Name: בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: למדו שיטה לבידוד תאים דצידואליים ראשוניים מקרומי עובר של שליית מונח. טכניקה זו מספקת תפוקה גבוהה וחיות תאים לחקר סיבוכי הריון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות התורמים, את BioBank RCWIH, ואת ביה ח הר סיני/UHN המחלקה למיילדות גינקולוגיה עבור דגימות האנושי השתמשו במחקר זה. ברצוננו להודות לחברים של המעבדה בורית, במיוחד ד ר קרוליין דאנק עזרה עם פיתוח השיטה. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן ברוכים הבאים בורוז (גרנט #1013759).

Placentae נאספים מהסמסטר בריא, לא בנשים העבודה שעברו קיסרי אלקטיבי. איסוף, עיבוד, חד פעמית של דגימות האדם לדבוק הקווים המנחים של הלוח הר סיני החולים אתיקה. בכתב מתקבל של כל מטופל. מחקר זה אושרה על ידי מועצת המנהלים של אתיקה מחקר בבית החולים הר סיני.
1. תכשירים
הערה: כל השלבים להתבצע תחת ברדס fume, כל ציוד כירורגי חייב להיות מעוקר דרך החיטוי לפני השמה בשכונה fume. כל חומר אחר (בקבוקים, צינורות 50 מ ל, וכו ') חייב להיות מעוקר עם 70% אתנול פתרון. תמיד ללבוש ציוד מגן אישי בכל עת בעת עבודה עם פסולת ותברואה (חלוק, כפפות, שיער ארוך אסוף, וכו ').
<ol><li>
פתרון עיכול אנזימטי (הפתרון הסופי: 200 מ ל)
	<ol>
<li>פיפטה 180 מ של HBSS-/ - לתוך גביע 500 מ"ל, להוסיף מגנט מלהיב סטרילי ומניחים על ערבוב צלחת בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>שוקל ולהוסיף את הפעולות הבאות לפתרון של HBSS-/-לאט ברצף: 20 מ ל FBS, 400 מ"ג Collagenase 2 ([הסופי] = 2 מ"ג/מ"ל), 20 מ ג מעכבי טריפסין שעועית סויה ([סופי] = 0.1 מ"ג/מ"ל), 30 מ"ג DNase 1 ([הסופי] = 0.15 מ"ג/מ"ל), ו- 200 מ"ג BSA ([סופי] = 1 מ"ג/מ"ל)</li>
		<li>הגדר את ערבוב במהירות בינונית, ולאפשר את התערובת ומערבבים למשך 10-20 דקות (כיסוי עם סרט נייר כסף או פרפין פח תוך כדי ערבוב).</li>
		<li>שופכים את הפתרון מעורב לתוך בקבוק זכוכית 250 מ ל באמצעות משפך פלסטיק ולמקם בשכונה fume.</li>
		<li>עוברים את הפתרון באמצעות יחידת סינון העליון פלסטיק (0.22 μm ממברנה מסנן, 500 מ"ל), aliquot 20 מ"ל לתוך צינורות 50 מ ל (סה כ 10 צינורות), חנות ב-20 ° C עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RPMI 1640 מדיה (2% שטיפה פתרון ו- 10% צמיחה מלאה בינוני)
	<ol>
<li>לשלב RPMI 1640 FBS בבקבוק זכוכית בשכונה fume.</li>
		<li>2% FBS פתרון, לשלב 490 מ של RPMI 1640, 10 מ ל FBS.</li>
		<li>10% FBS הפתרון, לשלב 450 mL RPMI 1640 ו- 50 מ ל FBS.</li>
		<li>פיפטה 500 μL של normocin לתוך בקבוק הזכוכית 500 מ"ל מהשלב הקודם המכיל RPMI ומדיה FBS (50 מ"ג/מ"ל מניות, 0.05 מ"ג/מ"ל ריכוז בעבודה).</li>
		<li>להעביר מדיה דרך μm ממברנה מסנן 0.22 בחנות בבקבוק זכוכית 500 מ"ל ב 4 ° C עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 דקות לפני הפעלת הניסוי, מקום aliquot של 20 מ"ל של קפוא עיכול אנזימטי פתרון באמבט חרוז 37 ° C, למקם את 2% FBS ואמצעי התקשורת FBS RPMI 1640 10% באמבט חרוז 37 ° C, להפעיל את האמבט במים נדנדה והגדר 37 ° C , דור 2, והינו ממוקם צנטריפוגה מבוקרת טמפרטורה עד 4 ° C.</li>
</ol>2. אוסף של רקמת Decidual מן המונח היפרדות הקרומים
<ol><li>למקם בקבוקים עם HBSS + +, HBSS-/-חמישה צינורות 50 מ ל במעמד מתחת למכסה המנוע fume. פיפטה 25 מ של HBSS + / + צינור אחד.</li>
	<li>
באמצעות הידיים בכפפה, להוציא את השליה המונח מהגורם המכיל המשמש להובלת זה מן התיאטרון חדר הניתוח. מקם את השליה על משטח החתלה (אימהית בצד למעלה) ולהפיץ את הקרומים העובריים בעזרת מלקחיים ומספריים.
	<ol>
<li>שכב רפידות חיתול חופפים על מכסה המנוע fume.</li>
		<li>השתמש חיתול נפרד כדי להעיף את השליה אז הצד האימהי הוא הפנים למעלה.</li>
		<li>למצוא נקודת של קרום קרע ולבצע חתכים כדי לאפשר את הממברנה כדי לגולל ושכבה פרקדן על פני השטח fumehood. הערה: לאחר הקרום שהוחזר מן השליה, רותמי יהיה עם הפנים למעלה נח על השכבה chorion, עם השכבה השפיר מאחור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בזהירות באמצעות המגרד של תא פלסטיק, לגרד את הרקמה decidual chorion ואת המקום לשפופרת 50 מ ל המכיל 25 מ ל HBSS + / +.</li>
	<li>לגרד את הקרום עם לחץ מתון. אל תחיל מדי לחץ כמו זה עלול לגרום זיהום chorion. לאסוף קרישי דם קטנים כמו גם, אלה מכילים מספר תאים decidual. התראה: לאחר אוסף decidual, השליה חייב להיות ארוז בתוך סל פלסטיק חומרים מסוכנים, קפוא במקפיא-20 ° C לפני סילוק מתאים (לפי הכללים מוסדית). רפידות חיתול מדם חייב להיות עטוף בשקית ניילון חותם חזק והשמדתי בתוך קופסת הבטיחות הביולוגי.</li>
</ol>3. שטיפת, אנזימטי עיכול של הרקמה Decidual
<ol><li>לשטוף את רקמות שנאספו על ידי בעדינות רועד הצינור 50 מ ל בעבודת יד ולהעביר אותו דרך מסננת מתכת (250 μm, רשת שינוי גודל 60) 250 μm מנוחה מעל מיכל הדגימה סטרילי (שתן).</li>
	<li>חזור על לשטוף את פעמיים עם HBSS + / + פעמיים עם HBSS-/ - צינורות טריים עבור כל כביסה. (סופי שוטף עם HBSS-/-מאפשר הסרת סידן ומגנזיום נוכח HBSS + +, אשר יפריע אחרת תהליך עיכול אנזימטי הבא). שימו לב. במהלך השלבים כביסה, זיהום רקמות chorion יהיה כפי הרקמה decidual הוא אור ורוד בצבע הוא אמורפי, בזמן chorion הלבן, דחוס וצמיגי. לכן, זיהום chorion ניתן להסירו בקלות עם מלקחיים.</li>
	<li>לחלופין, אם הרקמה decidual עבה, להעביר אותו צלחת פטרי בקוטר 10 ס מ סטרילי והמשך מינצ של הרקמה עם שני אזמלים מנוגדות בצלחת.</li>
	<li>
למקם את הרקמה שטף סטרילי 50 מ ל שפופרת המכילה 100 מ ג של רקמות/mL של פתרון עיכול אנזימטי (ראו הכנות).
	<ol>
<li>כנקודת התייחסות, לוודא הרמה של רקמת decidual יגיע הסימן 5-10 מ"ל ברכבת התחתית 50 מ.</li>
		<li>השתמש בערך 20 מ"ל של פתרון עיכול אנזימטי (הוכן בשלב 1.1) לעכל את רותמי הכולל שנאסף קרום עוברי כל. המונח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לסגור את הפקק של הצינור עם הסרט פרפין (לאטום את הצינור בחוזקה, לעטוף פרפין הסרט סביב פקקי העליון של הצינור) תחת התרבות הוד, דגירה רקמת decidual ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות באמבט מים חזק (145 סל ד דור 2).</li>
	<li>לאחר דגירה, להסיר את הסרט פרפין לעקר את פני השטח של הצינור המכיל רקמות מתעכל עם 70% אתנול, מתחת למכסה המנוע fume. לנער את הצינור בקצרה בעבודת יד.</li>
	<li>לאסוף תא ההשעיה דרך מסננת מתכת (250 μm, רשת שינוי גודל 60) לתוך מיכל הדגימה סטרילי חדש. לדלל עם אמצעי אחסון שווה (20 מ ל) של RPMI + 10% FBS המכיל 0.1% normocin כדי לעצור את התגובה אנזימטיות. המשך ישירות לשלב צנטריפוגה 4.1.</li>
	<li>במידת הצורך, למקם את הרקמה מעוכל הנותרים בחזרה לתוך צינור 50 מ עם 20 מ של עיכול אנזימטי טריים פתרון וחזור על מערכת העיכול (20 דקות, 37 ° C, רועד אמבט מים).</li>
	<li>אם עיכול השני הוא הכרחי, במקום ברכבת התחתית הראשונה עם תא השעיה על קרח (כיסוי עם סרט פרפין לשמור סטרילי). חזור על שלבים 3.5-3.6 ולשלב את המתלים שני תאים.</li>
</ol>4. יצירת השעיה תא בודד
<ol><li>Centrifuge התליה תא (420 גרם, 4 ° C, 11 דקות).</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים 40 מ"ל של RPMI + 2% FBS המכיל 0.1% normocin ("מאגר שטיפת"). הערה: תא גלולה להיות רפוי, כמו ג'לי עקב זיהום תאי הדם האדומים, תשאף תגובת שיקוע בזהירות. הסרה של השלב העליון עם פיפטה ידני ייתכן שתידרש.</li>
	<li>חזור על צנטריפוגה-420 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 11 דקות.</li>
	<li>בזהירות להסיר את תגובת שיקוע (כאמור הערה שלב 4.2) ו resuspend בגדר תא ב 5 מ של שטיפת מאגר ולהוסיף 35 מ של מאגר פירוק כדוריות דם אדומות בצינור אותו. הערה: אם בגדר גדולים או מדמם מאוד, זה ניתן לחלק את שני צינורות עבור השלב פירוק כדוריות דם אדומות על-ידי הוספת 10 מ"ל של מאגר לשטוף ואת חלוקת באותה מידה שני צינורות ואז הוספת 35 מ של מאגר פירוק כדוריות דם אדומות כל שפופרת.</li>
	<li>דגירה על קרח במשך 20 דקות בקצרה מערבולת צינור בתחילתה ואת בסוף הדגירה כדי lyse כדוריות דם אדומות.</li>
	<li>צנטריפוגה-420 g עבור 11 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>. בזהירות, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 40 מ של מאגר לשטוף.</li>
	<li>עוברים את התאים μm 70 ניילון מסנן כדי להסיר תאים גושים.</li>
	<li>צנטריפוגה-420 גרם עבור 11 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של מדיום מלאה (RPMI 10% + FBS המכיל 0.1% normocin).</li>
	<li>
לספור תאים באמצעות trypan צבען כחול-הדרה hemocytometer ההליך כמפורט להלן:
	<ol>
<li>מתחת למכסה המנוע תרבות בעדינות פיפטה תא ההשעיה לאורך 3 x כדי לערבב ביסודיות לפני שילוב עם trypan blue. ב- mL 1.5 שפופרת להכין תא ההשעיה, מדולל 1:2 (לשלב, 20 μL של פתרון trypan blue) וμl 20 של השעיה תא decidual. מערבבים בזהירות trypan blue-תא פתרון על-ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים (פתרון זה אינו סטרילי).</li>
		<li>מניחים את hemocytometer על השלב של המיקרוסקופ עם זכוכית coverslip על העליונה. הערה: Hemocytometer היא מיקרוסקופ שקופית עם רשתות עליו לתת תשעה ריבועים גדולים מחולק לשלושה קווים. כל ריבוע גדול יש אזור של 1 מ מ2, העומק של נוזל בבית הבליעה 0.1 מ מ. לכן, שאמצעי האחסון של נוזל יכול למלא כל ריבוע גדול 1 מ"מ * 1 מ"מ * 0.1 מ"מ = 0.1 מ"מ3= 10 מ ל-4 .</li>
		<li>לאט לאט להוסיף 10 μL של תערובת trypan blue-תא לתוך החריץ של hemocytometer, המאפשר נימיות לפזר את תערובת תא מעל השקופית כולה (לעצור לפני תערובת ממלא טוב).</li>
		<li>הצג את התאים במיקרוסקופ (ב 10 X הגדלה), לספור את כל התאים לבן/ירוק השוללים trypan blue (אלה הם התאים קיימא) ארבע המשבצות החיצוניות גדול של hemocytometer. בעת ספירת תאים יגעו בשורה, לספור רק את אותו מגע בצד ימין ואת השורות העליונות, אך לא כאלה נוגע לימין ואת התחתון קווים. לא לספור תאים כחול כהה; צבע כחול מציין כי התא מת כפי trypan blue צבען יכול בקלות לחדור דרך קרום פלזמה לתוך הציטופלסמה.</li>
		<li>כדי לחשב את מספר התאים קיימא ב 1 מ"ל של התא השעיה (X): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57443/57443eq1v2.jpg"> 2 = גורם לדילול 10,000 = פקטור המרה (1 מ"ל = 1 ס מ3 = 10, 000 * 0.1 מ מ3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>לדלל decidual לתאים ריכוז סופי רצוי RPMI + 10% FBS (מדיום הגידול). הערה: עבור ציפוי תרביות רקמה, פיפטה 2 * 106 תאים/היטב לתוך צלחת פלסטיק 6-ובכן, 10 * 106 תאים לתוך צלחת פלסטיק 10 ס מ או 75,000 לתאים coverslip זכוכית.</li>
</ol>

<ol><li>Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li>
<li>Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+SC+%22Decidualization+and+relevance+to+menstruation%22">Decidualization and relevance to menstruation</a>. , Cambridge University press. 187-212 (1990).</li>
<li>Kariya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+inhibits+in+vitro+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).</li>
<li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).</li>
<li>Wu, W. -X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+decidualization+and+prolactin+mRNA+and+production+at+different+stages+of+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy.</a> Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).</li>
<li>Bell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+secretion+of+protein+by+the+endometrium+and+decidua%5BTitle%5D)+AND+%22Implantation%3A+Biology+and+Clinical+Aspects%22%5BJournal%5D)">Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua.</a> Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).</li>
<li>Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+natural+killer+cells%3A+key+regulators+of+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Decidual natural killer cells: key regulators of placental development.</a> Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).</li>
<li>Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytosis+and+monocytic+infiltration+of+decidua+in+early+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy.</a> Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).</li>
<li>Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+colony-+stimulating+factor-1+in+the+human+uterus+and+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).</li>
<li>Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cachectin%2Ftumor+necrosis+factor-alpha+formation+in+human+decidua.+Potential+role+of+cytokines+in+infection-induced+preterm+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor.</a> Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).</li>
<li>Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+lymphocyte+alloreactivity+by+early+gestational+human+decidua.+II.+Characterization+of+the+suppressor+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms.</a> Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).</li>
<li>Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltration+of+myeloid+cells+into+decidua+is+a+critical+early+event+in+the+labour+cascade+and+post-partum+uterine+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).</li>
<li>Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+density+and+pro-inflammatory+cytokine+expression+in+human+fetal+membranes%2C+decidua%2C+cervix+and+myometrium+before+and+during+labour+at+term%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term.</a> Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).</li>
<li>Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+maternal+leukocytes+are+activated+in+response+to+cytokines+secreted+by+uterine+tissues+of+pregnant+women%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women.</a> Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).</li>
<li>Hamilton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+infiltrate+the+human+and+rat+decidua+during+term+and+preterm+labor%3A+evidence+that+decidual+inflammation+precedes+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor.</a> Biology of Reproduction. 86, 39(2011).</li>
<li>Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+infection-induced+preterm+labour%5BTitle%5D)+AND+%22Reprodution+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Cytokines and infection-induced preterm labour.</a> Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).</li>
<li>Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leukocyte+traffic+and+activation+in+parturition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Society+for+Gynecologic+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of leukocyte traffic and activation in parturition.</a> Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).</li>
<li>Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+in+term+and+preterm+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cells in term and preterm labor.</a> Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).</li>
<li>Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+leukocytes+from+the+human+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).</li>
<li>Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolation+of+cells+from+the+human+fetal-maternal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface.</a> Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).</li>
<li>Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+establishing+primary+human+endometrial+stromal+cells+from+hysterectomy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens.</a> Journal of Visualized experiments. 87, (2014).</li>
<li>Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+derived+from+human+placenta+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue.</a> Journal of Visualized experiments. 112, (2016).</li>
<li>De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+endometrial+epithelial+and+stromal+cells+for+in+vitro+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization.</a> Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).</li>
<li>Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+and+activation+status+of+maternal+and+peripheral+blood+leukocytes+during+pregnancy+and+labour%2C+both+term+and+preterm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף

הפרוטוקול המתואר כאן מדגים את העלות ואת הזמן שיטה יעילה עבור בידוד תאים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח האנושיות placentae כי הוא מאוד נגיש וברור. ההצלחה של פרוטוקול זה תלויה בשני גורמים קריטיים, (1) יעילות של גירוד decidual מהשכבה chorion בקרום עוברי וטיפול (2) שבה התאים decidual מטופלות לאורך כל הפרוטוקול. זה חשוב כי זיהום רקמות chorion נשלטת על-ידי הבטחת כי לא נכלל בטעות במהלך גירוד decidual, על-ידי זיהוי והסרה של כל זיהום במהלך השלבים כביסה (ההבדל מורפולוגיה רותמי, chorion מאפשר הסרה קלה של chorion אשר שיי...

רירית הרחם, אחד הפעילים ביותר למבוגרים נקבה ברקמות, עובר שיפוץ דרמטי בכל מחזור הוסת בתגובה לגירוי על ידי השחלה הורמונים, אסטרוגן (E2) ופרוגסטרון (P4). רותמי, המכונה גם רירית הרחם בהריון, היא רקמה הרבייה חשובה ביותר שנוצר עד לסוף השלב postovulatory כתוצאה מונחה P4 בידול בעקבות השלב proliferative E2-הדומיננטי. תאים decidual אחראים הפרשת ההורמונים גורמים הבלסטוציסט מוצלחת השרשה ועל פיתוח של הממשק עם רחם-היפרדות לשמירה על סובלנות אימהי להשתלת העובר.
Decidualization נדרש השרשת ובניה עוקבות של העורקים ספירלה decidual. תאי סטרומה רירית הרחם עוברים decidualization, תחת השליטה של P4, מחנה, במהלך שלב luteal מאוחר של המחזור החודשי1. תהליך זה הוא יזם סביב כלי הדם מתפשט ברחבי stroma, רומז תפקידה להערכת ואבו ליקוציט סחר רגולציה. זה שינוי הסלולר מאופיין של מורפולוגיה מעגלית, גודל הגרעין גדל והרחבה של תוך-פלזמית קשה ו גולג'י2. Decidualized תאי סטרומה הם מסוגלים לייצר paracrine גורמים התומכים הבלסטוציסט השרשה, המאופיינת על ידי הפרשת הורמונים (קרי פרולקטין) רבים, גורמי גדילה אנגיוגנזה, אינסולין גורם גדילה מחייב חלבון-1 (IGFBP-1), פרוסטגלנדין (עמוד) E (ממריץ של מחנה תאיים), ציטוקינים, מטריצה חוץ-תאית רכיבים וחומרים מזינים חיוניים עבור היפרדות השרשה ופיתוח3,4,5,6 .
האוכלוסייה תא decidual לא מורכבת אך ורק תאי סטרומה decidualized אבל מכיל גם אוכלוסיות גדולות, הריון ספציפי ליקוציט decidual. Decidualization כרוך קרדיוגני מקומי חולף זרם של תאים הטבעיים (NK) רוצח, תאי-T, תאים דנדריטי macrophages. Subpopulation ליקוציט הגדול הוא תאי NK הרחם, הכוללת כ- 50-70% של כל לויקוציטים אימהי שחדר רותמי אשר הם מקור של ציטוקינים וגורמים האנגיוגנזה אשר עשויים לסייע בתהליך decidualization, לודיג מספר לאורך כל ההריון7. מקרופאגים, להיות subpopulation השנייה בגודלה של תאים חיסוניים, נמצאות סביב האתר השרשה ולהגדיל במהלך הריון8. הם מקור של ציטוקינים, צמיחה גורמים כגון המושבה מגרה פקטור (CSF-1)9, הגידול נקרוזה מקדם α (TNFα)10 ופרוסטגלנדין (עמוד) E11.
לאורך כל ההריון, לפני הלידה המונח, רותמי היא המקור העיקרי של ציטוקינים ו נוגדנים אחראית ליקוציט היקפיים אימהי הפעלה והעברה עוקבות לרקמות הרחם ליזום עבודה. מחקרים שנעשו בבעלי חיים הראה כי ציטוקינים פרו-דלקתיים רבים הם למעלה מוסדר ב רותמי העכבר במהלך העבודה, כגון TNF-a, IL-6, IL-12, ו- IL-1b12. ב האדם רותמי, ציטוקינים פרו דלקתיים IL-1b, IL-6 ו- IL-8 (הגדולות chemoattractant נויטרופילים) התערוכה ביטוי גבוה יותר במהלך העבודה לעומת לא העבודה13. אלו ומופרש ציטוקינים תוצאה הפעלת ואת זרם של לויקוציטים אל רקמות decidual14; מקרופאג decidual, נויטרופילים בחדירת שני האדם ואת עכברוש ביבוא במהלך תקופת העבודה, עם חדירת decidual שקדמו myometrial 4-fold רבתי, המציינת את מפל של הפעלת בין רקמות הרחם שני סמוכים זה 15. אלה שחדר לויקוציטים לייצר PGs מסוגל להפעיל התכווצויות סינכרונית של ה myometrium16, מטריקס metalloproteinases (MMPs) ליזום ממברנה לקרע17,18, כמו גם ציטוקינים פרו-דלקתיים כדי להגביר את תהליך הפעלת הרחם ('סערת ציטוקינים').
בשל תפקידים חשובים רבים של תאים decidual, כמו משחק תפקיד קריטי בתהליך ההשתלה, שמירה על רגישות אימהית-עוברית ההיריון המוקדמים, השתתפות ההפעלה של העבודה-מונח הלקויות השונות יכול להיווצר במהלך הריון. למשל, בעיות פוריות (1) בשל השרשה חוזרים ונשנים כישלון ואובדן הריון חוזרים ונשנים יכול לנבוע כשל של התבגרות decidual; (2) הגבלת גדילה תוך רחמי (IUGR), רעלת עקב פיתוח לקוי, חוסר תפקוד של רותמי/השליה או טרנספורמציה וסקולרית פרוץ בצומת decidual-myometrial; כמו גם לידה לידה מוקדמת (3) אשר יכול לנבוע הפעלה decidual מוקדמת.
לנוכח הפרעות עיקריים אלה, יחד עם המגבלות מוסרי ומעשי של האדם ויוו מחקרים, הקמת שורות תאים decidual אנושיים העיקרי הוא חיוני עבור ניתוח במבחנה במטרה הבנה טובה יותר, שיפור ניהול קליני של סיבוכים בהריון. לפיכך, מטרת המחקר שלנו היה לפתח פרוטוקול המאפשר ניתוקה של תאים אנושיים decidual ראשי עם תשואה גבוהה התא ואת הכדאיות שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae. בפרוטוקול הנוכחי זה מתאר בבירור זמן cost effective שיטה עבור בידוד של תתי סוגים ספציפיים של decidual תאים אשר לשמש למגוון רחב של ניתוחים במבחנה . אפיון של שפע של פנוטיפ של decidual תת אוכלוסיות המונח, בהשוואה בשליש הראשון או השני הוא חיוני כדי הגדרת התפקידים שלהם לאורך כל ההיריון האנושי.

<table><tbody><tr><td>האנק' תמיסת מלח מאוזנת עם סידן ומגנזיום</td><td>מוכן במתקן (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank' s תמיסת מלח מאוזנת ללא סידן ומגנזיום</td><td>מוכן במתקן (LTRI)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>רפידות חיתולים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיות גדולות</td><td>AL Medical</td><td>2018-12-20.</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים כירורגיים גדולים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11000-18</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים חד פעמי מפלסטיק (25 ס"מ)</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>250 מ"מ (גודל 60 רשת) מסננת מתכת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1020-5EA</td><td></td></tr><tr><td>אזמל חד פעמי עם ידית פלסטיק (#21)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי סטרילית מפלסטיק (קוטר 10 ס"מ)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>מיכל דגימה סטרילי (כוס שתן, 4.5 אונקיות)</td><td>VWR</td><td>25384-146</td><td></td></tr><tr><td>מסנן ניילון (70 מ"מ)</td><td>VWR/Corning</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה אריתרוציטים</td><td>Qiagen</td><td>79217</td><td></td></tr><tr><td>טריפאן כחול, תמיסה 0.4%</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 אמצעי תרבות</td><td>Invitrogen</td><td>11835-055</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>נורמוצין (50 מ"ג/מ"ל)</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>יחידת סינון עליונה מפלסטיק (ממברנה 0.22 מ"מ, 500 מ"ל)</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז 2, אבקה ליופילית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין פולי סויה, אבקה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003-250mg</td><td></td></tr><tr><td>אבקת DNase</td> אלבומין סרום <td>בקר Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>(אבקת BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב - Leica DMI 6000B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימת הדמיה - Image Stream MK2</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת IDEA</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC מצומד נוגדן וימנטין</td><td>R& D Systems</td><td>IC2105A</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן CD45 מצומד APC H7</td><td></td> BD <td>641399</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ציטוקרטין מצומד FITC</td><td>MACs Miltenyi Biotec</td><td>130-080-101</td><td></td></tr><tr><td>PerCP -מצומד ציטוקרטין 7 נוגדן</td><td>Novus</td><td>NBP2-47941PCP</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450 צבע כדאיות לתיקון</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני וימנטין</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-7558</td><td></td></tr><tr><td>CD45 נוגדן ראשוני</td><td>Dako</td><td>M0701</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני ציטוקרטין</td><td>Dako</td><td>M0821</td><td></td></tr><tr><td>ציטוקרטין 7 נוגדן ראשוני</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td></td></tr><tr><td>עכבר IgG</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>עז IgG</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-2028</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 נוגדן משני</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של ראשי תאים decidual האנושי בקרום עוברי של המונח placentae

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

רותמי, המכונה גם רירית הרחם בהריון, היא רקמה הרבייה חשובה ביותר. תאים decidual, המורכב בעיקר תאי סטרומה decidualized של תאים חיסוניים, אחראים הפרשת גורמים הורמונליים דלקתית אשר הם קריטיים עבור הבלסטוציסט מוצלחת השרשה, פיתוח היפרדות לשחק תפקיד חניכה של העבודה לטווח, לידה מוקדמת. רבים הריון לסיבוכים לפליטת של איזון עדין של אוכלוסיות תאים שונים הכוללת רותמי. שינויים ביחס של סוגי תאים decidual מסוים עשוי לשבש תהליכים חיוניים אלה ולהגביר את הסיכון לפתח סיבוכים חמורים של ההריון, כגון כשל השרשה של העובר, פיגור גדילה תוך רחמי, רעלת, צירי. פרוטוקול שמפורטות כאן מדגים את העלות ואת הזמן שיטה יעילה עבור בידודו של התאים decidual העיקרי של האדם שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae. על ידי שילוב עיכול אנזימטי ובהפסקות מכני עדין של הרקמה decidual, הושג תשואה גבוהה של תאים decidual עם כמעט ללא זיהום chorion. חשוב, מאופיינים מבודד תאים decidual (תאי סטרומה (55-60%), לויקוציטים (35%), אפיתל (% 1) או trophoblast (0.01%) תאים) ומתוחזק הכדאיות גבוהים (80%) אשר אושר ע י ססגוניות assay cytometry זרימה הדמיה. פרוטוקול זה ספציפית parietalis רותמי, ניתן להתאים בשליש הראשון והשני placentae. מבודדת בעבר, תאים decidual יכול לשמש עבור מספר רב של יישומים ניסיוני במטרה להבין את התפקיד של אוכלוסיות תת תא decidual שונים של סיבוכים בהריון.

כדי לאמת את היעילות ואת הכדאיות של תאים מבודדים, אופיינו על ידי שתי שיטות: flow cytometry, immunocytochemistry (ICC). אוכלוסיות תאים 4 ממוקדים; decidualized תאי סטרומה אותרו על ידי הנוגדן אנטי-vimentin, פן-ליקוציט סמן CD45 שימש כדי לזהות תאים חיסוניים decidual, cytokeratin שימש כדי לזהות תאים אפיתל אנדותל, בסופו של דבר, cytokeratin 7 שימש כדי לזהות כל trophoblast פוטנציאליים (chorion או היפרדות) זיהום.
על אפיון באמצעות מיכשור הד...

פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול בידוד תאים זה היא לפתח שיטה לבידוד תאים עשרוניים ראשוניים עם כדאיות תאי קצה בעלי תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרבייה האנושית, כגון תפקיד הנשיר בהשתלת בלסטוציסט והתחלת לידה. זה יכול גם לספק תובנה לגבי פתולוגיות שונות הקשורות להריון.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה חסכונית בזמן ובעלות לבידוד של תאים עשרוניים ראשוניים עם תפוקות קצה כדאיות גבוהות. כדי להתחיל, השאירו חמישה צינורות של 50 מיליליטר על מתלה ושני בקבוקי HBSS ו-HBSS במכסה האדים. ואז פיפטה 25 מיליליטר HBSS בצינור המסומן כראוי.לאחר מכן, הניחו חיתולים חופפים במכסה המנוע. לאחר מכן, הוציאו את המונח שליה מהמיכל והניחו אותו במכסה האדים. מקם את השליה על כרית החיתול כשהצד האימהי כלפי מעלה.אם השליה היא מצד האם כלפי מטה, השתמש בחיתול נוסף כדי להפוך את השליה. חפש את נקודת הקרע בקרום ובצע חתכים באמצעות מספריים ומלקחיים כדי לאפשר לקרום להיפתח ולהשכיב שטוח על משטח מכסה המנוע. לאחר מכן השתמש במגרד תאים כדי לגרד בעדינות את הרקמה העשרונית מהכוריון.העבירו את הרקמה לצינור של 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של HBSS זכרו לאסוף גם קרישי דם קטנים, מכיוון שאלו מכילים גם כמה תאים עשרוניים. נער בעדינות את צינור ה-50 מיליליטר כדי לשטוף את הרקמה שנאספה, ואז העביר את הרקמה דרך מסננת מתכת של 250 מיקרומטר. חזור על תהליך הכביסה פעמיים עם HBSS ולאחר מכן שתי שטיפות עם HBSS בצינורות טריים.זיהום כוריון נראה בקלות בשל צורתו דמוית החוט וצבעו הבהיר יותר וניתן להסירו לאחר הכביסה. לאחר הכביסה, הניחו את הרקמה בצינור סטרילי של 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר של תמיסת עיכול אנזימטית לעיכול כל הדצידואה המתקבלת מכל המונח קרום עוברי. השתמש בסרט פרפין כדי לאטום את מכסה הצינור.לאחר מכן דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים רועדים. הגדר את הטיימר למשך 20 דקות. לאחר סיום הדגירה, הסר את סרט הפרפין.השתמש באתנול 70% כדי לעקר את פני הצינור המכיל את הרקמה המעוכלת ולהניח אותו מתחת למכסה האדים. לנער את הצינור לזמן קצר. לאחר מכן, העבירו את מתלה התא דרך מסננת מתכת למיכל דגימה סטרילי חדש.יש לדלל את תרחיף התאים בנפח שווה של מדיום תרבית כדי לעצור את התגובה האנזימטית. העבר את מתלה התא לצינור חדש של 50 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב -420 גרם למשך 11 דקות בארבע מעלות צלזיוס.במידת הצורך, הכניסו את הרקמה הלא מעוכלת שנותרה לתוך שפופרת חדשה של 50 מיליליטר המכילה 20 מיליליטר של תמיסת עיכול אנזימטית טרייה וחזרו על תהליך העיכול. אם העיכול מתבצע בפעם השנייה, השאר את הצינור הראשון עם מתלה התאים על קרח. לאחר השלמת העיכול השני, שלב את שני תרחיפי התאים.לאחר צנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנטנט. ייתכן שתידרש פיפטה ידנית כדי להסיר את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא במאגר הכביסה.לאחר שטיפת התאים, חזור על תהליך הצנטריפוגה. בסוף תהליך הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של מאגר כביסה ו-35 מיליליטר של מאגר ליזה אריתרוציטים. על מנת ליז את כדוריות הדם האדומות, מערבולת קצרה של הצינור בתחילת הדגירה ובסופה.לאחר מכן, דגרו את תרחיף התאים על קרח למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, חזור על תהליך הצנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-40 מיליליטר של מאגר כביסה, ולאחר מכן העבירו את התאים דרך מסנן ניילון של 70 מיקרומטר כדי לא לכלול גושי תאים.חזור על תהליך הצנטריפוגה. שאפו את הסופרנטנט לאחר סיום הצנטריפוגה. לאחר מכן השעו מחדש את גלולת התא ב -10 מיליליטר של מדיום תרבית.ספרו את מספר התאים עם המוציטומטר בשיטת אי הכללת הצבע הכחול של טריפאן. על מנת לקבוע את הרכב סוג התא של אוכלוסיית התאים העשרוניים, פותחה אסטרטגיית שער ציטומטריית זרימת הדמיה מרובת צבעים. הניתוח מראה אי הכללה של כפילות תאים ופסולת תאים באמצעות שער סדרתי.לאחר קבלת אוכלוסיית תאים בודדים נטולת פסולת, כדאיות התא נקבעת באמצעות צבע כדאיות הניתן לתיקון. הניתוח מדגים 80% כדאיות של אוכלוסיית התאים העשרוניים הכוללת, המסומנת על ידי השער הכחול. לאחר מכן, התאים הדצידואליים המבודדים מוכתמים בנוגדנים חד-שבטיים מצומדים של עכבר פלואורופור.זאת כדי לנתח את נוכחותם של סמני תאי סטרומל, חיסוניים, אפיתל וטרופובלסט ואת צבע הכדאיות. סמנים אלה יקבעו את סוגי התאים העשרוניים. תמונות פלואורסצנטיות של זרימה ציטומטרית מדגימות תא צבוע חיובית עבור כל ארבעת הסמנים וצבע הכדאיות.לאחר מכן משתמשים בסמנים אלה כדי לקבוע את האחוז של כל סוג תא באוכלוסיית התאים העשרוניים. מעניין שתאי הסטרומה החיוביים לוימנטין מהווים את אוכלוסיית התאים הגבוהה ביותר, בעוד שכמעט ואין תאי טרופובלסטים. תוצאות אלה מדגימות את הטוהר והכדאיות הגבוהה של התאים הדצידואליים האנושיים הראשוניים המבודדים.כאן, תרשימי הנקודות שהתקבלו מראים את השער עבור אוכלוסיות סוג התאים החיוביים. בקרות פלואורסצנטיות מינוס אחד משמשות לשער מדויק של אוכלוסיות התאים העשרוניים החיוביים האמיתיים. לאחר מכן, תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב שנלכדו משמשות לאימות התוצאות הציטומטריות של הזרימה על ידי הוכחה שאוכלוסיית התאים הדצידואליים מורכבת בעיקר מתאי סטרומה חיוביים של וימנטין ללא זיהום תאי טרופובלסטים.לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שלוש שעות. לאחר הליך זה, ניתן לנתח את התאים העשרוניים במגוון דרכים כדי לבחון את ביטוי הגנים והחלבונים, מה שיכול לעזור לנו להבין טוב יותר את השינויים התאיים המתרחשים בסיבוכי הריון.

isolation-primary-human-decidual-cells-from-fetal-membranes-term

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

זיהינו את השליה כגוף hematopoietic העיקריים במהלך ההתפתחות. מצאנו כי בתאי גזע hematopoietic (HSCs) הן שנוצר הרחיב בשליה בתוך נישות microenvironmental ייחודי. כאן אנו מתארים ניסיוני בטכניקות נדרש בידוד להדמיה של HSCs את השליה העכבר.

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הנתיחה של placentae מהעכבר על ההריון d10.5, ואחרי הבידוד של תאי trophoblast באמצעות שיפוע Percoll. אז אנחנו מדגימים שימוש בתאים המבודדים בassay פלישת matrigel.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

שתי טכניקות לבידוד טיפות שומנים סלולריות מ1) תאי שמרים ו2) שליות אדם מוצגות. במרכזו של שני ההליכים הוא צנטריפוגה שיפוע הצפיפות, שבו השכבה הצפה וכתוצאה מכך המכילה טיפות ניתן דמיינו בקלות על ידי העין, שחולצה, ולכמת על ידי ניתוח כתם מערבי לטוהר.

בידוד של טיפות שומנים נייד: שתי טכניקות טיהור החל מתאי שמרים ושליות אדם

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי אפיתל מי שפיר אנושיים (hAECs) באמצעות ריאגנטים ללא מוצרים מן החי בהתאם להנחיות הנוכחיות של תנאי ייצור נאותים (cGMP).

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

מתואר כאן פרוטוקול לבידוד ומחקר נוסף של הלויקוציטים החודרים של ה-decidua basalis ו-decidua parietalis - הממשק האם-עובר האנושי. פרוטוקול זה שומר על שלמות סמני פני התא ומניב מספיק תאים ברי קיימא ליישומים במורד הזרם, כפי שהוכח על ידי ניתוח זרימה ציטומטרית.

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

המתואר כאן הוא פרוטוקול לבידוד וניתוח הלויקוציטים החודרים של רקמות בממשק האם-עובר (רחם, דצידואה ושליה) של עכברים. פרוטוקול זה שומר על שלמותם של רוב סמני פני התא ומניב מספיק תאים ברי קיימא ליישומים במורד הזרם, כולל ניתוח זרימה ציטומטרית.

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting siRNA ב cytotrophoblasts villous אדם המבודד טרי באמצעות microporation וזיהוי מתחמים-חלבון ה- DNA בתאים אלה. תאי transfected יכולים להיות במעקב על ידי כתם מערבי Emsa מנתח בזמן תרבות 4 ימים.

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

בזאת אנו מתארים שיטות לנתיחה של רקמות יולדות ועובר מן שלית מונח אנושית, ואחריו בידוד והרחבת גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) מרקמות אלה.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

כתב יד זה מציג מודל ייחודי במבחנה של תאי ציטוטרופובלסט אנושיים מטוהרים חיסונית שגודלו תחת היפוקסיה/חמצון מחדש. מודל זה מתאים לחקר ההשפעות המגנות של טיפולים מבטיחים, כגון מלטונין, על סיבוכי הריון הקשורים למתח חמצוני מוגבר ושינוי בתפקוד השליה.

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

מחקר זה מציג שגרה מאומת וממוטב עבור הבידוד של התרבות האנושית תאי סטרומה רירית הרחם לנהל במבחנה decidualization assay. יתרה מזאת, מחקר זה מספק שיטה מפורט ביעילות תמונות ציפורים גנים ספציפיים באמצעות siRNAs בתאי סטרומה רירית הרחם אדם.

לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization

פרוטוקול זה מאפשר טיהור, אפיון ותרבות של טרופובלסטים ראשוניים מסוג HLA-G+ אקסטרווילוס (EVT) מהדצידואה בזליס ומהקרום הכוריוני של שליות המונחים האנושיים. תרביות EVT ראשוניות שומרות על חיוניות למשך 96 שעות, ומאפשרות קו-קלטור עם תאי חיסון אימהיים תואמים לדגימה וניתוח זרימה ציטומטרי ומולקולרי של האינטראקציות ביניהן.

טיהור של טרופובלסטים HLA-G+ אקסטרווילוס מרקמות שליה במונחים אנושיים לצורך פנוטיפינג וניתוח תפקודי

למדו שיטה לבידוד תאים דצידואליים ראשוניים מקרומי עובר של שליית מונח. טכניקה זו מספקת תפוקה גבוהה וחיות תאים לחקר סיבוכי הריון.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

גלה סרטונים נוספים