שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא להדגים שיטת אספקה טבעית בעל פה. עבור dsRNAs ספציפיים לגנים, כדי לגרום להפרעות RNA in vivo ומזיקי חרקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כיצד להעביר ביומולקולות בתוך חרקים, להבהיר את ההשפעה של חומרי הדברה ביולוגיים מולקולריים מבוססי RNAi, ולשלוט בחרקים בסביבה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליישם העברה זו באמצעות חומצות גרעין, השתקת גנים בתיווך חומצות גרעין להאכלת מוהל צמחים כמו גם ללעיסת חרקים. אם כי השיטות כאן מדגימות אספקה של RNA דו-גדילי למזיקים המיפטרניים, כמו פשפש הסירחון החום, פשפש הארלקין ופסיליד הדרים אסייתי. ניתן ליישם אותם על חרקים אחרים.

כדי להתחיל את הפרוטוקול, בחר באג סירחון חום 4 מוקדם, או נימפות BMSB, שבקעו ממסת הביצים, והרעיבו אותם במשך 24 שעות לפני האכלת ה-dsRNA. לאחר מכן, בחרו שעועית ירוקה דקה ומאושרת כאורגנית ושטפו אותה בתמיסת נתרן היפוכלוריט 0.2% למשך חמש דקות. המשיכו עם שלוש שטיפות H2O מזוקקות כפולות, והניחו לפולים להתייבש באוויר.

לאחר שהם יבשים, חותכים את השעועית הירוקה מקצה הגביע לאורך כולל של 7.5 סנטימטרים בעזרת סכין גילוח נקי. טבלו את השעועית הירוקה השטופה והגזומה בצינור מיקרו-צנטריפוגה ללא מכסה, שני מיליליטר המכיל 300 מיקרוליטר של תמיסת בקרה. בצע דילולים של lac Z, JHAMT או VGDSRNAs מסונתזים במבחנה, על ידי דילול של 5 מיקרוגרם, או 20 מיקרוגרם, ו-300 מיקרוליטר של RNAs, מים נטולי DNA כדי להניב ריכוזים סופיים של 0.017 מיקרוגרם למיקרוליטר, או 0.067 מיקרוגרם למיקרוליטר בהתאמה.

טבלו את השעועית הירוקה השטופה והגזומה בצינור מיקרו-צנטריפוגה ללא מכסה, שני מיליליטר, המכיל 300 מיקרוליטר של תמיסת dsRNA. עטפו ואטמו את שולי צינורות המיקרו-צנטריפוגה, סוגרים את השעועית הטבולה כדי למנוע אידוי של תמיסת ה-dsRNA, וכדי למנוע מבעלי החיים להיכנס לצינור המיקרו-צנטריפוגה. מקם את הצינורות זקופים בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות, כדי לאפשר לתמיסת ה-dsRNA להיטען בכל השעועית הירוקה על ידי פעולה נימית.

הנח את הצינורות בכלי תרבית נקיים מפוליפרופילן, והניח 3 נימפות BMSB 4 Instar מורעבות בכלי התרבות. טפל בשלושה חרקים לכל כלי תרבות. כל אחד מהם מכיל שלוש שעועית ירוקה עם צבע מאכל ירוק, או תמיסת dsRNA.

שמור על החרקים ב-25 מעלות צלזיוס ו-72% לחות יחסית, מתחת ל-16 ליטר, 8D פוטופריוד בחממה. אפשרו לחרקים להאכיל את השעועית הירוקה הטבולה ונספגת ב-dsRNA במשך חמישה ימים, וחידשו אותם בתזונה טרייה של שעועית ירוקה שטופלה ב-dsRNA לאחר שלושה ימים. בחר צמחים או שתילים, ואל תשקה אותם יומיים-שלושה לפני השימוש, כדי לתת לאדמה להתייבש ללחה, אך לא יבשה לחלוטין.

בעזרת בקבוק ריסוס שנשאב ביד, מרחו 200 מיליליטר של תמיסת dsRNA על החופה התחתונה. דגמו את הגידול החדש מעצים שצמחו בעבר לאחר 25 עד 40 יום, על ידי איסוף כ-10 עלים מקצות ארבעה ענפים. חלץ את ה-RNA הכולל ונתח אותו על ידי RT-PCR ו-qPCR לנוכחות טריגר ה-dsRNA המיושם.

באופן דומה, יש לרסס באופן מקומי 10 מיליליטר של dsRNA לאזור התחתון של שתיל, או עלווה של עצים קטנים. בחרו צמחים או שתילים, ואל תשקו אותם יומיים-שלושה לפני השימוש, כדי לתת לאדמה להתייבש, ללח, אך לא להתייבש לחלוטין. לאחר מכן, הוסף ליטר אחד של תמיסת dsRNA לאדמה של עציצים גדולים.

הוסף ליטר מים לאחר שעה. מרחו 100 מיליליטר של תמיסת dsRNA על אדמה של עצים עציצים בגובה מטר אחד בקרקעות יבשות חלקית. אפשר לצמחים לקבל את תמיסת ה- dsRNA כטבילה באדמה, להשרות למשך 30 דקות.

לאחר מכן יש למרוח טיפול רגיל במים בלבד כדי לסייע בספיגה על ידי השורשים. בחר שתילי הדרים, צמחים חדשים או בני 3.5 שנים להזרקת dsRNA באמצעות ברז הגבעול, הידוע גם בשם שיטת הזרקות הגזע. עטפו את קצה הנחושת של כל מזרק ארבע עד שש פעמים ברצועה ברוחב 0.6 סנטימטר של סרט תקרה כדי למנוע דליפה ליד הקצה.

לאחר מכן, מלאו את מזרקי גזע העץ בשישה מיליליטר של תמיסת dsRNA מדוללת ב-DNA, מים ללא RNA. קדחו חורים בצמחי ההדר בעזרת מקדחה של 10 מיליליטר, והקפידו לא לחרוג משני סנטימטרים, או כמחצית מקוטר הגבעול. לאחר מכן, הזריקו את התמיסה לגזע העץ, והשאירו את המזרק בגזע למשך שש עד 10 שעות כדי לאפשר ספיגה של תמיסת ה-dsRNA.

תנו לחרקים להאכיל את הייחורים מעצים שטופלו 3, 10 ו-30 יום לאחר הטיפול. שופכים 30 גרם מהחימר הסופג לצינור חרוטי של 50 מיליליטר עד לסימן 35 מיליליטר. יוצקים 20 מיליליטר של תמיסת dsRNA מדוללת ב-DNA, מים ללא RNA לתוך הצינור כדי להרטיב את כל הסופג.

כסו את הצינור החרוטי, הטו את הצינור כדי לסייע בהוצאת אוויר, והניחו את הצינור זקוף, ותנו לו לעמוד במשך דקה עד שתיים בזמן שחלקיקי החימר סופגים את התמיסה. הוסף מספיק חימר ספוג dsRNA לתערובת האדמה כדי למלא סיר של ליטר אחד. מערבבים והופכים את האדמה ביד כדי לערבב היטב את החימר הספוג ב-dsRNA לתוך האדמה.

השתמש באדמה כדי לשתול מחדש שתילים שנבחרו לטיפול ב- dsRNA. השקה את האדמה ב -200 מיליליטר מים רגילים, ללא dsRNA, לאחר 30 דקות עד שעה. המשיכו עם 100 מיליליטר מים רגילים.

לאחר 24 שעות, הכניסו את הצמח ללוח זמנים השקיה רגיל. בדוק ארבעה עד שישה עלים של העציצים המטופלים עם סופגי חימר ו-dsRNA בכל חודש, לאחר הטיפול ב-dsRNA, על ידי איסוף העלים האפיקליים ביותר של צמיחת צמחים חדשים. QPCR של מקטעי שעועית ירוקה שקועים ב-dsRNA מסונתז במבחנה, ספציפי לבאג סירחון חום, או BMSB mRNA, הצביע על אינדוקציה מוצלחת של RNAi כאשר הביטוי של מטרות JHAMT ו-Vg הופחת משמעותית in vivo.

שיטת העברה זו יעילה גם על מזיק המיפטרני אחר, פשפש הארלקין. כפי שמעידה הפרשתם בצבע ירוק. לאחר צפייה בהדגמות חזותיות אלה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר RNA דו-גדילי לחרקים באמצעות בליעה דרך הפה להשראת חרקי RNAi in vivo.

ההתקדמות שנעשית בטכנולוגיית RNAi nucelotide ממשיכה להרחיב את יכולותיהם של חוקרים לווסת את רמות ה-RNA, ביטוי הגנים והחלבון במגוון רחב של אורגניזמים חיים. זה עובר מצמחים, לחרקים ולמיקרואורגניזמים הקשים ביותר. אז בעוד שעלות הייצור של RNA דו-גדילי ממשיכה לרדת, ושיטות האספקה והיציבות ממשיכות להשתפר, העתיד של טכנולוגיות RNAi ימשיך לשמש לפתרון בעיות מתעוררות ומורכבות.