Name: שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: למדו שיטות למסירת RNA דו-גדילי דרך רקמות צמחים להתערבות RNA בחרקים Hemipteran. שיטות אלה מאפשרות שתיקת גנים ספציפית ופיתוח ביופסטיצידים ממוקדים לחקלאות בת קיימא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים בתודה להכיר דונלד וובר, מייגן הרליהי (USDA, ארס Beltsville, MD) מתן BMSB על בסיס חצי פנסיון ניסויים ולשמירה על המושבות; מריה גונזאלס טי סלבדור עמ' לופז, (משרד החקלאות, ארס, בפורט פירס, פלורידה), ג'קי ל' מץ (אוניברסיטת פלורידה, בפורט פירס, פלורידה) תחזוקה המושבה, הכנת הדוגמא של ניתוחים.

1. BMSB לגידול
<ol><li>חרקים BMSB האחורי לפי תרגול מעבדה סטנדרטיים ו שתואר לעיל63.</li>
	<li>העלאת ACP (קמחית ד) חרקים הדרים מאכרופילה החממה (22 מעלות צלזיוס), אור טבעי. השתמש ACP למבוגרים, כ 5-7 ימים פוסט וגיחתו.</li>
</ol>2. מבחר של ג'ין אזורים, ב חוץ גופית סינתזה של dsRNA
<ol><li>בחר גנים ספציפיים כדי BMSB transcriptome שפורסמו בעבר פרופילי32.</li>
	<li>ודא האזורים של הריבית שנבחר משתנות בין 200 עד 500 בסיסים.</li>
	<li>לבצע תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) באמצעות התנאים המתוארים להלן כדי ליצור קטעים הקשורים עם הגן שנבחר עניין מ- DNA גנומי. ראה טבלה 1 oligonucleotides הגן הספציפי.<ol>
<li>תגובת ה-PCR: בשפופרת PCR 0.25 mL, לשלב 5 µL של 10 X מאגר ה-PCR, µL 4 של dNTP תערובת (2.5 מ מ כל אחד), 2 µL של תבנית ה-DNA (50 ng/µL), 2.5 µL כל של צבעי יסוד 1 ו-2 (10 מיקרומטר), µL 0.25 של ה-DNA פולימראז (U 5/µL) , ומים DNase/RNase חינם µL עד 50.</li>
		<li>תנאי ה-PCR: מחזור התגובה PCR כדי להגביר את האזור של הריבית ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ולאחריו מחזורים של 98 ° C עבור 10 s, 55 ° C ל 30 s, 72° C עבור 1 מינימלית Incubate התגובה ב-72 מעלות עבור נוספים 10 דקות Purify באמצעות תגובת ה-PCR ערכת טיהור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להגביר את השברים PCR שהושג נוסף עם גנים ספציפיים תחל תמר מוקף עם הרצף יזם T7 RNA פולימראז (5'-גה TTA אתא CGA CTC מעשה אתא GGG אגא-3') כפי שצוין קודם62.</li>
	<li>השתמש LacZ ג'ין כפקד שלילי (מעושה) עבור RNAi. הערה: LacZ הוא גן מקודד β-galactosidase מוגבר מן Escherichiacoli הדנ א הגנומי (צבעי יסוד בשימוש מוצגים בטבלה1).</li>
	<li>לבצע תמלול במבחנה להניב dsRNA כפי שתואר קודם62.</li>
	<li>להמיס resuspend של dsRNA וכתוצאה מכך מים חינם DNase/RNase µL 150, מודדים את הריכוז ו לאחסן ב- 80 ° C לשימוש עתידי.</li>
</ol>3. מסירת dsRNA שימוש שעועית ירוקה
<ol><li>בחר 4 מוקדםth לחלל BMSB נימפות בקעו מן הדבר ביצה בנפח גדול ולהרעיב את אותם עבור 24 שעןת לפני dsRNA האכלה.</li>
	<li>בחרו ודק מוסמך אורגני שעועית ירוקה (מצויה ל'), לשטוף עם 0.2% נתרן תת-כלורי פתרון עבור 5 דקות. הערה: שעועית ירוקה דקיקה נבחרו כך השעועית בקלות ניתן לאכלס את החצוצרות שלה microcentrifuge 2 מ"ל.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים עם ddH2O ויאפשר לאוויר יבש.</li>
	<li>חתוך את השעועית הירוקה מהקצה גביע כדי באורך כולל של 7.5 ס מ בעזרת סכין גילוח נקי.</li>
	<li>לטבול את השעועית הירוקה שטף, החתוך צינור microcentrifuge קאפ-פחות 2 מ"ל המכיל 300 µL של פתרון שליטה (1:10 לדילול צבע מאכל ירוק (מרכיבים: מים, פרופילן גליקול, Fd & C 5 צהובים, Fd & C כחול 1 ו Propylparaben כמו חומר משמר)).</li>
	<li>להפוך דילולים של ה במבחנה מסונתז dsRNAs LacZ, JHAMT או Vg המדללת µg 5 או 20 µg ב 300 µL של מים חינם RNase/DNase להניב ריכוזים הסופי של 0.017 µg/µL או µg 0.067/µL, בהתאמה.</li>
	<li>לטבול את השעועית הירוקה שטף, החתוך צינור microcentrifuge קאפ-פחות 2 מ"ל המכיל 300 µL של dsRNA פתרון (מתוך שלב 3.6).</li>
	<li>לעטוף, לאטום את הקצוות של הצינורות microcentrifuge תוחמת את השעועית שקוע כדי למנוע אידוי של הפתרון dsRNA וכדי למנוע את החיות מלהיכנס הצינור microcentrifuge.</li>
	<li>הצב הצינורות האלה בצורה זקופה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות לאפשר את הפתרון dsRNA ייטענו ברחבי שעועית ירוקה על ידי נימיות.</li>
	<li>מניחים צינורות אלה בכלי נקי תרבות (פוליפרופילן). שלוש נימפות BMSB לחללה 4 בכלי תרבות ברעב</li>
	<li>שלוש חיות שונים מתייחסים לכל תרבות כלי שכל אחד מהם מכיל שלושה שעועית ירוקה עם אוכל ירוק צביעה או dsRNA פתרון. לשמור על החרקים-לחות יחסית 25 ° C ו- 72%, תחת photoperiod L 16: 8D באינקובטור.</li>
	<li>לאפשר את החרקים ניזונים את השעועית הירוקה (שקוע ולא נספג עם dsRNA) במשך 5 ימים אך לחדש עם דיאטות טריים של dsRNA טיפול ירוק חרוזים לאחר 3 ימים.</li>
</ol>4. בזמן אמת כמותי (qPCR) ניתוח של ג'ין הביטוי הבא RNAi בתיווך מצרי להחרשת ב- BMSB
<ol><li>למדוד את השפעת RNAi על רמות הביטוי תורגם על ידי qPCR.</li>
	<li>לבודד את הרנ א הכולל מהחיות dsRNA מטופלים ולסינתזה של cDNA62.</li>
	<li>תוכנית ההתקנה את התגובות qPCR באמצעות מערכת ה-PCR בזמן אמת, את תחל המפורטים בטבלה1. להשתמש בתנאי רכיבה על אופניים qPCR הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ואחריו 40 מחזורי 95 ° C 15 s, 60 ° C עבור 1 דקות, ביחד עם שלב דיסוציאציה כולל 95 ° C 15 s, 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, 95 ° C 15 s , ו- 60 ° C 15 s.</li>
	<li>לקבוע את הסטנדרטים qPCR: להשתמש דילול טורי cDNA שהוכנו RNA הכולל מבודד מן חיה נורמלית כתקן הפניה עבור כימות.</li>
	<li>להשתמש BMSB 18s RNA כמו תקן פנימי לתיקון על ההבדלים RNA התאוששות הרקמות32.</li>
</ol>5. בריסוס ספריי ביישום עצי הדר בעציץ גדול ושתילים
הערה: צמחים זנים הדרים citrange 'Carrizo' (הדר סיננסיס XPoncirus trifoliata, פיגמיים), היו בהשתתפות של החממה תחת אור טבעי וטמפרטורה, גדלו במיכלים 1.2 L. הצמחים היו לסילוק כל הזמן כדי לקדם את הצמיחה של נבטים בריסוס, שנקרא 'יישור'. ACP מעדיף להאכיל וגם ההטלה על גידול חדש של הדר64.
<ol><li>בחר צמחים או שתילים, לא המים אותם במשך 2-3 ימים לפני השימוש לתת הקרקע להתייבש לחים אך לא יבש לחלוטין.</li>
	<li>בעזרת בקבוק ריסוס משאבת יד להחיל 200 מ של dsRNA פתרון (0.5 mg/mL) על החופה התחתון (איור 4A). הערה: להכין לעיל הזכיר פתרונות dsRNA DNase/RNase מים חינם.</li>
	<li>פוסט-לרסס היישום, לאפשר את הפתרון dsRNA יישומית להיקלט לחלוטין על ידי העלים. הערה: עצי הדר נספג dsRNA יישומית ולאחר מכן עלים או צמיחה חדש או ענפים שכוסו לקראת יישום, חולצו; dsRNA לזיהוי באמצעות qPCR, הראה תנועה מערכתית לתוך העלים החופה העליונה עץ ב- 3-4 h-44,-45,-46.</li>
	<li>לטעום את הצמיחה החדשה מעצי עקף בעבר לאחר 25-40 ימים על ידי איסוף כ 10 יוצא מן הקצוות של ארבעה סניפים. לחלץ את הרנ א הכולל ולנתח אותם על ידי שעתוק במהופך PCR (RT-PCR) qPCR לנוכחות של ההדק dsRNA שהוחלו באמצעות תחל את המפורטים בטבלה 1, שתואר קודם לכן בשיטות46. הערה: המדגם אוסף הכולל בידוד ה-RNA, RT-PCR, qPCR בוצעו כפי שתואר לעיל46.</li>
	<li>באופן דומה, topically תרסיס 10 מ"ל dsRNA באזור התחתון של שתיל או עץ בעציץ קטן העלווה. הערה: חרקים Hemipteran (ACP ו GWSS) כנתינתן גישה האכלה בדרך כלל 24 שעות ביממה, פוסט טיפולים על צמיחה חדש (עלים) אשר לא מחשיפה ישירות, או שגדל שבועות מאוחר יותר, או צמחים שלמים. זה מיוצר חרקים אשר חיובית שנבדקו עבור dsRNA ב 3, 6 ו- 10 ימים, פוסט האכלה.</li>
</ol>6. אדמה/שורש היישום הירטבות בגדולים או קטנים בעציצים שתילים ועצי הדרים
<ol><li>בחר צמחים או שתילים ומים לא אותם במשך 2-3 ימים לפני השימוש לתת הקרקע להתייבש כדי לח אך לא יבש לחלוטין (זה יוצר המרחב האווירי להחזיק את הפתרון נוזלי כדי להחיל).</li>
	<li>להוסיף 1 ליטר של dsRNA פתרון (0.2 מ"ג/מ"ל) אדמת עציצים גדולים ביותר (כ- 2.5 מטר) ולהוסיף 1 ליטר של מים (מסרק) לאחר 1 h.</li>
	<li>החל 100 מ של dsRNA פתרון (1.33 mg/mL) אדמת בגובה 1 מ' בעציצים עצים בקרקעות חלקית יבש.</li>
	<li>עבור שתילים קטנים, להחיל 10 מ"ל של dsRNA פתרון (1 מ"ג/מ"ל) אדמות הקונוסים או על שורשי חשופות (איור 4B, C).</li>
	<li>לאפשר את הצמחים מקבלים את הפתרון dsRNA מורחים על אדמת הירטבות להשרות למשך 30 דקות. לאחר מכן להחיל טיפול רק מים רגילים כדי לסייע הקליטה על-ידי שורשים (20 מ"ל צמחים במיכלים צהוב), או 100 מ ל, אם סירים צמח גדולים > 1 ליטר. הערה: dsRNA למריחה העלווה הביא זיהוי לכל היותר דיסטלי קצות ענפים בתוך h 3-6 טיפולים פוסט, מציג מערכתית תנועה דרך העצים. סניפים צמיחה חדשים נבחנה חיובית עבור dsRNA טיפולים פוסט 60-90 יום. ייחורים ניתנים לג'וקים (ACP ו- GWSS) dsRNA האכלה bioassay44.</li>
</ol>7. גזע ברז (הזרקת גזע עץ) יישום גדול עצי הדר בעציץ ושתילים
<ol><li>בחר שתילי הדר, חדש, או כ- 3.5 שנים צמחים ישנים על הזרקת dsRNA באמצעות הגזע הקש על השיטה (המטען זריקות).</li>
	<li>קודחים חורים הצמחים הדרים באמצעות תרגיל ו- 10 מ"מ מקדחה, מטפל לא יעלה על 2 ס מ, או כחצי הקוטר של הגבעול.</li>
	<li>לעטוף את קצה נחושת של מזרק כל 4 - 6 פעמים עם רצועה רחבה 0.6 ס"מ (¼ אינץ ') של איטום הסרט כדי למנוע דליפה ליד הקצה.</li>
	<li>למלא את מזרקי גזע עץ עם 6 מ ל (1.7 מ"ג/מ"ל) של פתרון dsRNA מדולל במים חינם DNase/RNase (מסומן בתור הפתרון צבעוניות).</li>
	<li>להזריק את הפתרון לתוך תא המטען של העץ ולהשאיר את מזרק בתא המטען עבור 6-10 h לאפשר קליטה של הפתרון dsRNA. לאפשר את החרקים ניזונים גזרי מעצי שטופלו ב 3, 10, ו- 30 ימים לאחר הטיפול. הערה: dsRNA מוזרק בשיטת הזרקת תא המטען שהתמידו בעצים לתקופה של 30-60 ימים41,42,44. אימות עבור RNAi בוצע על ידי qPCR באמצעות תחל את המפורטים בטבלה1.</li>
</ol>8. dsRNA אלייך בגרגרים קליי למסירה חרקים דרך האדמה
<ol><li>יוצקים את החומר סופג לתוך צינור חרוטי 50-mL לסימן 35 מ ל (כ 30 גרם של חומר סופג) ברכבת התחתית.</li>
	<li>שופכים 20 מ של dsRNA הפתרון מדולל במים חינם DNase/RNase (100 µg/mL) לתוך צינור כדי להרטיב את כל כושר ספיגה. קאפ הצינור חרוט, עצה צינור כדי לסייע בהסרת אוויר, קאפ ברכבת התחתית.</li>
	<li>מקם את הצינור זקוף, ומשהים 1-2 דקות על החלקיקים קליי לספוג את הפתרון.</li>
	<li>הוסף מספיק קליי ספוג dsRNA לתערובת האדמה כדי למלא סיר 1 ליטר.</li>
	<li>לערבב, להפוך את האדמה ביד כדי לערבב ביסודיות החימר ספוג dsRNA לתוך האדמה.</li>
	<li>השתמש האדמה הזו כדי repot שתילים שנבחרו לטיפול dsRNA.</li>
	<li>מים האדמה עם 200 מ של מים רגילים ללא dsRNA. לאחר 30 דקות כדי 1 h, פעל עם 100 מ של מים רגילים. לאחר 24 שעות, לשים את הצמח על לוח זמנים השקיה רגילה.</li>
	<li>מבחן 4-6 עלים של הצמחים בעציץ שטופלו עם חימר. סופגים, dsRNA לטיפול בכל פוסט חודש dsRNA על ידי איסוף העלים ביותר הפסגה של צימוח חדש. הערה: צמחים או ייחורים מצמחים אלו שטופלו נזרקים חרקים בכל עת לאחר 24 שעות פוסט הטיפול ולא הצליחו משלוח RNAi במשך שנה חרקים (נתונים שלא פורסמו).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

RNAi הוכיחה להיות כלי חשוב לחקור פונקציה ביולוגית ג'ין ורגולציה, עם פוטנציאל גדול כדי להיות מנוצל עבור ניהול של חרקים מזיקים19,68,69,70, 71. מבחר gene (s) המתאימות עבור להשתיק זן חרקים נתון, שיטת מסירת dsRNA(s) התואמת החרק ועיצוב הן בעל חשיבות עליונה. השיטה אופטימלית עבור אספקת dsRNA לתוך חרק להיקבע מדעית, יחד עם הבחירה המינון היחסי עבור משלוח, כמו שיטות מסוי...

חרקים hemipteran מהווים חלק המזיקים ביותר מבחינה כלכלית משמעותית של agriculturebecause יכולתם להשיג גידול האוכלוסייה מוגברות ולהפיץ מחלות בצמחים. BMSB, ח' האליס פלדה, הוא המזיק פולשני זה הוצג בטעות עם גילויו הראשון דיווחה בשנת 19961בחצי הכדור המערבי ב אלנטאון פנסילבניה מאסיה (סין, טייוואן, קוריאה ויפן). מאז השקתו, BMSB זוהה 43 מדינות, עם האוכלוסיות הגבוהה ביותר באוקיינוס האטלנטי (דה, MD, הרשות הפלסטינית, NJ, אמפר, ו WV), כמו גם בקנדה ובארצות אירופה, והוא מייצג איום פוטנציאלי על החקלאות2. כמו מטרד רב, BMSB יכול לעורר נזק למארחים כ 300 צמחים מוכרים, כולל ערך גבוה גידולים כגון תפוחים, ענבים, צמחי נוי, זריעה, סויה, תירס. נזק נגרם בעיקר בשל המצב של האכלה המכונה lacerate, סומק שם החיה מפלח את היבול מארח עם שלו stylet דמוי מחט כדי לקבל גישה אל החומרים המזינים רקמות וסקולריים2,3. BMSB הוא גם המזיק מקורה כמו הם עשויים למצוא מגורים באזורי מגורים כגון בתי ספר, בתים במהלך סתיו חורף2. כימיקלים, aeroallergens שפורסמו על ידי BMSB דווחו על תגובה אלרגית איליקיט עובדים חיתוך פירות. BMSB עשוי גם לתרום למחלות אלרגיות שמוביל ממגע, דלקת הלחמית דלקת אנשים רגישים4,5. עוד חרק hemipteran, ACP, קמחית ד Kuwayama (פשפשאים: Liviidae), היא מטרד רציני של פירות הדר, ומעבירה את החיידקים שיפה מוגבל (טיריה LiberibacterCandidatus ) גורמת Huanglongbing (HLB), הידוע יותר כמו מחלת ירוק הדר6,7. HLB דווחה לראשונה מסין הדרומית, התפשט 40 שונים אסיה אפריקה, האוקיאנית, דרום, צפון אמריקה מדינות7. ירוק הדר היא בעיה ברחבי העולם עם איום כלכלי הפסדים בשל אובדן פרי הדר; לפיכך, הנהלת ACP נחשב בעל חשיבות עליונה כדי למנוע ולשלוט HLB.
האמצעים לבקרה יעילה של מזיקים חרקים אלו בדרך כלל דורש היישום של הדברה כימית קצרות יחסית חי. הדברה כימית אסטרטגיות שליטה לעיתים קרובות חוסר אסטרטגיות ניהול הסביבה בטוח או פחתו הרגישות עקב עמידות לחומרי הדברה הדברה אוכלוסיות8,9. לפיכך, הדברה ביולוגית של מזיקים עם biopesticides מולקולרית היא חלופה אפשרית, אבל השימוש בה באופן גלובלי נשאר צנוע, מינים שונים של צירעת האפידיוס (למשל, Trisolcus ג'אפוניכאס) יכול להיות גם יעיל כמו ביולוגית טבעית פקדים. RNAi הוא פוטנציאל המתעוררים טכנולוגיות לניהול פולשנית חרקים מזיקים עם biopesticides מולקולרית10. RNAi היא מנגנון רגולטורי ג'ין תיאר היטב מקלה את יעילות posttranscriptional ג'ין להחרשת של אנדוגני כמו גם פולשים dsRNAs באופן ספציפי רצף, שמוביל בסופו של דבר בקרת גנים ב mRNA רמה11,12. בקצרה, כאשר dsRNA אקסוגני הוא הפנימו לתא שזה שהוא מעובד siRNAs על-ידי חבר superfamily RNase השלישי נוקלאז bidentate, נקרא לטעמים, אשר אבולוציונית כולו בתולעים זבובים, צמחים, פטריות, יונקים13, 14 , 15. אלה דופלקסים siRNA נוקלאוטיד 21-25 ואז לשחרר ממנו, משולב בתוך המתחם שתיקה RNA-induced (RISC) כמו מדריך RNAs. מתחם RISC-RNA זה מאפשר זיווג הבסיס של ווטסון-קריק ל משלימים היעד mRNA; זה מוביל בסופו של דבר המחשוף של החלבון Argonaute, תחום רב חלבון המכיל תחום RNase H דמוי, אשר מדרדרת את ה-mRNA המתאימים ומפחית תרגום החלבון, ובכך מוביל ג'ין posttranscriptional להשתיק16 , 17 , 18.
RNAi לניהול הדברה מחייבת המבוא של dsRNA ויוו להשתיק את הגן של עניין, ובכך הפעלת מסלול siRNA. שיטות שונות בהן השתמשו למסירה dsRNA חרקים, חרקים תאים לזירוז RNAi מערכתית כוללת האכלה10,19, טבילה20,21, microinjection22, נשאים כגון ליפוזומים 23, טכניקות אחרות24. RNAi היה הראשון הפגינו Caenorhabditis elegans להשתיק unc-22 גנים מאש מלו25, ואחריו נוקאאוט ביטוי של גנים עלי דרוזופילה melanogaster26. מחקרים ראשוניים פונקציונלי מנוצל microinjection כדי לספק dsRNA חרקים, כגון בומבוס22,27, Acyrthosiphon אפון28, במיוחד גרמנית29, האליס ה30, וחרקים lepidopteran (נבדקה על ידי. Terenius et al. 31). microinjection יש יתרון לספק מנה ומדויקים לאתר של עניין החרק. אמנם דקירות ספיגה כזה עשוי להפיק ביטוי של גנים הקשורים החיסון עקב טראומה32, לפיכך, שוללים את המעשיות שלה בפיתוח חקלאי biopesticides.
שיטה נוספת להעברת dsRNA ויוו היא למסמס, אשר כרוך בליעה או קליטה של dsRNA מאת השעיה של חיות או תאים בדרך כלל במדיום חוץ-תאית שמכילה dsRNA. השריית שימש לזירוז ביעילות RNAi בתאים תרביות רקמה דרוזופילה S2 לעכב במורד הנחל-של-Raf1 (DSOR1) מופעל mitogen חלבון קינאז קינאז (MAPKK)20, כמו גם ב- C. elegans להשתיק את pos-1 ג'ין33. אולם, dsRNA מועברת באמצעות השריית היא פחות יעילה לזירוז RNAi בהשוואה microinjection20. RNAi בתיווך מצרי להשתיק בחרק הלעיסה הוצג לראשונה rootworm תירס המערבי (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) על ידי הלוגיסטים של dsRNA לתוך דיאטה אגר מלאכותי10. דו חות קודמים יש סיכם שיטות לאספקת dsRNA חדורים בתזונה טבעית ספיציפית פרוקי רגליים34. שיטות משלוח אלה נקבעו עוד יותר יעיל וזהובה באמצעים מלאכותיים מסירה; כמו במקרה של זבובים (Glossina morsitans morsitans), שבו שווה נוקאאוט הגנים הקשורים החיסון נצפתה כאשר dsRNA נמסרה או באמצעות ארוחת דם או microinjected35. באופן דומה, משלוח של dsRNA דרך טיפות תפוח חום בהיר עש (Epiphyas postvittana)36, הזחלים diamondback עש (Plutella xylostella)37, כמו גם דבש דבורים38,39 המושרה RNAi יעיל. ניסויים RNAi היעילה ביותר hemipteran נעזרו הזרקה של dsRNA40 כי משלוח אוראלי של dsRNA בחרקים hemipteran מפרך מאז שצריכים להישלח דרך רקמות וסקולריים של הצמח הפונדקאי. RNAi יעיל נצפתה גם ACP, צלף מזוגגות-כנף leafhopper (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA נמסר דרך הדרים וגפנים שקלטה dsRNA לרקמות וסקולריים דרך השורש הירטבות, בריסוס תרסיסים, תא המטען זריקות או הספיגה על ידי ייחורים41,42,43,44,45,46. זה הביא גם הפטנט הראשון על dsRNA נגד ACP (2016, לנו 20170211082 A1). משלוח של siRNA ו dsRNA באמצעות נשאים כגון חלקיקים, ליפוזומים מקנה יציבות, העלאות dsRNA ונמסרו יעילות במהירות מתגלים23,47,48,49 ,50. מחלקה חדשה של כלי רכב מבוססי ננו-חלקיק משלוח עבור חומצות גרעין במבחנה , ויוו היה מסוכם במיוחד עבור יישומים טיפוליים שעשוי להקנות פוטנציאל עצום כמו צורת המשלוח המומנט51. חלקיקים כרכב משלוח עבור dsRNA אולי חסרונות כולל מסיסות, hydrophobicity או bioaccumulation מוגבלת52, אבל משלוח עזר פולימר מתאים עשוי לפצות את החסרונות. פיתוח ושימוש עצמי להעברת נוקלאוטידים מתגלים גם בשם 'antisense oligonucleotides', אשר בודד נטושים RNA/DNA דופלקסים46.
Vitellogenesis של פרוקי רגליים הוא מפתח תהליך השליטה רבייה ומוסדרת על ידי הורמון נעורים (JH) או ecdysone, אשר הם inducers מפתח של סינתזה Vg מאת שומן הגוף; Vg הוא נלקח בסופו של דבר על ידי oocyte לפתח דרך Vg-קולטן בתיווך מצרי-אנדוציטוזה-53. Vg היא קבוצה של polypeptides מסונתז extraovarially, שהיא הכרחית להתפתחות של החלבון חלמון ביצה גדולה,54,vitellin55, לכן חשוב רבייה, הזדקנות56. Vg הושתקה בהצלחה בנמטודות57 , כמו גם בדבורת הדבש (בומבוס) איפה RNAi בתיווך מצרי דלדול של Vg נצפתה מבוגרים וביצים22. RNAi בתיווך posttranscriptional ג'ין להחרשת Vg נבדקה מכיוון שהאמינה שדלדול שלה יוביל אפקט פנוטיפי הנצפה כגון מופחתת פוריות ופריון, פוטנציאל לסייע בשליטה BMSB. הגן JHAMT מקודד את S-adenosyl-L-מתיונין (SAM)-תלוי JH חומצה O-methyltransferase, מזרז את השלב הסופי של מסלול ביוסינטזה JH58. ב- farnesyl מסלול זה רב-תכליתי (FPP) ברצף כשהופכים מן farnesol, חומצה farnesoic, ואחריו ההמרה של מתיל farnesoate JH על-ידי JHAMT. מסלול זה כולו חרקים, פרוקי רגליים במיוחד עבור מטמורפוזה, תהליך התפתחותי מוסדר על ידי הורמונים-59,-60,-61. ב מורי דרב, ביטוי גנים JHAMT ואת הפעילות biosynthetic הוחלף נגזר JH allata הקורפוסים מראים כי הדיכוי תעתיק של הגן JHAMT הוא קריטי עבור הסיום של JH ביוסינטזה58. לכן, הגנים JHAMT ו- Vg נבחרו עבור דלדול ממוקד באמצעות RNAi. RNAi נבחנה גם עצי הדר על השליטה ACP ו- GWSS. עצי הדר שטופלו dsRNA דרך השורש הירטבות, הגבעול הקשה (המטען זריקות), כמו גם בריסוס תרסיסים עם dsRNAs נגד חרקים ארגינין ספציפי קינאז (אי קאי) תעתיקים42,44. יישום אקטואלי של dsRNA זוהה על החופה של עצי הדר, המציין משלוחים יעיל דרך הרקמות צמחים עילאיים, וכתוצאה תמותה מוגברת ACP, GWSS41,42, 45.
במחקר הנוכחי, זיהינו שיטת משלוח דיאטה טבעית עבור טיפולים כגון dsRNA. טכניקה זו פיתח שימש לאחר מכן להשתיק את JHAMT ואת Vg mRNA באמצעות גנים ספציפיים dsRNAs ב BMSB נימפות כמו הפגינו קודמות62. פרוטוקולים אלה-משלוח חדש המודגמות כאן מחליף קונבנציונאלי מערכות אספקה RNA המשתמשות תרסיסים אקטואלי או microinjections. ירקות, פירות, גזע הקשה אדמה קפה, ופעולות חימר. סופגים ב עשוי לשמש עבור משלוח של dsRNA, אשר הינה קריטית להמשך התפתחותו של המזיק biopesticide וניהול הפתוגן.

<table><tbody><tr><td>חרקי BMSB (H. halys)&nbsp;</td>חרקים מסוג <td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP (D. citri)&nbsp;</td>שעועית ירוקה אורגנית <td>של USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צמחי הדר</td> תמיסת <td>נתרן</td> היפוכלוריט של USDA <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צבע מאכל ירוק&nbsp;</td><td>מקורמיק ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי תרמו פורמה&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מג'נטה (תרבית)</td><td>סיגמא</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריימרים&nbsp;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקבוק ריסוס</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American Can Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות משלוח כפול גדילי rna אוראלי לזירוז התערבות rna שיפה וחרקים hemipteran צמח sap-האכלה

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

שיפה וצמח sap האכלה חרקים לפלוש השלמות של גידולי פירות כדי לאחזר חומרים מזינים, תוך כדי פגיעה גידולי מזון. חרקים hemipteran בחשבון מספר מזיקים מבחינה כלכלית משמעותית של צמחים לגרום נזק לצמח על ידי ניזון מהצינורות. החרק המסריח חום marmorated (BMSB), Halyomorpha האליס (פשפשים: Pentatomidae), את אסיה הדרים psyllid (ACP), Kuwayama Diaphorina קמחית (פשפשאים: Liviidae) מזיקים חרקים hemipteran הציג בצפון אמריקה, היכן הם הם של הדברה חקלאיים פולשנית מיוחדים בעלי ערך גבוה, שורה, ואת היבולים סיכות פירות הדר, כמו גם נודניק מטרד כאשר הם מצטברים בתוך הבית. עמידות חרקים מינים רבים הובילה לפיתוח שיטות חלופיות של אסטרטגיות ניהול בפשט. זוגיות-גדילי RNA (dsRNA)-RNA בתיווך הפרעה (RNAi) הוא גן להשתיק מנגנון פונקציונלי גנומית מחקרים כי יש יישומים פוטנציאליים ככלי לניהול של חרקים מזיקים. DsRNA exogenously מסונתז או RNA קטנים מפריעות (siRNA) יכולה לעורר יעילים ביותר ג'ין להחרשת דרך ההשפלה של RNA אנדוגני, אשר זה הומולוגי ל מוצג. יעיל וסביבתי השימוש RNAi בתור biopesticides המולקולרי עבור הייצור של חרקים hemipteran דורש ויוו המסירה של dsRNAs באמצעות האכלה. כאן נוכל להדגים שיטות מסירת dsRNA חרקים: טעינה של dsRNA לתוך שעועית ירוקה על ידי טבילה, וקליטת של גנים ספציפיים dsRNA עם משלוח אוראלי דרך בליעה. לנו יש גם המתוארים צמח שאינו הטרנסגניים גישות משלוח באמצעות תרסיסים בריסוס, שורש הירטבות, תא המטען זריקות וכן קליי בגרגרים, אשר עשוי להיות חיוני לשחרור מתמשכת של dsRNA. משלוח יעיל על ידי ingested dsRNA אושר כמו מינון יעיל לזירוז ירידה משמעותית בביטוי של יישוב גנים, כגון חומצה הורמון נעורים O-methyltransferase (JHAMT), vitellogenin (Vg). שיטות חדשניות אלה מייצגים אסטרטגיות עבור משלוח של dsRNA להשתמש בהגנת הצומח, להתגבר על אתגרים סביבתיים על ההדברה.

משלוח ירקות dsRNA מתווכת באמצעות האכלה ב BMSB 4th לחלל נימפות נבחנה לפיתוח biopesticides מולקולרית באמצעות RNAi עבור מזיקים חרקים פולשני. BMSBs הזנה באמצעות stylets דמוי מחט שלהם על-ידי מנגנון המכונה lacerate, סומק, הגורמת להרס יבולים. שעועית ירוקה אורגנית ודק, דלקתית פ ל', שימשו כדי לבדוק אם מזינים או dsRNA יכול להישלח ויוו BMSB באמצעות האכלה3. מקטעים של שעועית ירוקה שטבלו במים חינם DNase/RNase או פתרון של מים וצבע מאכל ירוק כדי לבדוק ...

מאמר זה מדגים טכניקות הרומן שפותחו עבור משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) דרך הרקמות וסקולריים הצמחים עבור התערבות RNA (RNAi) מהצינורות האכלה חרקים.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא להדגים שיטת אספקה טבעית בעל פה. עבור dsRNAs ספציפיים לגנים, כדי לגרום להפרעות RNA in vivo ומזיקי חרקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כיצד להעביר ביומולקולות בתוך חרקים, להבהיר את ההשפעה של חומרי הדברה ביולוגיים מולקולריים מבוססי RNAi, ולשלוט בחרקים בסביבה.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליישם העברה זו באמצעות חומצות גרעין, השתקת גנים בתיווך חומצות גרעין להאכלת מוהל צמחים כמו גם ללעיסת חרקים. אם כי השיטות כאן מדגימות אספקה של RNA דו-גדילי למזיקים המיפטרניים, כמו פשפש הסירחון החום, פשפש הארלקין ופסיליד הדרים אסייתי. ניתן ליישם אותם על חרקים אחרים.כדי להתחיל את הפרוטוקול, בחר באג סירחון חום 4 מוקדם, או נימפות BMSB, שבקעו ממסת הביצים, והרעיבו אותם במשך 24 שעות לפני האכלת ה-dsRNA. לאחר מכן, בחרו שעועית ירוקה דקה ומאושרת כאורגנית ושטפו אותה בתמיסת נתרן היפוכלוריט 0.2% למשך חמש דקות. המשיכו עם שלוש שטיפות H2O מזוקקות כפולות, והניחו לפולים להתייבש באוויר.לאחר שהם יבשים, חותכים את השעועית הירוקה מקצה הגביע לאורך כולל של 7.5 סנטימטרים בעזרת סכין גילוח נקי. טבלו את השעועית הירוקה השטופה והגזומה בצינור מיקרו-צנטריפוגה ללא מכסה, שני מיליליטר המכיל 300 מיקרוליטר של תמיסת בקרה. בצע דילולים של lac Z, JHAMT או VGDSRNAs מסונתזים במבחנה, על ידי דילול של 5 מיקרוגרם, או 20 מיקרוגרם, ו-300 מיקרוליטר של RNAs, מים נטולי DNA כדי להניב ריכוזים סופיים של 0.017 מיקרוגרם למיקרוליטר, או 0.067 מיקרוגרם למיקרוליטר בהתאמה.טבלו את השעועית הירוקה השטופה והגזומה בצינור מיקרו-צנטריפוגה ללא מכסה, שני מיליליטר, המכיל 300 מיקרוליטר של תמיסת dsRNA. עטפו ואטמו את שולי צינורות המיקרו-צנטריפוגה, סוגרים את השעועית הטבולה כדי למנוע אידוי של תמיסת ה-dsRNA, וכדי למנוע מבעלי החיים להיכנס לצינור המיקרו-צנטריפוגה. מקם את הצינורות זקופים בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות, כדי לאפשר לתמיסת ה-dsRNA להיטען בכל השעועית הירוקה על ידי פעולה נימית.הנח את הצינורות בכלי תרבית נקיים מפוליפרופילן, והניח 3 נימפות BMSB 4 Instar מורעבות בכלי התרבות. טפל בשלושה חרקים לכל כלי תרבות. כל אחד מהם מכיל שלוש שעועית ירוקה עם צבע מאכל ירוק, או תמיסת dsRNA.שמור על החרקים ב-25 מעלות צלזיוס ו-72% לחות יחסית, מתחת ל-16 ליטר, 8D פוטופריוד בחממה. אפשרו לחרקים להאכיל את השעועית הירוקה הטבולה ונספגת ב-dsRNA במשך חמישה ימים, וחידשו אותם בתזונה טרייה של שעועית ירוקה שטופלה ב-dsRNA לאחר שלושה ימים. בחר צמחים או שתילים, ואל תשקה אותם יומיים-שלושה לפני השימוש, כדי לתת לאדמה להתייבש ללחה, אך לא יבשה לחלוטין.בעזרת בקבוק ריסוס שנשאב ביד, מרחו 200 מיליליטר של תמיסת dsRNA על החופה התחתונה. דגמו את הגידול החדש מעצים שצמחו בעבר לאחר 25 עד 40 יום, על ידי איסוף כ-10 עלים מקצות ארבעה ענפים. חלץ את ה-RNA הכולל ונתח אותו על ידי RT-PCR ו-qPCR לנוכחות טריגר ה-dsRNA המיושם.באופן דומה, יש לרסס באופן מקומי 10 מיליליטר של dsRNA לאזור התחתון של שתיל, או עלווה של עצים קטנים. בחרו צמחים או שתילים, ואל תשקו אותם יומיים-שלושה לפני השימוש, כדי לתת לאדמה להתייבש, ללח, אך לא להתייבש לחלוטין. לאחר מכן, הוסף ליטר אחד של תמיסת dsRNA לאדמה של עציצים גדולים.הוסף ליטר מים לאחר שעה. מרחו 100 מיליליטר של תמיסת dsRNA על אדמה של עצים עציצים בגובה מטר אחד בקרקעות יבשות חלקית. אפשר לצמחים לקבל את תמיסת ה- dsRNA כטבילה באדמה, להשרות למשך 30 דקות.לאחר מכן יש למרוח טיפול רגיל במים בלבד כדי לסייע בספיגה על ידי השורשים. בחר שתילי הדרים, צמחים חדשים או בני 3.5 שנים להזרקת dsRNA באמצעות ברז הגבעול, הידוע גם בשם שיטת הזרקות הגזע. עטפו את קצה הנחושת של כל מזרק ארבע עד שש פעמים ברצועה ברוחב 0.6 סנטימטר של סרט תקרה כדי למנוע דליפה ליד הקצה.לאחר מכן, מלאו את מזרקי גזע העץ בשישה מיליליטר של תמיסת dsRNA מדוללת ב-DNA, מים ללא RNA. קדחו חורים בצמחי ההדר בעזרת מקדחה של 10 מיליליטר, והקפידו לא לחרוג משני סנטימטרים, או כמחצית מקוטר הגבעול. לאחר מכן, הזריקו את התמיסה לגזע העץ, והשאירו את המזרק בגזע למשך שש עד 10 שעות כדי לאפשר ספיגה של תמיסת ה-dsRNA.תנו לחרקים להאכיל את הייחורים מעצים שטופלו 3, 10 ו-30 יום לאחר הטיפול. שופכים 30 גרם מהחימר הסופג לצינור חרוטי של 50 מיליליטר עד לסימן 35 מיליליטר. יוצקים 20 מיליליטר של תמיסת dsRNA מדוללת ב-DNA, מים ללא RNA לתוך הצינור כדי להרטיב את כל הסופג.כסו את הצינור החרוטי, הטו את הצינור כדי לסייע בהוצאת אוויר, והניחו את הצינור זקוף, ותנו לו לעמוד במשך דקה עד שתיים בזמן שחלקיקי החימר סופגים את התמיסה. הוסף מספיק חימר ספוג dsRNA לתערובת האדמה כדי למלא סיר של ליטר אחד. מערבבים והופכים את האדמה ביד כדי לערבב היטב את החימר הספוג ב-dsRNA לתוך האדמה.השתמש באדמה כדי לשתול מחדש שתילים שנבחרו לטיפול ב- dsRNA. השקה את האדמה ב -200 מיליליטר מים רגילים, ללא dsRNA, לאחר 30 דקות עד שעה. המשיכו עם 100 מיליליטר מים רגילים.לאחר 24 שעות, הכניסו את הצמח ללוח זמנים השקיה רגיל. בדוק ארבעה עד שישה עלים של העציצים המטופלים עם סופגי חימר ו-dsRNA בכל חודש, לאחר הטיפול ב-dsRNA, על ידי איסוף העלים האפיקליים ביותר של צמיחת צמחים חדשים. QPCR של מקטעי שעועית ירוקה שקועים ב-dsRNA מסונתז במבחנה, ספציפי לבאג סירחון חום, או BMSB mRNA, הצביע על אינדוקציה מוצלחת של RNAi כאשר הביטוי של מטרות JHAMT ו-Vg הופחת משמעותית in vivo.שיטת העברה זו יעילה גם על מזיק המיפטרני אחר, פשפש הארלקין. כפי שמעידה הפרשתם בצבע ירוק. לאחר צפייה בהדגמות חזותיות אלה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר RNA דו-גדילי לחרקים באמצעות בליעה דרך הפה להשראת חרקי RNAi in vivo.ההתקדמות שנעשית בטכנולוגיית RNAi nucelotide ממשיכה להרחיב את יכולותיהם של חוקרים לווסת את רמות ה-RNA, ביטוי הגנים והחלבון במגוון רחב של אורגניזמים חיים. זה עובר מצמחים, לחרקים ולמיקרואורגניזמים הקשים ביותר. אז בעוד שעלות הייצור של RNA דו-גדילי ממשיכה לרדת, ושיטות האספקה והיציבות ממשיכות להשתפר, העתיד של טכנולוגיות RNAi ימשיך לשמש לפתרון בעיות מתעוררות ומורכבות.

double-stranded-rna-oral-delivery-methods-to-induce-rna-interference

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שתי אסטרטגיות שבו זמנית לדכא שני גנים (מציאה גן כפולה) בדבורי דבש. לאחר מכן אנו מציגים כיצד להשתמש בסיומת תגובת חוטם (PER) assay כדי לחקור את ההשפעה של מציאה גן כפולה על תפיסה התעוררה אצל דבורת דבש.

מציאה RNAi בתיווך זוגית ג&#39;ין ומדידה בחוש טעם בדבורי דבש (<em&gt; אפיס mellifera</em&gt;)

כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

RNA interference (RNAi) הוא כלי בעל ערך רב לחשיפת תפקוד הגנים. עם זאת, היכולת למקד גנים באמצעות RNAi בשלבים טרום-בוגרים מוגבלת בווקטור המלריה האנושי העיקרי Anopheles gambiae. אנו מתארים פרוטוקול RNAi להפחתת תפקוד הגנים באמצעות הזרקה ישירה במהלך התפתחות הגולם.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

כתב יד זה מדגים דלדול של ביטוי גנים ב פיתול של המקק הגרמני באמצעות בליעה דרך הפה של זוגיות גדילי RNA במארז ליפוזומים.

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

הפרעות RNA היא טכניקה ישימה ורבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בשלבים התפתחותיים ספציפיים. כאן, אנו מתארים את הצעדים הדרושים ליישום טכניקה זו חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס, מרכישת רצפי גנים ועד לחיסול גנים המשפיעים על מבנה או התנהגות.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לאיסוף מספיק רוק מחרקים יונקים באמצעות מדיום מלאכותי. זוהי שיטה נוחה לאיסוף רוק חרקים וחקר תפקוד הרוק על התנהגות האכלת חרקים והעברת וירוסים המועברים בווקטורים.

שיטת כריך ממברנה דו שכבתית עבור אוסף הרוק של לאודלפקס

מתן אוראלי של dsRNA המיוצר על ידי חיידקים, שיטת אספקה להפרעות RNA (RNAi) המשמשת באופן שגרתי ב - Caenorhabditis elegans, יושם כאן בהצלחה על יתושים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת מחקרים חזקים בגנטיקה הפוכה ומחקרי וקטורים חוסמי העברה ללא שימוש בהזרקה.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

כאן, אנו מציגים שיטת השרייה מפורטת של הפרעת RNA ב Bursaphelenchus xylophilus כדי להקל על המחקר של תפקודי גנים.

יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

המניפולציה של הפרעות RNA (RNAi) מהווה אתגר עצום במינים רבים של טפילים בעלי גודל זעיר, כגון צרעות טריכוגרמה . מחקר זה התווה שיטת RNAi יעילה ב - Trichogramma denrolimi. המתודולוגיה הנוכחית מספקת מודל חזק לחקר בקרת גנים בצרעות טריכוגרמה .

הפרעות RNA בפרזיטואיד ביצה, Trichogramma dendrolimi Matsumura

מוצג כאן פרוטוקול להעברת ננו-חלקיקים chitosan/dsRNA בזחלי בומביקס מורי תולעי משי כדי לגרום להשתקת גנים באמצעות בליעה.

התערבות RNA זחל בתולעי משי Bombyx mori באמצעות Chitosan/dsRNA אספקת ננו-חלקיקים

למדו שיטות למסירת RNA דו-גדילי דרך רקמות צמחים להתערבות RNA בחרקים Hemipteran. שיטות אלה מאפשרות שתיקת גנים ספציפית ופיתוח ביופסטיצידים ממוקדים לחקלאות בת קיימא.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

גלה סרטונים נוספים