תפוקה גבוהה SiRNA ואיתור Chloropicrin ופציעות תאים אפיתל הקרנית מימן פלואוריד-Induced

סרטון זה מציג את השיטות שלנו לבדיקת siRNA בתפוקה גבוהה במודל תאי אפיתל בקרנית של פגיעה רעילה. עבודה זו חשובה, מכיוון שסינון siRNA בתפוקה גבוהה הוא שיטה חסכונית וחסכונית בזמן להבהרת מסלולים ומווסתים של התגובה התאית לחומרים רעילים. עבודה זו עשויה לעזור לקדם את ההבנה שלנו כיצד הקרנית מגיבה לעלבונות רעילים.

הכן תרחיף של תאי אפיתל קרנית במדיום מחומם מראש המכיל 0.5 מיקרוגרם למיליליטר הידרוקורטיזון בבקבוק בינוני חד פעמי. סובב את הבקבוק כדי לתלות את התאים באופן שווה, ושפך למאגר על קן השייקר המסלולי של מטפל נוזלים אוטומטי. שמור את מתלה התא על צלחת חימום של 37 מעלות במהלך תהליך ציפוי התא.

השתמש במטפל נוזלים אוטומטי כדי להוסיף תאים לצלחות בצפיפות של אלף תאים לבאר ב -70 מיקרוליטר מדיום לבאר על צלחת של 96 בארות. זרע מינימום של 14 צלחות של 96 בארות עם תאים לכל לוחית ספריית siRNA שיש ללמוד. הפעל את שייקר המסלול במהירות של 100 מחזורים לדקה באופן רציף במהלך תהליך הזריעה, והשתמש במהירות פיפטינג של 50 מיקרוליטר לשנייה לכל השלבים.

מערבבים את מתלה התאים באמצעות מטפל הנוזלים האוטומטי לפני זריעת הצלחת הראשונה. שאפו 140 מיקרוליטר מתרחיף התא, והוציאו 70 מיקרוליטר לכל באר של שתי צלחות תרבית תאים. חזור על הערבוב והחלוקה עד שכל הצלחות נזרעו בתאים.

מלא מחדש את מיכל תרחיף התאים לפי הצורך. לאחר זריעת הצלחות, הוציאו אותן מהמטפל בנוזלים ודגרו אותן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו אותם לאינקובטור תרבית תאים.

העריכו את צפיפות התאים של כל הלוחות בבוקר שלמחרת באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית, השוכנת בחממת תרבית התאים. אל תכלול במחקר לוחות שיש להם בארות פנימיות שאינן בין 15 אחוז ל -22 אחוז מתלכדות. העבירו את התאים 24 שעות לאחר הזריעה עם ארבעה פיקומולים לבאר siRNA ו-0.3 מיקרוליטר לבאר של מגיב טרנספקציה, כדלקמן.

רכוש לוחות ספריית siRNA מהספק, המוגדרים להכיל 80 מטרות siRNA לכל לוחית עם עמודות אחת ושתים עשרה שנותרו ריקות. הרכיבו מחדש את לוחית ספריית ה-siRNA עם מאגר siRNA בהתאם להוראות היצרן לריכוז סופי של שני פיקומולים למיקרוליטר עבור כל באר של siRNA. בצע את כל ההעברות באמצעות מטפל נוזלים אוטומטי ומהירות פיפטינג של 25 מיקרוליטר לשנייה לכל השלבים.

השתמש בתיבות טיפים מוגדרות מראש כדי לטפל רק בבארות שיעברו טרנספטציה. השתמש במחצית העליונה של לוחית הספרייה כדי להעביר סט של שש לוחות משוכפלים, המכונה סט הלוחות העליונים"השתמש במחצית התחתונה של לוחית הספרייה כדי להעביר קבוצה אחרת של שש לוחות העתק, המכונה סט הלוחות התחתונים"יחד, שתים עשרה הלוחות מהווים סט צלחות שלם, וכל לוחית תא מכילה את אותה קבוצת בקרות. בארות טרנספקט B2 עד B6 של כל הלוחות עם siRNA מאגר שלילי לאחר שכל ערכות הלוחות העליונות והתחתונות הועברו עם siRNA ספרייה.

כמו כן מעביר בארות B2 ל-B6 של שני לוחות נוספים שאינם מקבלים siRNA ספרייה עם siRNA מאגר שלילי. אלה ישמשו כבקרות שלא נחשפו. דגרו את כל לוחות התאים בחממת תרבית תאים למשך ארבע שעות לאחר הוספת תערובות טרנספקציה, וערבבו על ידי הקשה עדינה כל שעה.

השתמש במטפל נוזלים אוטומטי כדי לשטוף את הצלחות פעמיים עם מדיום מחומם מראש, מדולל אחד עד חמישה ב-PBS ומוזן מחדש ב-100 מיקרוליטר לכל מדיום מחומם מראש. השתמש במהירות פיפטינג של 50 מיקרוליטר לשנייה עבור כל השלבים. השתמש בבארות C2 עד C6 כבקרות שאינן מועברות.

שמור על בארות B7 עד B11 ו-C7 עד C11 ללא העברה, כדי לשמש כבקרות תרופות וכלי רכב לחשיפה לרעילים. 24 שעות לאחר ההעברה, השתמש במטפל נוזלים אוטומטי כדי להזין מחדש את הצלחות. השתמש במהירות פיפטינג של 50 מיקרוליטר לשנייה עבור כל השלבים.

שאפו 100 מיקרוליטר מכל באר, והשליכו אותם למאגר פסולת. האכילו מחדש כל באר ב-100 מיקרוליטר לכל באר H-Cort.medium מחומם מראש. רוקן את מאגר הפסולת לפי הצורך.

מלאו את המאגר במדיום לפי הצורך. יומיים לאחר הטרנספקציה ושעתיים לפני החשיפה, הכינו תמיסה של 62.5 מיקרו-מולרית של קרדמונין הבקרה החיובית ב-H-Cort. בינוני, ולהוסיף לשורה B של מאגר הדילול בן 8 השורות.

הכן תמיסה של 06.25 אחוז של DMSO ב-H-Cort. meduim, והוסף לשורה C של אותו מאגר. DMSO משמש כבקרת הרכב.

השתמש במטפל הנוזלים האוטומטי כדי להסיר 10 מיקרוליטר של מדיום מבארות B7 עד B11 ו-C7 עד C11 של כל לוחית תא, ולהשליך אותו לשורות G ו-H של המאגר. הקפד להשתמש בתיבות טיפים מוגדרות מראש כדי לטפל רק באותן בארות שיקבלו את הבקרות החיוביות והרכב, והשתמש במהירות פיפטינג של 50 מיקרוליטר לשנייה עבור כל השלבים. העבירו 10 מיקרוליטר מהבקרות החיוביות והרכב לבארות הללו, וערבבו שלוש פעמים.

החזר את לוחות התאים הללו לחממה. חזור על שלבים אלה עבור כל לוחות התאים הנוספים. בצע את כל פעולות החשיפה הכימית במכסה אדים כימי, לבישת כפפות ניטריל כפולות, מעיל מעבדה, מגני שרוול פוליאתילן חד פעמיים ומשקפי בטיחות.

לטהר קצות פיפטות ומאגרים שבאו במגע עם החומצה ההידרופלואורית, וכל חומצה הידרופלואורית נוזלית עם 2.5 אחוז סידן גלוקונאט לפני סילוקם בזרם הפסולת המסוכנת. עבור כל לוחית ספרייה הנחקרת, הכינו תמיסה בינונית של 0.0036 אחוז חומצה הידרופלואורית על ידי הוספת 288 מיקרוליטר של אחוז אחד של חומצה הידרופלואורית ל-80 מיליליטר של H-Cort מחומם מראש. בינוני בבקבוק 150 מיליליטר.

סובבו את הבקבוק ודגרו את החומצה ההידרופלואורית המדוללת באינקובטור של 37 מעלות במכסה המנוע הכימי למשך עשר דקות. הוסף את תמיסת המדיום של חומצה הידרופלואורית למאגר ריאגנטים על מחמם צלחת. בצע את החשיפה עם שני טכנאים העובדים במקביל.

בקש מהטכנאי מימין להסיר את מדיום תרבית התאים מלוח התא באמצעות פיפטר בן שנים-עשר ערוצים, ולאחר מכן להעביר את הצלחת לטכנאי משמאל. בקש מהטכנאי משמאל להוסיף 100 מיקרוליטר לבאר מתמיסת המדיום של החומצה ההידרופלואורית. חזור על תהליך זה עבור כל לוחות התאים שאמורים להיחשף לחומרים רעילים.

כמו כן, חזור על תהליך זה עבור לוחות בקרה לא חשופים, תוך שימוש במדיום טרי במקום בתמיסת החומצה ההידרופלואורית. מניחים את הצלחות בחממת מכסה אדים כימי למשך 20 דקות, ואז מחזירים אותן לחממת תרבית התאים. חזור על שלב הוספת הבקרה החיובית כפי שהוצג קודם לכן, לאחר שכל הצלחות נחשפו והוחזרו לחממת תרבית התאים.

אסוף את תרבית התאים והעריך את כדאיות התא באמצעות בדיקת MTT 24 שעות לאחר החשיפה. הכינו תמיסה של 0.5 מיליגרם למצע MTT מיליליטר ב- PBS המכיל 10 גרם לליטר גלוקוז, ומחממים ל -37 מעלות. הוסף את תמיסת המצע MTT למאגר על מטפל נוזלים אוטומטי.

השתמש במהירות פיפטינג של 50 מיקרוליטר לשנייה עבור כל השלבים. הגדר מראש תיבות טיפים כדי לטפל רק בבארות שיש לבדוק. השתמש במטפל הנוזלים האוטומטי כדי לשאוב 95 מיקרוליטר של מדיום מ-60 הבארות הפנימיות של לוחית התא, ולהפקיד 42.5 מיקרוליטר בכל אחת משתי לוחות אחסון של 384 בארות.

הוסף מיד 100 מיקרוליטר לבאר של תמיסת מצע MTT לצלחות התאים, ודגר אותם ב-37 מעלות בחממת תרבית תאים למשך שעה. אטום את לוחות האחסון של 384 הבארות, ואחסן אותם במינוס 80 לניתוח לאחר מכן. חזור על תהליך זה עבור כל ערכות הלוחות העליונות והתחתונות והפקדים הלא חשופים המשויכים.

מלאו מחדש את מאגר המצע MTT לפי הצורך. השתמש שוב בטיפים בין שכפולים אם תרצה, אך שטוף אותם בעת הוספת תמיסת מצע MTT ובעת מעבר בין ערכות צלחות. לאחר הדגירה של שעה, השתמש במטפל הנוזלים האוטומטי כדי להסיר את תמיסת מצע ה-MTT מ-60 הבארות הפנימיות של כל צלחת תרבית תאים, והחלף ב-100 מיקרוליטר לבאר של DMSO.

השתמש במהירות פיפטינג של 50 מיקרוליטר לשנייה עבור כל השלבים, והגדר מראש תיבות טיפים כדי לטפל רק באותן בארות שיש לבדוק. רוקן את מאגר הפסולת ומלא מחדש את מאגר ה-DMSO לפי הצורך. מנערים את הצלחות על שייקר צלחת למשך שלוש דקות.

מדוד ספיגה ב-570 ו-690 ננומטר, באמצעות ספקטרופוטומטר לוח. הפחיתו את ספיגת הרקע ב-690 ננומטר מהספיגה ב-570 ננומטר, וממוצע הערכים עבור כל קבוצת ביקורת על הלוח הלא חשוף. חשב את אחוז הכדאיות על ידי חלוקת ערכי הספיגה עבור כל מטרה בערך הספיגה הממוצע של הפקדים שלא נחשפו.

השתמש במאגר השלילי הממוצע שלא נחשף כדי לחשב את אחוז הכדאיות של התאים עבור כל היעדים. מדוד את ריכוז ה-IL-8 בסופרנטנטים של תרבית תאים באמצעות בדיקה מבוססת חרוזים ללא כביסה, על פי הוראות היצרן. צור פריסת לוחית בדיקה כדי להתאים לדוגמאות ותקנים.

מוציאים את צלחות האחסון של 384 בארות מהמקפיא מינוס 80, ומפשירים בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה קצרה את הצלחות כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הבארות. הוסף את חרוזי המקבל נגד IL-8 ונוגדנים ביוטיניליים לצלחת אחסון שחורה של 384 בארות.

הוסף את תערובת החרוזים-נוגדנים לבארות המיועדות לשימוש לדגימות ועקומה סטנדרטית, בהתאם לפריסת לוחית הבדיקה. להרכיב מחדש את התקן במדיום המכיל 354 נתרן כלורי מיקרומולר. בצע דילולים סדרתיים כפולים של העקומה הסטנדרטית, והוסף משולש לפלטת אחסון שחורה אחרת של 384 בארות.

השתמש במטפל נוזלים אוטומטי כדי לבצע את הבדיקה. השתמש בתיבות טיפים מוגדרות מראש כדי לטפל בבארות בהתאם לפריסת לוחית הבדיקה. השתמש במהירות פיפטינג של 50 מיקרוליטר לשנייה עבור כל השלבים.

העבירו 8 מיקרוליטר מתערובת החרוזים-נוגדנים המקבלים לצלחות בדיקת באר רדודות לבנות של 384 בארות. הוסף את תערובת החרוזים-נוגדנים לבארות המיועדות לשימוש לדגימות ועקומה סטנדרטית בהתאם לפריסת לוחית הבדיקה. לאחר מכן, העבר את העקומה הסטנדרטית לבארות המתאימות על לוחות בדיקת הבאר הרדודים.

לאחר מכן, הכינו תמיסת נתרן כלורי 3.54 מולרית במאגר רדוד. התאם את ריכוז המלח של הדגימות כך שיתאים לזה של העקומה הסטנדרטית על ידי העברת 4.5 מיקרוליטר של תמיסת הנתרן הכלורי לדגימות בלוחות האחסון השחורים של 384 בארות. מערבבים את הדגימות שלוש פעמים באמצעות נפח תערובת של 30 מיקרוליטר, ולאחר מכן מעבירים שני מיקרוליטר מהדגימות ללוחות הבדיקה הלבנים הרדודים בהתאם לפריסת לוחית הבדיקה.

דגירה למשך שעה בחושך בטמפרטורת החדר. הוסף חרוזים משניים לצלחת אחסון שחורה של 384 בארות. הוסף את החרוזים לבארות המיועדות לשימוש לדגימות ועקומה סטנדרטית בהתאם לפריסת לוחית הבדיקה.

העבר 10 מיקרוליטר של החרוזים המשניים לבארות של לוחית בדיקת הבאר הרדודה הלבנה בת 384 בארות שתקבל עקומה סטנדרטית או דגימות בהתאם לפריסת לוחית הבדיקה. שוטפים את הקצוות בין כל צלחת. דגירה של שעה נוספת בחושך בטמפרטורת החדר.

אטום את לוחות הבדיקה עם אטמי צלחת שקופים, וסרוק באמצעות קורא צלחות התואם לבדיקה מבוססת חרוזים. השתמש במרחק של 0.2 מילימטר בין הצלחת לגלאי, זמן עירור של 180 אלפיות השנייה לסריקה וזמן מדידה של 550 אלפיות השנייה. ייבא את הנתונים הגולמיים ממבחני IL-8 לגיליון אלקטרוני.

השתמש בהתאמת עקומה אוטומטית עבור העקומה הסטנדרטית של מבחני IL-8, ולאחר מכן המר את הנתונים הגולמיים לפיקוגרמות למיליליטר עבור כל דגימה. חשב את הממוצע של ששת השכפולים עבור כל יעד. לאחר מכן, חשב את ערכי ה-SSMD וקפל את השינוי ביחס לפקדים השליליים החשופים.

הצג את הנתונים בתרשים פנס כפול, המציג את שינוי הקיפול לאורך ציר ה-x ו-SSMD לאורך ציר ה-y, עבור כל מטרה. לסיכום, פיתחנו שיטות ותנאי תרבית המתאימים למחקר סינון תפוקה גבוהה של פגיעה בעיניים על ידי חומרים רעילים. הוכחנו את התועלת של שיטות אלה על ידי השלמת המסך הראשוני של ספריית siRNA במודל של פגיעה בחומצה הידרופלואורית.

מערכי נתונים גנומיים בעלי תפוקה גבוהה יכולים לתרום רבות להבנת התפקיד שגנים ספציפיים ממלאים בפציעה או במחלה, מה שיכול לעזור להתמקד בצורה יעילה יותר במחקרי המשך במבחנה או in vivo.