Microdissection של מקטעי רקמת הכליה העיקרי, התאגדות עם טכנולוגיית הרומן לבנות בפיגומים-חופשית

המטרה הכוללת של הליך דיסקציה מיקרוסקופי זה היא לבודד מקטעים נפרדים של רקמת כליה חיה עם ארכיטקטורה כלייתית שלמה ליישומי הנדסת רקמות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות, כגון האם ניתן לקצור מקטעים שלמים של רקמת איבר ראשוני מבודד באופן סטרילי ולשמור אותם בחיים בתרבית? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהמקטעים מכילים ארכיטקטורה כלייתית שלמה בניגוד לשימוש בקווי תאים כדי ליצור מחדש איבר מורכב עם למעלה מ-26 סוגי תאים שונים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלת כליות סופנית מכיוון שמבנים אלה ישפרו את הסינון ועשויים לעזור לחולים להימנע מדיאליזה. במהלך הניתוח, יש ללבוש ציוד כירורגי מתאים כולל מסכה וכובע כדי למזער את הסיכון לזיהום. כמו כן, עשו כל מאמץ לשמור על סטריליות לאורך כל הדרך.

התחל את ההכנות על ידי עטיפת שולחן הניתוחים. לאחר מכן, פתח את חבילת המכשירים החיטויים על הווילונות הסטריליים. עליהם לכלול שלושה המוסטטים קטנים, מלקחיים עדינים עם שיניים, מלקחיים עדינים ללא שיניים ומספריים ישרים לקשתית

כסו את מרכז שולחן הניתוחים בווילון כירורגי שני שאינו מכוסה. לפני הקמת חדר הניתוח, הכינו 50 מיליליטר של DBPS בתוספת אנטיביוטיקה והכניסו חמישה מיליליטר לתוך שפופרת של 15 מיליליטר. כעת הרדמו עכבר C57 שחור בן שמונה עד 12 שבועות ועקוב מעת לעת אחר רמת ההרדמה על ידי הערכת רפלקס הדוושה שלו עם צביטה יציבה בבוהן.

לאחר מכן, השתמש בקרם להסרת שיער כדי להסיר את כל השיער מאזור פלג הגוף העליון הגחוני ושטוף את הקרם והשיער במים מזוקקים. לאחר מכן העבירו את העכבר לשולחן הניתוחים והניחו אותו בשכיבה מתחת לווילון הלא מנופח. כעת גזרו שני סנטימטרים רבועים בווילון מעל בטן העכבר.

לאחר מכן יש לשפשף את העור החשוף עם פובידון-יוד ואחריו אתנול 70% שלוש פעמים כדי לעקר את העור ולהשלים את ההכנות לניתוח. התחל את הניתוח באמצעות מלקחיים עדינים עם שיניים ומספריים לקשתית. בצע חתך עור של שלושה עד ארבעה סנטימטרים במקביל לקו האמצע חצי סנטימטר משמאל לקו האמצע.

לאחר מכן, אחזו בצפק בעזרת מלקחיים עדינים ללא שיניים וחתכו בעזרת מספריים לקשתית כדי להיכנס לחלל הבטן. לאחר מכן יש למרוח המוסטטים על הקצוות הצדדיים העליונים והנחותים של העור והצפק כדי למקם מתח לרוחב ולשפר את החשיפה. כעת העבירו בעדינות את תוכן המעי לימין הבטן כדי לחשוף את הכליה השמאלית.

לאחר מכן הנח בעדינות מתיחה על הכליה כדי להרים אותה מהבטן. כעת הניחו המוסטט על פני הילום הכליה והשתמשו במספריים לקשתית כדי לחצות את השופכן וכלי הכליה. לאחר מכן העבירו את הכליה לצינור של 1% עט-סטרפטוקוס DBPS על קרח.

קח את הצינור הזה למכסה המנוע הסטרילי לעיבוד. שם מעבירים את הכליה לצלחת פטרי של 60 מילימטר ושוטפים אותה פעמיים עם חמישה מיליליטר DPBS טריים המכילים סידן ומגנזיום. לאחר השטיפה השנייה, השעו את הכליה בחמישה מיליליטר DBPS טריים בצלחת חדשה של 60 מילימטר.

לאחר מכן הכינו צלחת פטרי נוספת המכילה רק חמישה מיליליטר DBPS לשימוש מאוחר יותר. המשך להשתמש בטכניקה סטרילית הכוללת כפפות סטריליות, מסכה כירורגית ובופנט כדי למזער את סיכוני הזיהום. לאחר מכן עטפו את אזור הבמה והאזור המקיף את מיקרוסקופ הסטריאו.

לאחר מכן, הניחו יריעות דבק מפלסטיק על כפתורי המיקוד של המיקרוסקופ ורססו אותן באתנול 70%. לאחר מכן הפעל את תאורת צוואר האווז הכפולה כדי להאיר את הבמה. עכשיו על הווילונות הסטריליים, פתח חבילה של מכשירים מעוקרים המכילים מלקחיים עדינים ללא שיניים, ידית אזמל, להב אזמל מספר 15, שני המוסטטים ישרים ושתי מחטים חלולות בקוטר 30.5.

הנח את הלהב מספר 15 על ידית האזמל והצמד המוסטט אחד לכל רכזת מתאם מחט כדי ליצור מכשירי חיתוך מחט. כעת העבירו את שתי הכליות, האחת עם הכליה ב-DPBS והשנייה רק DPBS, לאזור המיקרוסקופ. הסר את המכסה על צלחת הכליה ומקד את המיקרוסקופ על המשטח הקדמי או האחורי של הכליה בהגדלה של פי 3.2 עד פי 4.

לאחר מכן, עם היד הלא דומיננטית, השתמש במלקחיים עדינים ללא שיניים כדי לנקב ולהצמיד את הכליה לצלחת בקטבים התחתונים והעליונים של הכליה. לאחר מכן, בעזרת היד הדומיננטית, השתמש בלהב מספר 15 כדי להסיר את שכבת הקפסולה הסיבית השקופה מהמשטח החשוף. גלח את 0.5 המילימטרים השטחיים ביותר מהמשטח החשוף של משטח הכליה כדי להסיר את שארית הקפסולה.

המשך על ידי שימוש בלהב מספר 15 כדי לנתח פירמידה הפוכה של רקמה מהאזור המפורק שהוא כשני מילימטרים רבועים. לאחר מכן העבירו את הרקמה לכלי הנקי של DBPS והשליכו את שארית הכליה. כעת התמקדו ברקמה המנותחת והקטינו את ההגדלה ל-1.5 עד 2.0X.

בעזרת שני מכשירי המחט המוסטט ככלי חיתוך, פורסים את שבר הרקמה לחתיכות קטנות יותר בהדרגה עד שקטעי הרקמה יהיו בגודל קצות המחט או קטנים יותר. יש לייצר כ -50 קטעים. זהו חלק קריטי בהליך.

כל קטע צריך להעריך מקרוב את הקוטר של קצה המחט בגודל 30-1/2 כדי למנוע מקטעים גדולים שעלולים לעכב דיפוזיה. החזר את הרקמה למכסה המנוע של תרבית הרקמות והסר את ה-DPBS באמצעות מיקרו-פיפטה P1000. לאחר מכן הוסיפו בחזרה חמישה מילימטרים של DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% עט-סטרפטוקוקוק.

לאחר מכן תרבית את הרקמה או השתל אותה בתוך מבנים תאיים באופן מיידי. הכדאיות של מקטעי הכליה השלמים המיוצרים על ידי ההליך המתואר נבדקה במשך שלושה ימים בתרבית באמצעות בדיקת כדאיות. סידן AM פלואורסצנטי ירוק קיים עם פעילות אסטראז תוך תאית המעידה על תאים חיים.

אתידיום הומודימר -1 פלואורסצנטי אדום נראה עם אובדן שלמות של קרום הפלזמה. כאשר מקטעי הכליה הוטמעו במבנים פיברובלסטים אנדותליים נטולי פיגומים, ביום השלישי הם שולבו עם המבנים התאיים ליצירת מבנים שלמים. המבנים שמרו על רשת האנדותל הקדם-וסקולרית שלהם המוצגת על ידי תיוג עם גורם פון וילברנד.

ניתן לראות תאי אפיתל כליה בירוק המסומן על ידי ציטוקרטיין-18. כדי לבדוק את הפונקציונליות הכלייתית במבחנה, המבנים הודגרו עם אלבומין עם תווית FITC. בעוד שנמצא אלבומין שיורי הרחק מקטעי רקמת הכליה המוטבעת, היו גם נקודות חמות בתאי האפיתל הצינוריים של הכליה.

נקודות חמות אלה הן אלבומין החוצה תוך לומינלית, אשר נחשבת כמייצגת קליטה חוזרת של אלבומין במבנה התאי של מקטע הכליה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד מקטעי כליה מכליות עכברים ליישומי הנדסת רקמות. לאחר השליטה, ניתן לבצע הליך זה תוך שעה עד שעה וחצי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כולל זריעת מבנים תאיים על מנת לענות על שאלות אחרות הנוגעות לייצור ואפיון מבנה הכליה. אל תשכח שעבודה עם מכשירים כירורגיים ובלוני חמצן בלחץ עלולה להיות מסוכנת ביותר. היזהר בעבודה עם חפצים חדים וזכור לעגן מיכלי חמצן לספסל מעבדה.