שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

שיטות פשוטות מתוארים על הפגנת הייצור של amyloids ציטוטוקסיות בעקבות זיהום של אנדותל ריאתי על ידי Pseudomonas aeruginosa.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול הריאתי, כגון מדוע לחולים ששורדים דלקת ריאות נרכשת בבית חולים יש תוצאות גרועות כל כך לטווח הארוך? היתרון של השיטה הזו הוא שהיא פשוטה ואמינה, מה שאומר שכל מי שמגיע למעבדה יכול ללמד אותה ולמחרת הוא מייצר נתונים שימושיים וחוזרים על עצמם. למרות שניתן ליישם שיטות אנליטיות אלה כדי לספק תובנה לגבי זיהום של תאים מתורבתים במבחנה, ניתן ליישם אותן גם על מודלים של בעלי חיים וחולים אנושיים.

כדי לייצר סופרנטנט ציטוטוקסי, שטפו צלחת של 150 סנטימטר של תאי אנדותל עם HBSS, ודללו מושבת P.aeruginosa לספיגה של 0.25 ב-540 ננומטר. לדלל עוד יותר את תאי החיידקים כדי לאפשר ריבוי זיהום של 20 לאחד מכל 20 מיליליטר של HBSS ולזרוע את החיידקים על צלחת תאי האנדותל. לאחר מכן הניחו את התאים הנגועים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך ארבע עד חמש שעות.

חיוני שהדגירה של החיידקים ותאי האנדותל תתרחש למשך זמן מתאים. אם הדגירה קצרה מדי, העמילואידים לא ישוחררו לתוך הסופרנטנט. אם הדגירה ארוכה מדי, התאים למעשה יעשו ליזה וישחררו את כל התוכן שלהם לתוך הסופרנטנט.

האינדיקטור בו אנו משתמשים למשך הדגירה המתאים הוא היווצרות פערים בחד-שכבת האנדותל. כאשר ניתן להבחין בפערים בתא חד-שכבתי על ידי מיקרוסקופ אור, קצרו את הסופרנטנט לצנטריפוגה כדי להסיר כל פסולת תאית. שפכו את הסופרנטנט למזרק המצויד במסנן 0.2 מיקרון והעבירו את הסופרנטנט דרך המסנן כדי להסיר חיידקים מזהמים.

לאחר מכן הניחו בצד 1.5 מיליליטר של סופרנטנט סטרילי לבדיקת ציטוטוקסיות והקפיאו את שאר הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להעריך את הציטוטוקסיות של הסופרנטנט שנקטף, הוסף את ה-1.5 מיליליטר של סופרנטנט מעוקר מסנן לבאר אחת של צלחת שש בארות המכילה תרבית תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים. מניחים את הצלחת בחממת CO2 למשך 21 עד 24 שעות.

לאחר מכן השג תמונות של אזורים של תרבויות המטופלות והבקרה. ייבא את התמונות למאקרו imagej מותאם אישית והתאם את הניגודיות לפיקסלים רוויים של 15%. שכפל את התמונות המותאמות לניגודיות והשתמש ברקע חסר כדי לקבל תמונות בניגודיות גבוהה הן של התאים השלמים והן של אזור הפער בשדה הראייה.

הפחיתו את התמונה בעלת הניגודיות הגבוהה מהתמונה המקורית והשתמשו במחשבון התמונה ובפונקציה כדי לשלב את התמונה המתקבלת עם התמונה המקורית. השתמש בפונקציית הסף כדי להמיר את התמונה המשולבת למסיכה עם הרווחים בשחור והתאים השלמים בלבן. והשתמש בפונקציית השחיקה הבינארית כדי להסיר כל רעש מהתמונה.

לאחר מכן השתמשו בשבר השטח למדידת היחס בין פיקסלים שחורים ללבנים בתמונה שנוצרה. ולשרטט ולבטא את אזורי השברים עבור כל נקודת זמן טיפול, כאחוז מאזור הפער המקסימלי. כדי לכמת את העמילואידים בתוך הסופרנטנט, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי 50X תיאופלווין T שהוכנה ומסוננת טרי למיליליטר אחד של PBS בקובטה ספקטרופוטומטרית של מיליליטר אחד, וטען את הדגימה המדוללת על ספקטרופלואורומטר.

מדוד את פליטת הקרינה הבסיסית באמצעות עירור של 425 ננומטר. סריקת פליטת הקרינה מ-450 ל-575 ננומטר במרווחים של שני ננומטרים. לאחר מכן הגדר את המכשיר לבצע סריקת זמן-lapse באמצעות עירור של 425 ננומטר ופליטה של 482 ננומטר עם רכישת נתונים כל 0.2 שניות למשך 60 שניות.

השהה את הסריקה לאחר 20 שניות ו-10 מיקרוליטר של סופרנטנט מעוקר מסנן לקובטה. לאחר ערבוב על ידי היפוך, טען מחדש את הקובט על הספקטרופלואורומטר והמשך את הסריקה מבוססת הזמן למשך 40 השניות האחרונות. עם השלמת הזמן, בצע סריקת ספקטרום פליטות פלואורסצנטיות סופית באמצעות הגדרות הסריקה המקוריות.

התוספת P.aeruginosa לשכבות מתכנסות של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים גורמת להיווצרות פער בין התאים. באמצעות imagej כדי להעריך ציטוטוקסיות סופרנטנטית כפי שהודגם במהלך 12 השעות הראשונות של הטיפול, ניתן לדמיין חד-שכבות של תאים מתכנסים בריאים עדיין כמו כל האזורים הלבנים בתוך השדה המיקרוסקופי. עם זאת, עד 18 שעות לאחר הוספת סופרנטנט שנאסף מתרביות נגועות ב-PA 103, ניתן לזהות פערים בשכבה החד-שכבתית כאשר שטח צלחת התרבית נטול התאים גדל בצורה ליניארית עד 36 שעות טיפול, ואז כמעט ולא ניתן להבחין בתאים שלמים.

ניתן להשיג תוצאות דומות באמצעות שחרור לקטט דהידרוגנאז כסמן לציטוטוקסיות. עם לקטט דהידרוגנאז שזוהה לראשונה לאחר 18 שעות לאחר הוספת הסופרנטנט הציטוטוקסי וגדל בצורה ליניארית עד שהרג תאים מקסימלי נמדד לאחר 36 שעות. ניתן להעריך את הסופרנטנטים גם על ידי ניתוח אימונו-בלוט או על ידי מדידת השינוי בעוצמת הקרינה של תיופלבין T עקב שינויים מאשרים הנגרמים על ידי קשירת עמילואיד כדי לקבוע את נוכחותם של עמילואידים ציטוטוקסיים בסופרנטנטים.

לאחר צפייה בסרטון זה אתם אמורים להבין היטב כיצד לייצר סופרנטנטים ציטוטוקסיים בעקבות זיהום של תאי אנדותל ב-citomonsis aeruginosa. בנוסף, עליך להיות בקיא בסוגי הבדיקות הדרושות כדי לאפיין ולנתח את הציטוטוקסינים הקיימים באותם סופרנטנטים.