Name: תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: למד הדמיה חיה של הפרדת כרומוזומים במיטוזה באמצעות Histone2B-GFP BacMam 2.0 ומיקרוסקופיית קונפוקלית דיסק מסתובבת. שיטה זו מאפשרת חקר השפעות של שינויים גנטיים וטיפול תרופתי על התנהגות הכרומוזומים בתאי פיברובלסט עובריים של עכברים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות Hung גואו-Chiuan ד ר ד ר Bharatkumar ג'ושי להערות יקר זה לשפר את כתב היד.

כל הניסויים שנערכו במחקרים אלה בוצעו על פי פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש במתקן המחקר והתרופות האמריקני (FDA) ואוכל.
1. בידוד והתרבות של העכבר מתחלקים Fibroblasts (MEFs)
<ol><li>לבודד את העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) זן PP2A-B56γ-עכבר, הארנבונים מאותה פראי סוג ב פרוטוקול סטנדרטי 7,8,9.</li>
	<li>ExpandMEFs עבור 3 קטעים, להקפיא ולאחסן עד לצורך ניסויים 8.</li>
</ol>2. culturing Mefs 2-ובכן תאיים כיסוי זכוכית עבור Live הדמיה
<ol><li>הכנת 500 מ"ל של המדיה צמיחה MEF המכילה בינוני נשר שונה של Dulbecco (DMEM/F12) עם 10% סרום שור עוברית (FBS), 1 X פניצילין/סטרפטומיצין אנטיביוטיקה, -גלוטמין (200 מ מ) ו- 1 X חומצות אמינו שאינן הכרחיות (NEAA) בבקבוק 500-mL מדיה.</li>
	<li>הפשרת צלוחיות של MEFs קפוא מסוג הפרוע, PP2A-B56γ-עכברים-מעבר 3 באמבט מים מראש ומחוממת ב 37 º C.</li>
	<li>להעביר MEFs המופשרים 15-mL צינורות ולהוסיף לאט לאט dropwise 20 מ"ל של מדיה DMEM/F12 הצינורות 15-mL באמצעות פיפטה של 10-mL.</li>
	<li>העברת MEFs יחד עם 20 מ של התקשורת צמיחה DMEM/F12 T75 מבחנות ולהרחיב אותם עד התאים הם 70% confluent. Confluency מוערך באמצעות מיקרוסקופ הופכי ב 4 x או 10 x הגדלה.</li>
	<li>וביופסיה מדיום הגידול באמצעות מרעה זכוכית פיפטה המחובר למערכת ואקום בשכונה, להוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין/EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להוסיף 3 מ"ל של מדיום הגידול DMEM/F12 כדי לעצור את התגובה.</li>
	<li>Centrifuge התאים במהירות נמוכה-(x 300 גר') עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע והשהה מחדש בגדר תא ב 1 מ"ל של מדיום הגידול DMEM/F12 להתחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.</li>
	<li>ספירת תאים באמצעות שיטת מניעה כחול trypan או אחרים תאים מתאים ספירת השיטה 8.</li>
	<li>זרע כ 20,000 MEFs/טוב בכוס 2-ובכן chambered כיסוי. להוסיף 200 µL/טוב DMEM/F12 מדיום הגידול ולאפשר לתאים לצרף על-ידי המקננת אותם בן לילה-CO 37 ° C ו- 5%2.</li>
</ol>3. סינכרון
<ol><li>סינכרון MEFs בשלב G0/G1 מאת המקננת בתאים DMEM/F12 צמיחה המדיה המכילה 0.1% FBS במשך 24 שעות ביממה, כדי לקבל מספר מרבי של תאים בשלב G0/G1. הערה: למרות הרעב סרום שימשה כשיטה של העדפה, שיטות שונות ניתן בהתאם mitotic השלב שבו תאים יש צורך להיות נעצר 10.</li>
</ol>4. תיוג
<ol><li>להכין מלאי תמיסת nocodazole ב דימתיל סולפוקסיד 1.5 mg/mL. Nocodazole מעצרים תאים בשלב G2/M על ידי עיכוב היווצרות microtubule 10.</li>
	<li>שלושה ימים פוסט סינכרון, להוסיף 200 200 ng/mL nocodazole µL של מדיום הגידול (עם 10% FCS), ו- CL-HB ריג'נט (BacMam 2B-GFP-היסטון 2.0).</li>
	<li>לחשב ההנהלה CL-HB חלקיקים לכל תא (PPC) להוסיף תאים כדלקמן: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg"> איפה מספר התאים המספר הכולל המשוער של תאים בזמנו של תיוג, PPC הוא מספר החלקיקים לכל תא, 1 × 10-8 מספר החלקיקים לכל מיליליטר הכימית. לדוגמה, כדי תווית 20,000 תאים עם PPC של 30 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg"> הערה: CL-HB ריג'נט עובד טוב עם רוב סוגי תאים בין 10 ל-50 PPC. עם זאת, 30 PPC עבד בצורה הטובה ביותר במחקר זה.</li>
	<li>תקופת דגירה MEFs של 18 h-CO 37 ° C ו-5%2. הערה: עבור הניסוי הנוכחי, ויזואליזציה של הכרומוזומים בתאים mitotic בריחה במחסום הרכבה פלך אירעה 18 h לאחר מחזור התא מעצר עם nocodazole.</li>
</ol>5. ויזואליזציה של משתרך כרומוזומים
<ol><li>דמיינו העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) באמצעות מערכת דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי מצוידים עם חדר סביבתיים הטבילה שמן, 63 x עדשה אובייקטיבי.<ol>
<li>השתמש עירור גל של 488 ננומטר, פליטה גל 450 nm עבור ייבוא תמונות של ערוץ ה-GFP.</li>
		<li>להשתמש במערכת מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם היכולת של שלבי סריקה ממונע, Z-Piezo מוסיף, העליונה שלב הדגירה ושחזור פלורסצנטיות ישיר לאחר צילום הלבנה על טכניקה זו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יום אחד לפני הדמיה, להפוך על כוח סביבתי קאמרית, לחמם את החדר כולו ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>להפעיל כוח על דוכן מיקרוסקופ, מצלמה, ספינינג דיסק יחידה, המאייר, ללייזר, המחשב ו הבמה ממונע.</li>
	<li>. תן למערכת לחמם 3 דקות; התחל את לייזר ארגון על-ידי הפעלת מפתח ההצתה. מתג הבורר דו-מצביים ללייזר ממצב "המתנה" "לייזר לרוץ".</li>
	<li>השקת התוכנה רכישת ועיבוד נתונים.</li>
	<li>ליזום הבקר2 CO עבור החממה העליון שלב ולהגדיר את ריכוז CO2 ב-5%. זה חייב להתבצע לפני תחילת הדמיה.</li>
	<li>הסר הזכוכית המכסה chambered החממה ואת המקום על הבמה עבור פריט חזותי. דמיינו תאים באמצעות עדשת המטרה 63 x טבילה (NA1.4) שמן.</li>
	<li>הצג מבעד לעדשות עינית, למקד את התמונה ולזהות תא בשלב מעטפת הגרעין התמוטטות (NEBD).</li>
	<li>ליזום המתאים לייזר (488 ננומטר לייזר ארגון לדמיין Histone2B-GFP).</li>
	<li>לפתוח חלון שליטה רכישה ולהגדיר זמן החשיפה לערוץ ה-GFP. לזהות תא הנמצא NEBD.<ol>
<li>באופן ידני לקבוע העליון תא היעד ואת התחתון במישור המוקד והזן את xyz אופטי חלוקתה הגדרות.</li>
		<li>במשך 20 דקות; אם התא לא ממשיך דרך חלוקת התא, להפסיק ייבוא תמונות לאחר 20 דקות ולהמשיך הלאה לתא הבא שנמצא NEBD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כ 1 h בכל תא יש צורך התמונה לקרטע הכרומוזומים במהלך מיטוזה בתאים PP2A-B56γ-ברח מן השק. כדי לקבל נתונים עבור סרט, לצלם תמונות כל 3 דקות. הערה: פראי סוג התאים לעצור, לא התקדמות העבר NEBD כאשר מטופלים עם nocodazole.</li>
	<li>שמירת תמונות בתבנית קובץ צבי לצורך ניתוח נוסף.</li>
</ol>6. תמונה עיבוד וניתוח
הערה: לבצע עיבוד תמונה תלת-ממדית וניתוח באמצעות תוכנה זמינים כגון Axiovision גירסה 4.8.2 או Imaris גירסה 8.2. במחקר זה, ImageJ התוכנה היה בשימוש.
<ol><li>פתח את רצף תמונות. אם התמונות הן כבר בתבנית מחסנית, המשך לשלב הבא. אם לא, לשלב כל תמונות רלוונטיות באמצעות מחסנית ' תמונה &gt; ערימות &gt; תמונות למחסנית ' בשורת התפריטים.</li>
	<li>לבצע כיוונונים כנדרש בהירות/חדות, רמות.</li>
	<li>כדי להוסיף חותמת זמן הסרט:<ol>
<li>עבור אל ' תמונה &gt; ערימות &gt; תווית. ' בשורת התפריטים.</li>
		<li>בחר תבנית המתאימה את הערך ההתחלתי של הזמן, מרווח הזמן בין כל תמונה.</li>
		<li>סמן את התיבה 'תצוגה מקדימה' והתאם הגדרות מיקום ותבנית. לחץ על 'אישור' כדי להחיל חותמת הזמן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להוסיף פס סולם לסרט:<ol>
<li>להגדיר את התמונה דרוג תחת ' נתח &gt; קבע קנה מידה ' בשורת התפריטים.</li>
		<li>בשדה 'מרחק בפיקסלים', הזן מספר הפיקסלים שבו המרחק ידוע ולאחר בשדה 'מרחק ידוע' הזן את המרחק. הגדר את יחידת הנכון של אורך על המרחק, למשלמיקרומטר לחץ על 'אישור' כדי להחיל את קנה המידה על הערימה.</li>
		<li>עבור אל ' נתח &gt; כלים &gt; סולם והבעת ' כדי להוסיף סרגל קנה מידה. להגדיר את הגודל של הבר כמו 'רוחב מיקרומטר', והתאם את הנותרים אפשרויות בהתאם לצורך עיצוב. סמן את התיבה 'תווית כל הפרוסות' כדי להוסיף את סרגל קנה מידה הערימה כולה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תצוגה מקדימה של הסרט על ידי לחיצה על כפתור play משולשים בתחתית לקצה של חלון תמונת הימני. להתאים את קצב המסגרת באמצעות ' תמונה &gt; ערימות &gt; אנימציה &gt; אפשרויות הנפשה בשורת התפריטים.</li>
	<li>ייצוא קובץ הסרט על-ידי בחירת ' קובץ &gt; שמירה בשם &gt; אבי. ' ובחר את קצב המסגרות ואת הדחיסה.</li>
	<li>לחץ על 'אישור' כדי לבחור השמירה שם קובץ ומיקום. לחץ על 'שמור' כדי לשמור את קובץ הסרט.</li>
</ol>

<ol><li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+CIN%3A+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li>
<li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+issues%3A+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li>
<li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li>
<li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+and+cancer%3A+cutting+through+the+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li>
<li>Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+and+implication+of+genome+instability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The detection and implication of genome instability in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).</li>
<li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+phosphatase+2A+B56%CE%B3+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854(2012).</li>
<li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP2A-B56%CE%B3+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
<li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362(2014).</li>
<li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26904940">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li>
<li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+%28hPrm1%29+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li>
<li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine%3A+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

מחזור התא שליטה מחסומים להבטיח הפרדה בין כרומוזום מדויק למנוע אנאפלואידיה ותא טרנספורמציה 1,2,3. במחקר הנוכחי, מצאנו את איון של PP2A-B56γ, גרמו מחסום הרכבה פלך נחלש. הדמיה חיה תא אפשר לנו להתבונן כרומוזומלית סגרגציה שגויה במהלך מיטוזה ב PP2A-B56γ MEFs שטופלו nocodazole 9.
פרוטוקול זה מנצל תווית Histone2B-GFP שנוצר באמצעות טכנולוגיה BacMam 2.0 הכרומוזומים תווית עבור הדמיה תא חי....

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים שיטה נוחה להמחיש סגרגציה כרומוזומלית והתקדמות mitotic במהלך מחזור התא בהעכבר מתחלקים fibroblasts באמצעות היסטון 2B-GFP, BacMam 2.0 תיוג והדמיה תא חי.
מחזור התא שליטה מחסומים לפקח על כרומוזום סגרגציה, יש תפקיד חשוב בשמירה על שלמות גנטי של התא 1,2,3. הצטברות של כרומוזומים אי הפרדה יכול להוביל aneuploidy, אשר מהווה סימן היכר של גידולים מוצקים ביותר 4. לפיכך, זיהוי מפגרות כרומוזומים יכול לשמש כשיטה ללמוד יציבות כרומוזומלית.
Fluorescently שכותרתו חלבונים יכולים להיות בשימוש לדמיין חיים כרומוזום סגרגציה, כרומוזומלית מפגרות אבל הדור של מתויג mCherry או חלבון ויזת עבודה H2B-GFP מתויג דורש ידע משמעותי של ג'ין משלוח וביולוגיה מולקולרית 5. כאן נתאר את השימוש ריאגנט CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, להלן בשם ריג'נט CL-HB, למען הפשטות. ריאגנט הזה יכול לשמש מיד ומסלקת ובכך חששות לגבי וקטורית באיכות ויושרה. בנוסף, ריאגנט הזה אינו דורש את השימוש טיפולים מזיקים או שומנים וכימיקלים העמסה לצבוע. שלא כמו תוויות פלורסנט קונבנציונלי, ההנהלה CL-HB כתמים ללא תלות פונקציה (כלומר., קרומית אפשרית). ההנהלה CL-HB יכול להיות פשוט להוסיף את התאים, מודגרות ללילה עבור ביטוי חלבון. ההנהלה CL-HB לא לשכפל תאים בתרבית של, ניתן להשתמש בהגדרות מעבדה 1 (BSL) אבטחה ברמה. בנוסף, ניתן להבחין תקנים ארעי זה לאחר לילה דגירה עד 5 ימים, מספיק זמן כדי לבצע ניתוחים הסלולר הדינמיים ביותר.
לחלופין, העיוותים כרומוזומלית יכול להילמד על ידי טכניקות שונות כגון cytometry זרימה, אימונוהיסטוכימיה או קרינה פלואורסצנטית באתרו הכלאה (דגים) 6. Cytometry זרימה ניתן ללמוד aneuploidy, אשר ניתן למדוד בהתבסס על תוכן ה-DNA, השלב של תאים במחזור התא. למרות cytometry זרימה יכול לשמש כדי למדוד aneuploidy, אינה מספקת מידע על סגרגציה שגויה כרומוזומלית. דגים וטכניקות אימונוהיסטוכימיה להשתמש הגששים פלורסנט כדי לאגד דנ א או כרומוזומים. ואילו טכניקות אלה מספקים תמונת המצב של אוכלוסיה של התאים, הם אינם מאפשרים תא חי הדמיה ובכך חסר מידע שהושג דרך ייתכן החזיית ציטוקינזה תאים מסוימים אחריו על פני תקופה של זמן.
פרוטוקול זה שימש ללמוד לקרטע כרומוזומים או סגרגציה שגויה כרומוזומלית ב nocodazole התייחסו העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) מבודד PP2A-B56γ-עכברים. בתוספת מעל היישום, פרוטוקול זה מספק כלי פשוט כדי לתייג והמחש כרומוזומלית הפרדה בין סוגי תאים שונים אשר יכול לשמש כדי ללמוד מחזור התא תקנה או בחוסר יציבות כרומוזומלית תאים סרטניים. בנוסף, זה יכול לשמש גם ללמוד יציבות כרומוזומלית נגרמת על ידי טיפולים תרופות שונות, או לחקור את ההשפעות של ג'ין מדהימה וכתוצאה מכך כרומוזומלית סגרגציה שגויה.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>גיבקו</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)</td><td>ג'יבקו</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>ג'יבקו</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו' s פוספט חוצץ</td><td>מלח Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>EMD Millipore</td><td>MX 1458-6</td><td></td></tr><tr><td>קופסאות אחסון בקבוקון קריוגני</td><td>Fisherbrand</td><td>10-500-28</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקונים קריוגניים</td><td>Corning/costar</td><td>431416</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות T75</td><td>Cellstar</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>2 זכוכית כיסוי תא היטב</td><td>Nunc</td><td>155380PK</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Cell Profiler</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Cellometer Vision Trio</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Cell Observer מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב</td><td>קרל זייס מיקרוסקופיה</td><td>Zeiss Cell Observer SD</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>Thermoscientific</td><td>280 סדרה</td><td></td></tr><tr><td>חממה</td><td>Sanyo פתרונות מסחריים</td><td>MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr> <tr><td>Class II ארון בטיחות ביולוגי</td><td>חברת Baker</td><td>SterilGard</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Axiovision</td><td>Zeiss</td><td>גרסה 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ</td><td>המכון הלאומי לבריאות</td><td>גרסה 1.51r</td><td></td></tr></tbody></table>

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

כרומוזומים חייב להיות אמין, בצורה אחידה הפרדה לתאי הבת במהלך חלוקת התא mitotic. נאמנות של סגרגציה כרומוזומלית נשלטת על ידי מנגנונים מרובים הכוללים את מחסום הרכבה פלך (שק). הקרום הוא חלק מערכת משוב מורכבים כי הוא אחראי למניעת התקדמות התא באמצעות מיטוזה אלא אם כל kinetochores כרומוזומלית יש מחובר ציר microtubules. לקרטע כרומוזומלית, כרומוזום נורמלית סגרגציה הוא מחוון של מחזור התא לקוי שליטה מחסומים והוא יכול לשמש כדי למדוד את יציבות גנומית של חלוקת תאים. הסרת הפיקוח של הקרום יכול לגרום הטרנספורמציה של תאים נורמליים לתא ממאיר דרך ההצטברות של שגיאות במהלך ההפרדה כרומוזומלית. יישום של השק ואת היווצרות קינטוכור מורכבים מוסדרים בחוזקה על ידי אינטראקציות בין kinases פוספטאז כגון 2A חלבון פוספטאז (PP2A). פרוטוקול זה מתאר תא חי הדמיה של משתרך כרומוזומים בתוך העכבר מתחלקים fibroblasts מבודד מן העכברים היה נוקאאוט של יחידת משנה התקינה PP2A-B56γ. שיטה זו גוברת על החסרונות של מחזור התא שליטה הדימות האחרות כגון cytometry זרימה או immunocytochemistry רק לספק תמונת מצב ציטוקינזה תא, במקום פריט חזותי ייתכן דינמי של כרומוזומים במהלך מיטוזה.

MEFs פראי סוג ו PP2A-B56γ-עכברים נזרע בכוס כיסוי תא 2-ובכן, מותר לצרף. יום 2, MEFs סונכרנו באמצעות 0.1% FBS במשך 24 שעות ביממה. יום 3, MEFs בתקשורת עם 200 ng/mL nocodazole ו 30 regentwere PPC CL-HB מודגרות עבור 18 h ב- 37° C ו- 5% CO2. יום 4, התאים היו עם תמונה באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב (איור 1). חיים תא הדמיה שימש כדי להמחיש את גורלו של תאים בודדים כפי שהם התקדם מ NEBD באמצעות מיטוזה (איור 2</stro...

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה ונוחה כדי לתייג והמחש בשידור חי הכרומוזומים בתאים mitotic באמצעות תווית 2.0 BacMam Histone2B-GFP ומערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסק מסתובב.

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לתייג ולדמיין כרומוזומים חיים בתאים מיטוטיים באמצעות תווית Histone 2B-GFP BacMam 2.0 ומערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לדמיין כרומוזומים מיטוטיים בתאים מתורבתים כדי לחקור את ההשפעות של שינויים גנטיים או טיפולים תרופתיים על הפרדת כרומוזומים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת שיטה קלה ונוחה לתיוג והדמיה של כרומוזומים חיים בתאים מיטוטיים.מי שידגים את הליך ההדמיה החיה יהיה ד"ר קזויו טקדה שמתחזק את מתקן הליבה של מיקרוסקופיה והדמיה בחטיבה למוצרים נגיפיים במרכז להערכה ומחקר ביולוגיים של ה-FDA. הפיברובלסטים העובריים של העכברים, או MEFs, המשמשים בניסוי זה, גדלים בזכוכית כיסוי בעלת שני תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בן לילה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. למחרת, סנכרן את ה-MEFs בשלב G0/G1 על ידי דגירה במדיום גידול DMEM/F12 המכיל 0.1% FBS.ביום התיוג, הכינו תמיסת מלאי של 1.5 מיליגרם למיליליטר של נוקודאזול ב-DMSO. שלב קריטי הוא לחשב את הכמות הנכונה של חלקיקי CL-HB לתאים כדי להשיג מספיק תיוג להדמיית כרומוזומים ללא רעילות לתאים. קבענו בעבר, על ידי ניסויי טיטרציה, ש-30 PPC עובד הכי טוב.הוסף ל-MEFs, 200 מיקרוליטר של מצע גידול עם 10% FCS, 200 ננוגרם למיליליטר של נוקודזול ומגיב CL-HB ב-30 חלקיקים לתאים. דגרו את ה-MEFs ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 18 שעות. הדמיה של ה-MEFs מתבצעת באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב המצוידת בתא סביבתי וטבילת שמן, עדשת אובייקטיבית 63X.יום אחד לפני ההדמיה, הפעל את תא הסביבה וחמם את החדר כולו ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הפעל את החשמל עבור מעמד המיקרוסקופ, המצלמה, יחידת הדיסק המסתובב, התאורה, לייזר הארגון, המחשב והבמה הממונעת. לאחר שנתנו למערכת להתחמם במשך שלוש דקות, הפעל את לייזר הארגון על ידי הפעלת מפתח ההצתה.העבר את מתג ההחלפה של לייזר הארגון ממצב המתנה להפעלת לייזר. הפעל את תוכנת רכישת הנתונים ועיבודם. הפעל את בקר ה-CO2 עבור החממה העליונה, והגדר את ריכוז ה-CO2 על 5%הסר את זכוכית הכיסוי התא מהחממה, הנח אותה על המיקרוסקופ stage ובחר את עדשת האובייקט של טבילת שמן 63X.התבונן דרך עדשות העיניים, מקד את התמונה וזהה תא בשלב של התמוטטות המעטפת הגרעינית, או NEBD. הפעל את לייזר הארגון של 488 ננומטר כדי לדמיין את היסטון 2B-GFP. פתח את חלון בקרת הרכישה והגדר את זמן החשיפה לערוץ GFP.זהה תא שנמצא ב- NEBD. לאחר מכן, קבע ידנית את מישור המוקד העליון והתחתון של התא, והזן את הגדרות החיתוך האופטי XYZ. התבונן בתא למשך 20 דקות.חשוב להיות מודעים לכך שמכיוון שלא כל התאים יעברו מיטוזה, יש לעקוב באופן פעיל אחר ההתקדמות המיטוטית. אם התא לא ממשיך בחלוקת התא לאחר 20 דקות, הפסק את רכישת התמונה ועבור לתא הבא שנמצא ב-NEBD. כדי לקבל נתונים עבור סרט, צלם תמונות כל שלוש דקות.נדרשת כשעה אחת לכל תא כדי לדמות כרומוזומים מפגרים במהלך המיטוזה בתאי גמא PP2A-B56 שנמלטו ממחסום הרכבת הציר. שמור תמונות בפורמט קובץ ZVI להמשך ניתוח. הדמיית תאים חיים שימשה כדי להמחיש את גורלם של תאים בודדים כשהם מתקדמים מ-NEBD דרך מיטוזה.לאחר הטיפול בנוקודאזול, כל 21 התאים הפראיים שנצפו נעצרו במטאפאזה. לעומת זאת, מתוך 21 תאים חסרי PP2A-B56-גמא שנצפו, 16 הצליחו לעבור מיטוזה לאחר טיפול בנוקודאזול. בנוסף, התגלתה הפרדה כרומוזומלית לא תקינה ב-13 מאותם MEFs.דוגמה לתא גמא PP2A-B56 שעובר הפרדה כרומוזומלית שגויה מוצגת בסרטון וידאו זה. לאחר השליטה, טכניקה זו תארך שלושה עד ארבעה ימים בהתאם לטיפול בתאים לפני פרוטוקול התיוג. חשוב לזכור שמדובר בטרנספקציה חולפת וניתן לזהות אותות רק עד חמישה ימים.ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לוויסות מחזור התא, חוסר יציבות גנומית ואיכות מוצרי הטיפול התאי. לאחר פיתוחה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור הדמיה חיה של כרומוזומים במגוון רחב של קווי תאים, כגון קווי תאים ראשוניים, תאי גזע, נוירונים ותאי T אימורטליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג ולדמיין בקלות כרומוזומים חיים בתאים מיטוטיים באמצעות תווית Histone 2B-GFP BacMam 2 ומערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

live-cell-imaging-of-chromosome-segregation-during-mitosis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לתמונה ולכמת את העיתוי mitotic של חיים יונקים התרבות תאים ורקמות לאחר transfection siRNA.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

מקור: שומאכר, ד., וסוגארד-אנדרסן, ל. הדמיית תאים חיים פלואורסצנטיים של מחזור התאים הצמחיים המלא של החיידק החברתי המתפתח באיטיות Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיית תאים חיים למעקב אחר מקורות כרומוזומים מסומנים פלואורסצנטית במהלך חלוקת תא חיידקים. הוא לוכד את דינמיקת הפרדת הכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה ופלואורסצנציה.

הדמיית טיים-לאפס של הפרדת כרומוזומים בחיידקים מסומנים פלואורסצנטית

מיטוזה העצבית היא פרמטר קריטי הנוירוגנזה. חלק גדול מההבנה של מיטוזה העצבית שלנו מבוסס על ניתוח של רקמה קבועה. הדמיה בשידור חי בפרוסות מוח עובריים היא טכניקה צדדי כדי להעריך מיטוזה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה בסביבה מבוקרת.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

אנו מציגים פרוטוקול לסינכרון תימידין כפול של תאים הלה ואחריו ניתוח באמצעות קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו היא המפתח להשגת מספר גדול של תאים, כי המשך באופן סינכרוני שלב S מיטוזה, המאפשר לימודים mitotic התפקידים של חלבונים רב תכליתי אשר גם בעלי פונקציות לאטמוספרה.

שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

הדמיה לחיות תאים מספק שפע של מידע על תאים בודדים או באוכלוסיות שלמות כי הוא בלתי ניתן להשגה על-ידי תא קבוע הדמיה לבד. כאן, מתוארים פרוטוקולי הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic.

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

חטיבות התא ניתן לדמיין בזמן אמת באמצעות חלבונים מתויגים פלואורוסקופים ומיקרוסקופ זמן לשגות. בעזרת הפרוטוקול המוצג כאן, המשתמשים יכולים לנתח את דינמיקת התזמון של החטיבה הסלולרית, הרכבת הmitotic צירים והפרדה בין כרומוזום ובידוד. פגמים באירועים אלה בעקבות הפרעות RNA (RNAi)-תיווך גנים הסתרה ניתן להעריך ולכמת.

שימוש ב- Drosophila ילה S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדינמיקה של היווצרות צירים והתקדמות mitotic. היישום שלנו של הדמיה זמן לפקיעה מאפשר למשתמש לזהות תאים בשלבים שונים של mitosis, לעקוב ולזהות פגמים mitotic, ולנתח את הדינמיקה הציר ואת הגורל mitotic cell בעת חשיפה לתרופות נגד mitotic.

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

מיקרוסקופיה בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר מיוזה בשמרים ניצנים. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשלבת סנכרון מחזור התא, מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ודלדול מותנה של חלבון מטרה כדי להדגים כיצד לחקור את תפקודו של חלבון מסוים במהלך הפרדת כרומוזומים מיוטיים.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

למד הדמיה חיה של הפרדת כרומוזומים במיטוזה באמצעות Histone2B-GFP BacMam 2.0 ומיקרוסקופיית קונפוקלית דיסק מסתובבת. שיטה זו מאפשרת חקר השפעות של שינויים גנטיים וטיפול תרופתי על התנהגות הכרומוזומים בתאי פיברובלסט עובריים של עכברים.

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

גלה סרטונים נוספים