Name: שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: למד שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa. שיטה זו פשוטה ואמינה ליצירת נתונים חוזרים ושימושיים במחקר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן חלקים על ידי NIH מענקים HL66299 TS, RB ו SL, HL60024 ל TS, HL136869 ל MF.

כל ההליכים בבעלי חיים נבחנו, אושרה על ידי גופים מוסדיים ועדת אכפת לי חיה של אוניברסיטת דרום אלבמה, בוצעו בהתאם לתקנות הפדרלי, המדינה, והמקומיים כל. תרבויות העיקרי של עכברוש microvascular אנדותל תאי הריאות (PMVECs) התקבלו מהמתקן תא תרבות הליבה במרכז אוניברסיטת דרום אלבמה עבור ריאות ביולוגיה. תאים הוכנו באמצעות הליכים שתואר לעיל16.
1. דור של Supernatants ציטוטוקסיות
הערה: כאן, אנו משתמשים שני זנים שונים של aeruginosa פ: PA103, הכולל מערכת הפרשת השלישי סוג שלם מסוגל להעביר את exoenzymes ExoU, ExoT לתאי המטרה במהלך זיהום, ∆PcrV, אשר חסרה סוג מערכת הפרשת השלישי היא לא מסוגל העברת exoenzymes לתאי המטרה בעקבות חיסון.
<ol><li>פסים חיידקים על פלטות אגר ווגל-בונר (VB)17 ולגדול בן לילה ב 37 º C.<ol>
<li>כדי להכין צלחות, להפוך את הפתרון מניות הבא (פוגל-בונר מלחי; מניות x 10): למדוד דור 2 MgSO4, 20 גרם חומצה ציטרית (חומצה חינם), 100 גרם K2PO4ו2פו ' NaH 35 g '4. להוסיף ddH2O 1 ליטר, תא לחץ למשך 15 דקות עם פליטה איטי.</li>
		<li>הניחו 7.5 גר' אגר 450 מ ל ddH2O ואת אוטוקלב כמפורט לעיל.</li>
		<li>בעקבות autoclaving, מקום שני פתרונות לתוך אמבט מים 50 ° C להתקרר.</li>
		<li>להוסיף 50 מ של x VB 10 מניות תמיסת מלח אגר.</li>
		<li>הוספת carbenicillin µg 400/mL (עבור הזנים של aeruginosa פ בשימוש) ומערבבים היטב על ידי מתערבל את הבקבוקון.</li>
		<li>מקום 5 מ"ל של הפתרון אגר VB לתוך מנות בודדות תרבות סטרילי, לאפשר את אגר לחזק ולאחר מכן לאחסן ב 4 ° C עד היום של זריעת חיידקים.</li>
		<li>ביום של זריעת חיידקים, לחמם צלחת 37 מעלות, ואז לרוץ בעירום חיידקים על צלחת באמצעות לולאה סטרילי. המקום הצלחת ב חממה 37 ° C בלילה</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאמת PMVEC טוהר על ידי צביעת חיובית עם פלורסנט Griffonia simplicifolia לקטין, צביעת שלילי עם פלורסנט סליל pomatia לקטין (סמן תאי אנדותל עורקי). התאים aliquot, ההקפאה של חנקן נוזלי.</li>
	<li>לניסויים, לשמור על תאים בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% סרום שור עוברית, לגדל תאים חממה 37 ° C המכילה 5% CO2. להשתמש תאים פסוקים 5-15.<ol>
<li>בדור של supernatants ציטוטוקסיות, לוחית רישוי 2 x 106 תאים בודדים 150 ס"מ מנות ולגדול 3-4 ימים עד למפגש מושגת. השתמש שתי צלחות לכל ניסוי (ראו להלן).</li>
		<li>לניתוח של supernatants ציטוטוקסיות, צלחת צלחת עונה 1 פרק 105 תאים לתוך בארות בודדים של 6-באר ולגדול במשך ארבעה ימים עד למפגש מושגת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לייצר תגובת שיקוע, לשטוף את אחת המנות שני 150 ס"מ של PMVECs מ שלב 1.3.1 בתמיסת באגירה פוספט, trypsinize, ואז לספור את התאים (אנחנו להשתמש מונה הניתן תא אוטומטית, בצע את הפרוטוקול של היצרן; ראה טבלה של חומרים). לשטוף את הצלחת אחרים של PMVECs מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק), ואז להדביק עם גם מזן aeruginosa פ -ריבוי של זיהום (MOI) של 20:1. זו מושגת כדלקמן:<ol>
<li>עבור aeruginosa פ, כמנת540 0.25 = 2 x 108 CFUs/mL. כדי להכין את הדילול, להוסיף 1 מ"ל HBSS cuvette חד פעמיות 1 מ"ל. לגרד מספיק חיידקים ממני הצלחת זה הוכן בשלב 1.1 עד OD540 של 0.25 מושגת כאשר נמדד באמצעות ספקטרופוטומטרים. השלב הבא יספק חישוב של כמה יהיה צורך חיידקים.</li>
		<li>אחרי מספר PMVECs בצלחת תרבות (שלב 1.4 לעיל), לקבוע את המספר המתאים של חיידקים כדי להוסיף למנה השנייה, אי-trypsinized תרבות המכיל את PMVECs. לדוגמה, אם נקבע כי המנה התרבות של PMVECs מכיל 1.3 x 107 תאים, אז היכונו 1.3 x 107 תאים x 20 חיידקים/תא x 1 mL/2 x 108 CFUs = 1.3 mL חיידקים.</li>
		<li>לדלל mL 1.3 של חיידקים לתוך HBSS נפח סופי של 20 מ ל, כך השטח כולו של מנה 150 ס"מ יכול להתכסות בנוזלים, ולאחר מכן להוסיף את החיידקים מדולל לצלחת של PMVECs.</li>
		<li>דגירה PMVECs מחוסן עם החיידק ב 37 ° C בחממה2 CO 5% עבור 4-5 שעות, עד פערים ניתן לראות מתבצעת טפט התא כאשר הצלחת נצפית ברמה המיקרוסקופית (ראה איור 1 עבור רמה נאותה של היווצרות פער).</li>
		<li>לאסוף את תגובת שיקוע ולאחר מכן צנטריפוגה 10 דקות ב g x 2,000 ומפרידה שולחן כדי להסיר את הלכלוך הסלולר. הערה: כל צנטריפוגה מלמעלה בטבלה מסוגל g מספיק ביצירת לכפות הצניפה unlysed תאים, תא גדול שברי יכול לשמש בשלב זה.</li>
		<li>שופכים את תגובת שיקוע לתוך מזרק בעל מסנן 0.2 µm מחוברת לקצה, ואז לעבור את תגובת שיקוע דרך המסנן כדי להסיר חיידקים.</li>
		<li>השתמש של aliquot של תגובת שיקוע סטרילי כדי לבדוק את cytotoxicity (ראה 2.1) ומקפיאים את שאר תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ניתוח של Supernatants ציטוטוקסיות
<ol><li>Cytotoxicity Assay<ol>
<li>לגדול PMVECs במנות 6-ובכן עד למפגש. שטיפת בארות פעם עם HBSS, לאחר מכן להוסיף 1.5 מ של תגובת שיקוע מחוטא-מסנן (שנאסף או תאים PA103 - או ∆PcrV-מחוסן) וולס בודדים. להוסיף HBSS סטרילי טוב אחרת כפקד שלילי.</li>
		<li>למקם את הצלחת לתוך החממה2 CO עבור h 21-24, ולאחר מכן לצפות עבור תא הרג/cytotoxicity (ראה שלב הבא). להשתמש supernatants כי התערוכה cytotoxicity לניסויים נוספים, ולמחוק את אלה שאינם מציגים תא ההרג.</li>
		<li>כימות של הרג תא<ol>
<li>מדד לקטאט דהידרוגנאז (LDH) שחרור תאים מתים באמצעות ערכות Assay LDH זמינים מסחרית של היצרן המליץ הליכים.</li>
			<li>לחלופין, לכמת הרג תא ברמה המיקרוסקופית באמצעות תוכנת ImageJ. בשביל זה, להקליט תמונות מיקרוסקופיות ותחומי המנה תרבות המכיל תאים שלמים, ואז לכמת אזורי חסר תאים (מעיד על מוות של תאים ב- טפט) באמצעות מאקרו ImageJ (המכון הלאומי לבריאות) (ראה הקבצים המשלימים קידוד מותאם אישית ). אם רצונך בכך, לבצע את השלבים מאקרו באופן ידני כפי שמוצג להלן:<ol>
<li>קלט תמונות (בפורמט RGB או Tiff) לתוך המאקרו ולהתאים בניגוד ל- 15% רווי פיקסלים. לשכפל תמונות חדות מנוכים ולבצע את הפקודה "לחסר רקע" כדי לקבל תמונה בחדות גבוהה של שטח התא והן את הפער בתוך שדה הראייה.</li>
				<li>להחסיר את התמונה הזו התמונה המקורית ולשלב את התמונה המתקבלת עם התמונה המקורית באמצעות המחשבון תמונת הפונקציה "AND". להמיר את התמונה הנובעת שחור (רווחים) ומסכת לבן (תאים) עם הפונקציה הסף (מינימום 0, מקסימום 5), השתמש בפונקציה "בינארי לשחוק את" כדי להסיר רעש מתוך התמונה.</li>
				<li>למדוד את היחס בין שחור לבן פיקסלים בתוך התמונה תוצאות המדידה "אזור השבר". מגרש ולבטא את אזורי החלקי עבור כל נקודת זמן הטיפול אחוזים של אזור מרווח מקסימלי.</li>
				<li>אמצעים לחשב ולהשוות באמצעות חד-כיווני אנובה עם מבחן לאחר הוק של Tukey, עם ערכי p פחות מ- 0.05 נחשב משמעותי.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>השתמש immunoblot ניתוח להקים הנוכחות של עמילואיד, טאו oligomeric Aβ התרבות supernatants. לבצע ניתוח immunoblot באמצעות הליכים סטנדרטיים10,11,12, מלבד ריכוז supernatants התרבות 10-fold לפחות לפני אלקטרופורזה.<ol>
<li>להתרכז תגובת שיקוע, מקום 1-2 מ של תגובת שיקוע לתוך יחידה מסנן צנטריפוגה ממברנה אשר יש ניתוק של משקל מולקולרי של 10 kDa. אז, במקום יחידת מסנן לתוך צנטריפוגה מלמעלה בטבלה צנטריפוגה-2,000 x g עד מידת הריכוז הנדרש מושגת (בד כ 45-60 דקות).</li>
			<li>לקבוע את כמות חלבון מרוכז supernatant11 , לטעון כמויות שוות של מדגמים לתוך בארות בודדים של הג'ל.</li>
			<li>לבדוק תרביות, להעביר את החלבונים ניטרוצלולוזה ולאחר מכן בדיקה שהכלים עם נוגדן נגד עמילואיד A11, נוגדן אנטי oligomeric טאו T22 או נוגדן anti-Aβ MOAB2 ואחריו נוגדנים משניים המתאים. לפתח את שהכלים באמצעות הליכים chemiluminescence רגיל.</li>
		</ol>
</li>
		<li>כדי לבצע thioflavin T Assay, השתמש thioflavin T קרינה פלואורסצנטית (ThT) לכמת amyloids ב supernatants. עבור מדידות אלה, השתמש supernatants עיקור-מסנן.<ol>
<li>להכין פתרון מניות (50 x) של thioflavin T על ידי השעיית 8 מ ג thioflavin T (ThT) לתוך 10 מ ל תמיסת מלח פוספט buffered (PBS). לאחר ערבוב, לסנן את הפתרון דרך מסנן מיקרומטר 0.22 להסיר חלקיקים.</li>
			<li>למדידות, להוסיף µL 20 מניות ThT 1 מ"ל של PBS ב cuvette ספקטרופוטומטרים 1 מ"ל. למקם את הדגימה מדוללת spectrofluorimeter.</li>
			<li>למדוד פליטת קרינה פלואורסצנטית בסיסית באמצעות עירור nm 425 וסריקה של פליטת קרינה פלואורסצנטית מ 450-575 nm במרווחים של 2 ננומטר.</li>
			<li>בצע סריקה זמן לשגות באמצעות עירור nm 425 ונרכשה 482 פליטה ננומטר, עם נתונים כל 0.2 s 60 s.</li>
			<li>ה-20 הראשונית s של הסריקה זמן לשגות מודד קרינה פלואורסצנטית ב cuvette ריק. בגיל 20 s, להשהות את הסריקה ולהוסיף 10 µL של תגובת שיקוע עיקור מסנן cuvette. לערבב את cuvette על ידי היפוך ולאחר מכן מקם חזרה spectrofluorimeter.</li>
			<li>לחדש את הסריקה מבוססי-זמן, רכישת ה-40 הסופי s של נתונים.</li>
			<li>עם סיום הסריקה זמן לשגות, בצע סריקה ספקטרום פליטה פלורסצנטיות הסופי באמצעות הגדרות זהות, כמפורט 2.1.5.3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pneumonia+really+the+old+man%27s+friend%3F+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li>
<li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li>
<li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+respiratory+tract+infections+and+risk+of+first-time+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction.</a> Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).</li>
<li>Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-term+survival+after+hospitalization+with+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia.</a> Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).</li>
<li>Yende, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+markers+at+hospital+discharge+predict+subsequent+mortality+after+pneumonia+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis.</a> Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+hospitalization+for+pneumonia+and+subsequent+risk+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Med+Assoc%22%5BJournal%5D)">Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease.</a> J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exoenzyme+S+regulon+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).</li>
<li>Engel, J., Balachandran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Pseudomonas+aeruginosa+type+III+effectors+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease.</a> Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).</li>
<li>Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y+is+a+promiscuous+cyclase+that+increases+endothelial+tau+phosphorylation+and+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability.</a> J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).</li>
<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343(2013).</li>
<li>Morrow, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exoenzymes+U+and+Y+induce+a+transmissible+endothelial+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Molec+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).</li>
<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible%2C+cytotoxic+prion+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li>
<li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Molec+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer+Dis+Assoc+Disord%22%5BJournal%5D)">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li>
<li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie%3A+Uncertainties%2C+biology%2C+and+molecular+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li>
<li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li>
<li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li>
</ol>

לא לדווח.

. הנה, שיטות פשוטות במבחנה מתוארים אשר מאפשרים הפגנה של הדור של amyloids ציטוטוקסיות במהלך זיהום עם דלקת ריאות גורמת האורגניזם. שיטות אלה כוללים תא תרבות cytotoxicity assay, immunoblotting, כימות של תא להרוג באמצעות שיטת מיקרוסקופיים הרומן, ThT מחייב. ניתוחים של הסוכנים ציטוטוקסיות הוכיחו כי הם עמילואיד בטבע (איור 2 , איור 4), מייצגים מאפיינים של פריון12. הדור של מולקולות פריון ציטוטוקסיות במהלך דלקת ריאות מספק...

חולים ששרדו דלקת ריאות. רוממתם שיעורי התמותה בחודשים שלאחר החולים פריקה1,2,3,4,5,6. ברוב המקרים, מוות מתרחשת על ידי סוג של כשל איברים סוף כולל כליות, ריאות, לב, או אירועים הכבד, כמו גם קו5,6. הסיבה שיעור התמותה גבוה באוכלוסיית חולים זו מעולם לא נקבעה.
דלקת ריאות מסווג כ להיות גם הקהילה רכשה או רכשה החולים (nosocomial), סוכנים שיכולים לגרום לדלקת ריאות כוללים חיידקים, וירוסים, פטריות וכימיקלים. אחד הגורמים העיקריים של דלקת ריאות nosocomial הוא החיידק Pseudomonas aeruginosa. Aeruginosa פ הוא אורגניזם גראם שליליים המשתמשת מערכת הפרשת סוג III להעברת מולקולות אפקטור שונים, הנקרא exoenzymes, ישירות אל הציטופלסמה של היעד תאים7,8. במהלך זיהום של תאי אנדותל הריאות, exoenzymes המטרה חלבונים תאיים שונים, לרבות צורת אנדותל הקשורים microtubule חלבון טאו9,10,11,12 , המוביל אל המכשול אנדותל התמוטטות וכתוצאה מכך בצקת ריאות חמורה, ירד תפקוד ריאתי ומוות, לעיתים קרובות,.
כאמור, חולים ששרדו ריאות הראשונית רוממתם שיעורי התמותה ב-12 החודשים הראשונים לאחר הפרשות חולים. מנגנון פוטנציאליים על ההסבר לתופעה זו הוא כי סוג כלשהו של רעל מאריכים נוצר במהלך זיהום ראשוני שמוביל לתוצאות המסכן. שתי תצפיות תומכים האפשרות הזו. ראשית, בתרבית ריאתי אנדותל תאים שטופלו בתחילה aeruginosa פ להיכשל להתרבות במשך שבוע לאחר החיידקים מומתים על ידי אנטיביוטיקה13. שנית, מאריכים prions וסוכנים עם מאפיינים פריון הוכחו מחלות האדם ושל בעלי החיים השונים, בעיקר מחלות הקשורות למערכת העצבים ה-14,15.
שיטות לבחינת פוטנציאל הייצור של סוכנים ציטוטוקסיות חיים ארוכים במהלך זיהום ריאתי לא תוארו. כאן סדרה של מבחני פשוטה במבחנה מתוארים שניתן להשתמש בו עבור חוקרים cytotoxin ייצור ופעילות בעקבות זיהום באמצעות סוכן גורם משותף דלקת ריאות, aeruginosa פ. מבחני אלה צריך להיות להתאמה בקלות לחקור אינדוקציה cytotoxin אפשרי בעקבות זיהום באמצעות חומרים אחרים הגורמים לדלקת ריאות, supernatants שנוצרו גם צריך להיות שימושי עבור חוקרים תופעות של cytotoxins כולה איברים או בעלי חיים. בסופו של דבר, מבחני המפורטות כאן ככל הנראה תהיה יכולת הסתגלות כדי לבדוק נוזלים ביולוגיים בעלי חיים ועל האדם לייצור cytotoxins במהלך דלקת ריאות.

<table><tbody><tr><td>ארנב אנטי בטא עמילואיד</td><td>תרמו</td><td>71-5800</td><td></td></tr><tr><td>A11 נוגדן עמילואיד אוליגומר</td><td>StressMarq</td><td>SPC-506D</td><td></td></tr><tr><td>T22 נוגדן נגד טאו אוליגומר</td><td>EMD Millipore</td><td>ABN454</td><td></td></tr><tr><td>תיופלווין T</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>מסנני מזרק 0.22 מיקרון</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HRP עיזים נגד ארנב IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721-1</td><td></td></tr><tr><td>זנים PA103 ו-&Delta; PcrV</td><td></td><td></td><td>זנים אלה של P. aeruginosa התקבלו מד"ר דארה פרנק, המכללה הרפואית של אוניברסיטת ויסקונסין, מילווקי, WI</td></tr><tr><td>FITC גריפוניה לקטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L9381</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Helix pomatia לקטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L1261</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>פישר</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>0.22 מיקרון ניטרוצלולוז</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 2</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Hyclone</td><td>SH30898.03IH</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin מלח דיסודיום</td><td>Sigma&nbsp;</td>רכזי מיקרוצטריפוגה <td>C1389</td><td></td></tr>- <tr><td>10,000 מגה-וואט</td><td>ניתוק Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט די-בסיסי</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>795496-500G</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום פוספט heptahydrate</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>MP021914221</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>G Biosciences</td><td>50-103-5801</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>S9506-500G</td><td></td></tr><tr><td>רוזנת מונה תאים אוטומטי</td><td>Invitrogen</td><td>C10277</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

חולים ששרדו דלקת ריאות רוממתם שיעורי התמותה בחודשים שלאחר השחרור החולים. זה היה שיערו כי דלקת של רקמת הריאה במהלך דלקת ריאות תוצאות בייצור של cytotoxins חיים ארוכים זה יכול להוביל לכשל איברים סיום עוקבות. פיתחנו במבחנה מבחני כדי לבדוק את ההשערה כי cytotoxins מיוצרים במהלך זיהום ריאתי. תאי אנדותל הריאות עכברוש מבודד, החיידק Pseudomonas aeruginosa משמשים מודל מערכות, והפגינו הייצור של cytoxins בעקבות זיהום של תאי אנדותל על ידי החיידקים היא באמצעות תרבית תאים ואחריו כימות ישירה באמצעות מבחני לקטט דהידרוגנאז שיטה מיקרוסקופיים ניצול טכנולוגיית ImageJ. מהות עמילואיד cytotoxins האלה הודגם על ידי מבחני הכריכה T thioflavin על ידי immunoblotting ו- immunodepletion באמצעות נוגדן נגד עמילואיד A11. ניתוחים נוספים באמצעות immunoblotting הפגינו טאו oligomeric ו- Aβ המיוצר ושוחרר על ידי תאי אנדותל בעקבות זיהום aeruginosa פ. שיטות אלה צריך להיות בקלות להתאמה ניתוחים של דגימות קליניות אנושי.

Assay פשוטה במבחנה פותחה כדי assay לנוכחות של cytotoxins ב supernatants של תאים נגועים החיידק aeruginosa פ. בעיקרון, האמצעי התרבות תאים נגועים נאסף 4 שעות לאחר תוספת חיידקים, החיידקים יוסרו על ידי מסנן עיקור של התרבות supernatant, ואז תגובת שיקוע סטרילי מתווסף אוכלוסיה חדשה של תאים. התאים ואז שנצפו 21-24 שעות לאחר התוספת של תגובת שיקוע, הרג תא הוא לכמת.
תוספת של aeruginosa פ לשכבות confluent של PMVECs ...

שיטות פשוטות מתוארים על הפגנת הייצור של amyloids ציטוטוקסיות בעקבות זיהום של אנדותל ריאתי על ידי Pseudomonas aeruginosa.

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול הריאתי, כגון מדוע לחולים ששורדים דלקת ריאות נרכשת בבית חולים יש תוצאות גרועות כל כך לטווח הארוך? היתרון של השיטה הזו הוא שהיא פשוטה ואמינה, מה שאומר שכל מי שמגיע למעבדה יכול ללמד אותה ולמחרת הוא מייצר נתונים שימושיים וחוזרים על עצמם. למרות שניתן ליישם שיטות אנליטיות אלה כדי לספק תובנה לגבי זיהום של תאים מתורבתים במבחנה, ניתן ליישם אותן גם על מודלים של בעלי חיים וחולים אנושיים.כדי לייצר סופרנטנט ציטוטוקסי, שטפו צלחת של 150 סנטימטר של תאי אנדותל עם HBSS, ודללו מושבת P.aeruginosa לספיגה של 0.25 ב-540 ננומטר. לדלל עוד יותר את תאי החיידקים כדי לאפשר ריבוי זיהום של 20 לאחד מכל 20 מיליליטר של HBSS ולזרוע את החיידקים על צלחת תאי האנדותל. לאחר מכן הניחו את התאים הנגועים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך ארבע עד חמש שעות.חיוני שהדגירה של החיידקים ותאי האנדותל תתרחש למשך זמן מתאים. אם הדגירה קצרה מדי, העמילואידים לא ישוחררו לתוך הסופרנטנט. אם הדגירה ארוכה מדי, התאים למעשה יעשו ליזה וישחררו את כל התוכן שלהם לתוך הסופרנטנט.האינדיקטור בו אנו משתמשים למשך הדגירה המתאים הוא היווצרות פערים בחד-שכבת האנדותל. כאשר ניתן להבחין בפערים בתא חד-שכבתי על ידי מיקרוסקופ אור, קצרו את הסופרנטנט לצנטריפוגה כדי להסיר כל פסולת תאית. שפכו את הסופרנטנט למזרק המצויד במסנן 0.2 מיקרון והעבירו את הסופרנטנט דרך המסנן כדי להסיר חיידקים מזהמים.לאחר מכן הניחו בצד 1.5 מיליליטר של סופרנטנט סטרילי לבדיקת ציטוטוקסיות והקפיאו את שאר הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להעריך את הציטוטוקסיות של הסופרנטנט שנקטף, הוסף את ה-1.5 מיליליטר של סופרנטנט מעוקר מסנן לבאר אחת של צלחת שש בארות המכילה תרבית תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים. מניחים את הצלחת בחממת CO2 למשך 21 עד 24 שעות.לאחר מכן השג תמונות של אזורים של תרבויות המטופלות והבקרה. ייבא את התמונות למאקרו imagej מותאם אישית והתאם את הניגודיות לפיקסלים רוויים של 15%. שכפל את התמונות המותאמות לניגודיות והשתמש ברקע חסר כדי לקבל תמונות בניגודיות גבוהה הן של התאים השלמים והן של אזור הפער בשדה הראייה.הפחיתו את התמונה בעלת הניגודיות הגבוהה מהתמונה המקורית והשתמשו במחשבון התמונה ובפונקציה כדי לשלב את התמונה המתקבלת עם התמונה המקורית. השתמש בפונקציית הסף כדי להמיר את התמונה המשולבת למסיכה עם הרווחים בשחור והתאים השלמים בלבן. והשתמש בפונקציית השחיקה הבינארית כדי להסיר כל רעש מהתמונה.לאחר מכן השתמשו בשבר השטח למדידת היחס בין פיקסלים שחורים ללבנים בתמונה שנוצרה. ולשרטט ולבטא את אזורי השברים עבור כל נקודת זמן טיפול, כאחוז מאזור הפער המקסימלי. כדי לכמת את העמילואידים בתוך הסופרנטנט, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי 50X תיאופלווין T שהוכנה ומסוננת טרי למיליליטר אחד של PBS בקובטה ספקטרופוטומטרית של מיליליטר אחד, וטען את הדגימה המדוללת על ספקטרופלואורומטר.מדוד את פליטת הקרינה הבסיסית באמצעות עירור של 425 ננומטר. סריקת פליטת הקרינה מ-450 ל-575 ננומטר במרווחים של שני ננומטרים. לאחר מכן הגדר את המכשיר לבצע סריקת זמן-lapse באמצעות עירור של 425 ננומטר ופליטה של 482 ננומטר עם רכישת נתונים כל 0.2 שניות למשך 60 שניות.השהה את הסריקה לאחר 20 שניות ו-10 מיקרוליטר של סופרנטנט מעוקר מסנן לקובטה. לאחר ערבוב על ידי היפוך, טען מחדש את הקובט על הספקטרופלואורומטר והמשך את הסריקה מבוססת הזמן למשך 40 השניות האחרונות. עם השלמת הזמן, בצע סריקת ספקטרום פליטות פלואורסצנטיות סופית באמצעות הגדרות הסריקה המקוריות.התוספת P.aeruginosa לשכבות מתכנסות של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים גורמת להיווצרות פער בין התאים. באמצעות imagej כדי להעריך ציטוטוקסיות סופרנטנטית כפי שהודגם במהלך 12 השעות הראשונות של הטיפול, ניתן לדמיין חד-שכבות של תאים מתכנסים בריאים עדיין כמו כל האזורים הלבנים בתוך השדה המיקרוסקופי. עם זאת, עד 18 שעות לאחר הוספת סופרנטנט שנאסף מתרביות נגועות ב-PA 103, ניתן לזהות פערים בשכבה החד-שכבתית כאשר שטח צלחת התרבית נטול התאים גדל בצורה ליניארית עד 36 שעות טיפול, ואז כמעט ולא ניתן להבחין בתאים שלמים.ניתן להשיג תוצאות דומות באמצעות שחרור לקטט דהידרוגנאז כסמן לציטוטוקסיות. עם לקטט דהידרוגנאז שזוהה לראשונה לאחר 18 שעות לאחר הוספת הסופרנטנט הציטוטוקסי וגדל בצורה ליניארית עד שהרג תאים מקסימלי נמדד לאחר 36 שעות. ניתן להעריך את הסופרנטנטים גם על ידי ניתוח אימונו-בלוט או על ידי מדידת השינוי בעוצמת הקרינה של תיופלבין T עקב שינויים מאשרים הנגרמים על ידי קשירת עמילואיד כדי לקבוע את נוכחותם של עמילואידים ציטוטוקסיים בסופרנטנטים.לאחר צפייה בסרטון זה אתם אמורים להבין היטב כיצד לייצר סופרנטנטים ציטוטוקסיים בעקבות זיהום של תאי אנדותל ב-citomonsis aeruginosa. בנוסף, עליך להיות בקיא בסוגי הבדיקות הדרושות כדי לאפיין ולנתח את הציטוטוקסינים הקיימים באותם סופרנטנטים.

methods-for-detecting-cytotoxic-amyloids-following-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Balczon, R., et al. שיטות לאיתור עמילואידים ציטוטוקסיים בעקבות זיהום של תאי אנדותל ריאתיים על ידי Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לכימות עמילואידים בתרבית סופרנטנטים מתאי אנדותל ריאתיים הנגועים בחיידקים אלימים, באמצעות תיופלווין T, צבע פלואורסצנטי הנקשר למבני יריעות בטא עמילואיד. עלייה בקרינה בהשוואה לקו הבסיס מצביעה על נוכחות של עמילואידים בתרבית.

כימות עמילואידים הנגרמים על ידי זיהום חיידקי באמצעות פלואורסצנציה של תיופלבין T

מקור: Balczon, R., et al. שיטות לאיתור עמילואידים ציטוטוקסיים בעקבות זיהום של תאי אנדותל ריאתיים על ידי Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את ההליך ליצירת סופרנטנט ציטוטוקסי מתאי אנדותל ריאתיים לאחר זיהום ב-Pseudomonas aeruginosa. הוא מתאר כיצד חלבוני אפקטור חיידקיים משבשים את מבנה התא המארח וגורמים לשחרור של אוליגומרים עמילואידים ציטוטוקסיים לתוך הסופרנטנט.

השגת עמילואידים ציטוטוקסיים בעקבות זיהום חיידקי של תאי אנדותל ריאתיים של חולדות

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך...

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

פיתחנו מודל פגיעה ריאתית של עכבר על ידי הזרקה תוך-קנה של חיידקים Pseudomonas aeruginosa. מודל זה מחקה פגיעה ריאתית במהלך דלקת ריאות והוא רלוונטי מבחינה קלינית.

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

כאן, אנו מתארים את ההכנה והשימוש תחקיר מבוססי פעילות (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-י.ל.] carbamate) המאפשר איתור וכימות של צורה פעילה של amidase החומצה המעודד דלקת אנזים N -acylethanolamine (NAAA), הוא במבחנת vivo לשעבר.

הכנה<em&gt; In vivo</em&gt; השתמש של Probe פעילות מבוססת עבור<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine חומצה Amidase

כאן, אנו מתארים מצב גדילה לתרבות המשתנה המושבה הקטנה של הפסאודומונס aeruginosa. כמו כן, אנו מתארים שתי שיטות נפרדות לאיתור וכימות של הייצור המיוצר על ידי P. aeruginosa באמצעות חומצה אוראלה מסורתי בזולה ומעין נוגדן חד-שבטיים ספציפי קילוף פלסטיצידיות (mab) מבוסס אליסה.

תרבות של וריאציה של המושבה הקטנה של הפסאודומונס וככמת של האלגיאט

אנו מתארים פרוטוקול עבור מודל תלת מימדי של שיתוף תרבות של דרכי הנשימה הנגועות, באמצעות CFBE41o- תאים, מקרופאגים THP-1, ו פסאודומונס aeruginosa, הוקמה בממשק אוויר נוזלי. מודל זה מספק פלטפורמה חדשה כדי לבדוק בו זמנית יעילות אנטיביוטיקה, פונקציית מחסום אפיתל, סמנים דלקתיים.

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

עמידות לאנטיביוטיקה בקרב זני Escherichia coli פולשניים דבקים מהווה אתגרים בהערכת פלישה חיידקית באמצעות בדיקת הגנה מסורתית של ג'נטמיצין. מתוארת שיטה משופרת להערכת פלישת חיידקים באופן כמותי על ידי מניית יחידות יוצרות מושבות ובאופן איכותי באמצעות הדמיה של תאים נגועים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אימונופלואורסצנציה.

בדיקת הגנה על אמיקצין לכימות והדמיה של פלישת תאי אשריכיה קולי

מאמר זה מתאר שיטות שונות של...

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

למד שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa. שיטה זו פשוטה ואמינה ליצירת נתונים חוזרים ושימושיים במחקר.

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

גלה סרטונים נוספים