגה של התולעים בכוח הכבידה פי 560 למשך דקה אחת והסר את הסופרנטנט מבלי לשבש את כדור התולעת. חשוב למזער את החשיפה לאור במהלך שלבי הצנטריפוגה. כעת, בחושך, הוסף 600 מיקרוליטר של תמיסת עבודה NR שהוכנה בעבר לכל דגימה.

הפוך את הצינורות שלוש פעמים וערבב לחלוטין את התולעים והתמיסה. לאחר מכן דגרו את הדגימה בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר הדגירה יש לצנטריפוגה את התולעים ולהסיר את הסופרנטנט.

לאחר מכן הוסף 600 מיקרוליטר PBST ודגר את הדגימות בחושך למשך 30 דקות כדי להסיר את כתם ה- NR העודף. לאחר סיבוב הדגימות שוב כמו קודם, הסר את כל הסופרנטנט מלבד כ-50 מיקרוליטר והשהה מחדש את כדור התולעת בתמיסה הנותרת. כדי להכין שקופיות להדמיה, פיפטה חמישה מיקרוליטרים של תרחיף תולעת על שקופית מיקרוסקופ והניחו בזהירות כיסוי כדי למנוע לכידת בועות אוויר.

באמצעות ערוץ FITC GFP כדי לצלם תולעים מוכתמות NR ולנסות זמני חשיפה שונים, דמיין את התולעים בהגדלה של פי חמישה כדי ללכוד מספר בעלי חיים בכל שדה ראייה. לאחר מכן עברו להגדלה של פי 10 לכימות טוב יותר של תולעים בודדות. כדי לכמת את התמונות, העלה את המיקרוגרפים ל-ImageJ.

בתפריט הנפתח כלפי מטה, כוונן את הבהירות, הניגודיות של חבילת התמונות והפיץ שינויים בכל התמונות על ידי לחיצה על החל. השתמש בכלי בחירת המצולע כדי לתאר כל תולעת מצולמת ותחת התפריט הנפתח למטה של הניתוח, השתמש בפונקציית המדידה כדי לאשר את עוצמת הקרינה הנפלטת על ידי NR. עבור כל תמונה, מדוד חמישה מיקומי רקע וחשב את עוצמת הקרינה הממוצעת ברקע. הוסף 600 מיקרוליטר של תמיסת עבודה Oil Red O או ORO לכל דגימה והפוך את הצינור שלוש פעמים כדי לערבב היטב את התולעים ואת ה-ORO.

סובב את הדגימות ב-30 סל"ד ו-RT למשך שעתיים. צנטריפוגה של הדגימות בכוח הכבידה פי 560 למשך דקה אחת ושואבת את כל הסופרנטנט למעט 100 מיקרוליטר. לאחר מכן השתמש ב-600 מיקרוליטר של PBST כדי להשעות מחדש את הדגימות ולסובב את הצינורות ב-30 סל"ד למשך 30 דקות כדי להסיר עודף כתמי OR.

כדי להבחין טוב יותר במיקום קו הנבט של בעלי החיים בתאי המעי, צבעו גרעינים על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של DAPI לכל מיליליטר אחד של תמיסת עבודה ORO. לאחר מכן כדי להכין שקופיות להדמיה, השעו מחדש את התולעים ואת הסופרנטנט הנותר וערבבו היטב את התמיסה. שים חמישה מיקרוליטרים של תרחיף תולעים על שקופית מיקרוסקופ והחל בזהירות כיסוי כדי להבטיח שלא ייווצרו בועות אוויר.

כדי לצלם את התולעים המוכתמות ב-ORO, השתמש במצלמה בעלת יכולת צבע בהגדלה של פי חמישה כדי לצלם מספר תולעים בשדה ראייה אחד. לאחר מכן עבור להגדלה פי 10 לבדיקה טובה יותר של תולעים בודדות. לבסוף, לאחר העלאת התמונות ל-ImageJ ויצירת חפיסת תמונות בהתאם לפרוטוקול הטקסט, יש לסווג את התמונות לפי הצטברות שומנים בכל גוף החיה או ברקמות ספציפיות.

SKN-1 חולק הומולוגיה עם Nrf2 של יונקים והוכח כמתווך חמצון חומצות שומן. איור זה מציג חיות SKN-1 מופעלות שנחשפו לתנאים המובילים לעלייה ברמות השומנים. כפי שניתן לראות בתמונות אלה, פלואורסצנטי NR שנלכד באמצעות תעלת FITC GFP בולט לאורך המעי, אך הוא עמום יותר בראש, בזנב ובלומן המעי.

בעוד שקל לסווג את התולעים לפי נוכחות או היעדר דלדול סומטי תלוי גיל של שומן או ASDF, ייתכן שיהיה קשה לזהות בעלי חיים עם אובדן שומן בינוני. בהשוואה לבעלי חיים שאינם ASDF, המראים כתמים אדומים עזים בכל הגוף עם מעט אזורים שקופים, תולעי ASDF מציגות דלדול שומן ניכר בתאי המעי. בעלי חיים בתהליך של התפתחות ASDF מראים לעתים קרובות נקודות שקופות שבהן רוב אובדן השומן מתרחש בסופו של דבר.

יתר על כן, תולעי ASDF עדיין עשויות להופיע בצבע אדום בוהק באזורי הראש והזנב מכיוון שהפנוטיפ אינו מוגדר על ידי אובדן שומן סומטי מלא, אלא על ידי דלדול שומן נרחב בהשוואה לבעלי חיים שאינם מבוגרים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות בתוספת זמן הדמיה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשטוף ולחלחל תולעים לא יותר מ-30 דקות לפני הצביעה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופ CARS כדי להשוות את סוג מיני השומנים שכל טכנולוגיה מזהה ולקבוע איזו שיטה מתאימה יותר לסוגים ספציפיים של שאלות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לכמת שומנים ולהעריך את התפלגות השומנים בתולעים באמצעות צביעת Nile Red ו-Oil Red O, ולאחר מכן ניתוח מיקרוגרף ImageJ.