כימות של צמיחה תאיים בתוך המקרופאגים הוא מהיר, שיטה אמינה להערכת של התקפה אלימה של טפילים לישמניה

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להעריך את האלימות של זני לישמניה שונים באמצעות זיהום של מקרופאגים שמקורם במח עצם עכברים במבחנה, וכימות לאחר מכן של קינטיקה של גדילה תוך תאית של טפיל. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח לגבי הגורמים הן מהמקרופאג של המארח והן מהפתוגן שקובעים את האלימות של טפילי הלישמניה המדבקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה מהירה, חסכונית ואמינה הדורשת פחות בעלי חיים באופן משמעותי, בהשוואה למחקרי in vivo.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול בלישמניאזיס, שכן ניתן להשתמש בה כדי להעריך את ההדבקה של זני לישמניה, או את היעילות של תרכובות טיפוליות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד את בידוד המקרופאגים שמקורם במח העצם ואת שלבי הכימות של הטפיל התוך-תאי מפרוטוקולים כתובים בלבד. התחל בהצמדת עכבר נקבה בן ארבעה עד שישה שבועות ללוח נתיחה וחיטוי החיה באתנול 70%.

השתמש במספריים כדי לבצע חתך של סנטימטר אחד ליד מפרק ירך אחד ולחתוך את העור לאורך כל הדרך סביב המפרק. משוך את העור מהרגל לכיוון הקרסול כדי להסיר בזהירות את הגפה, וחתך את כף הרגל במפרק הקרסול או מתחתיו כדי להשאיר את השוקה בטקט. כדי לאתר את מפרק הירך, תפעל את עצם הירך כדי לזהות את נקודת הסיבוב, והשתמש במספריים כדי לחתוך את הרגל מעל מפרק הירך, ולהשאיר את הראש הפרוקסימלי של עצם הירך בטקט.

הסר כמה שיותר שרירים ורקמות חיבור מהרגל, והניח את העצמות הנקיות בצלחת פטרי המכילה RPMI סטרילי בתוספת אנטיביוטיקה על קרח. לאחר קצירת הסט השני של עצמות הרגליים, השתמש במלקחיים מעוקרים ובלהב מספר עשר כדי להסיר את כל השרירים ורקמות החיבור שנותרו. העבירו את העצמות הנקיות למכסה ריק של צלחת פטרי, והשתמשו באזמל כדי להסיר את שני הקצוות של כל שוק כדי לגשת למח.

בעזרת מלקחיים, הניחו שוק אחת מעל פיו של צינור חרוטי של 50 מיליליטר על קרח, והכניסו קצה של מחט בגודל 25 המחוברת למזרק של 10 מיליליטר מלא במדיום בתוספת אנטיביוטיקה לקצה אחד של השוקה. שטפו כחמישה עד 10 מיליליטר של מדיום דרך העצם לתוך הצינור החרוטי עד שכל רקמת מח העצם האדומה נקצרה והעצם נראית לבנה. לאחר איסוף כל מח העצם, יש לצנטריפוגה את מח העצם המאוגד, ולהשעות מחדש את לוח תאי מח העצם בחמישה מיליליטר של מדיום מקרופאגים שמקורו במח העצם.

העבירו את תרחיף תאי מח העצם לבקבוק תרבית תאים בגודל 175 סנטימטר רבוע המכיל 60 מיליליטר של מדיום מקרופאגים סטרילי שמקורו במח עצם, ושטפו את הצינור פעמיים עם מדיום מבקבוק התרבית כדי להבטיח התאוששות תאים מקסימלית. לאחר הכביסה השנייה, העבירו כמות של 30 מיליליטר של תאים לבקבוק תרבית תאים שני בגודל 175 סנטימטר רבוע, וסגרו כל בקבוק עם מכסה פילטר. לאחר מכן, דגרו על שתי התרביות בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר הפרדה של המקרופאגים המקומיים מכל פיברובלסטים מזהמים או תאים דבקים אחרים.

למחרת בבוקר, העבירו 10 מיליליטר של סופרנטנט המכיל תאי מח עצם לא ממוינים מכל בקבוק לצלחות פוליסטירן פטרי בודדות בגודל 100 על 15 מילימטר שטופלו בתרבית רקמה, והחזירו את התאים לאינקובטור תרבית התאים למשך יומיים-שלושה נוספים. לאחר מכן, האכילו את התרביות בחמישה מיליליטר של מדיום מקרופאגים טרי שמקורו במח עצם של 37 מעלות צלזיוס לכל מנה, והחזירו את הצלחות לחממה. ביום השביעי או השמיני לאחר התרבית, השתמש בקצה שאיפה המותאם לקו ואקום כדי להעביר ארבע החלקות כיסוי זכוכית מעוקרות של 12 מילימטר לתחתית כל באר של צלחת תרבית של שש בארות ללא חפיפה.

הכן צלחות זהות לכל נקודת זמן של הניסוי. לאחר מכן, שטפו את תרביות המקרופאגים שמקורן במח העצם פעמיים עם PBS טרי של 37 מעלות צלזיוס וחמישה מיליליטר PBS ללא סידן ומגנזיום בתוספת EDTA מילימולר אחד לכל צלחת. לאחר חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, אסוף את התאים המנותקים בצינור חרוטי של 50 מיליליטר, ושטוף כל צלחת פעמיים עם חמישה מיליליטר נוספים של PBS ללא סידן ומגנזיום.

לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את המקרופאגים בחמישה עד 10 מיליליטר של מדיום מקרופאגים טרי שמקורו במח עצם על קרח. לאחר הספירה, יש לדלל את התאים לחמש פעמים 10 עד חמישית לריכוז מיליליטר במדיום מקרופאגים טרי שמקורו במח עצם, ולהוסיף שני מיליליטר תאים לבאר לצלחת שש הבארות. לאחר מכן, דגרו את התאים למשך הלילה בחממת תרבית התאים.

כדי להדביק את התאים ב-L.amazonesis, יש לדלל את תרחיף הטפיל לריבוי הניסוי המתאים של זיהום, ולהוסיף 50 עד 100 מיקרוליטר של טפילים לכל באר של כל שש לוחות הבאר, כולל כל נקודות הזמן של הניסוי. דגרו את המקרופאגים שמקורם במח העצם לתקופת ההדבקה והטמפרטורה המתאימים. לאחר מכן, שטפו את הבארות שלוש פעמים עם שני מיליליטר PBS טרי של 37 מעלות צלזיוס ללא סידן או מגנזיום לבאר, וקבעו את דגימות נקודת הזמן הראשוניות עם 1.5 עד 2 מיליליטר של 2% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות.

עבור הצלחות המתאימות לנקודות הזמן המאוחרות יותר, הוסף שני מיליליטר של מדיום מקרופאג טרי שמקורו במח עצם לכל באר, והחזיר את הצלחות לחממה המתאימה. לאחר מכן, תקן ושטוף את התאים עבור כל אחת מנקודות הזמן הנותרות, כפי שהודגם זה עתה, ואחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס ב-PBS טרי. כדי להכתים את התאים ב-DAPI, החלף את הסופרנטנט ב-1.5 מיליליטר PBS טרי ללא סידן ומגנזיום, בתוספת חומר ניקוי לא יוני של 0.1% למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש שטיפות של שני מיליליטר עם PBS ללא סידן או מגנזיום.

לאחר מכן, צבעו את התאים בשני מיקרוגרם למיליליטר DAPI במיליליטר אחד של PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש כביסות, הנח את הכיסוי מחליק את צד התא כלפי מטה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית בודדת המותקנת עם מגיב הרכבה מסחרי נגד דהייה. לאחר מכן, כדי לכמת את מספר התאים הנגועים, השתמש במטרת שמן הזרם פי 100 של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומונה ידני כדי לזהות את מספר גרעיני האמסטיגוטים הקטנים יותר המקובצים סביב כל גרעין צבוע DAPI גדול.

ללישמנייה יש שתי צורות זיהומיות, פרומסטיגוטים מטציקליים, הנבדלים מפרומאסטיגוטים פרוציקליים בשלב הנייח של התרבית, ואמסטיגוטה, הצורה הזיהומית התוך-תאית הנמצאת בתוך מארח החולייתנים. כאן, ניתן לדמיין אמסטיגוטים מובחנים אקסנית בתוך מקרופאג שמקורו במח עצם שעה לאחר ההדבקה הראשונית ולפני היווצרות ואקואולים טפיליים באמצעות איחוי פגוליזוזומלי. לאחר 48 שעות, ניתן להבחין בוואקואולים טפילים גדולים מובהקים המכילים טפילים מרובים, האופייניים לזיהום לישמניה.

לעומת זאת, פרומסטיגוטים לא אלימים אינם מסוגלים ליזום התפתחות ואקואול טפילית, אינם מצליחים להשתכפל, ובסופו של דבר נהרגים בתוך מקרופאגים מארחים. בניסוי זה, נצפתה עלייה מתמדת במספר טפילי הלישמניה המטאציקליים התוך-תאיים עד 72 שעות לאחר ההדבקה, בעוד שנמדדה צמיחה תוך-תאית מועטה עד ללא צמיחה של טפילים מוטנטיים עם פגיעה ביבוא ברזל מיטוכונדריאלי לקוי, מה שמצביע על כך שנדרשת פעילות מיטוכונדריאלית לצמיחת טפילים בתוך מקרופאגים. זיהומי מקרופאגים שבוצעו עם אמסטיגוטים אקסניים מסוג בר ומוטנטי הראו דפוס גדילה תוך תאי דומה לזה שנצפה עם פרומסטיגוטים מטציקליים, אך עם זיהום טפילי מסוג בר גבוה עוד יותר ממה שנראה מפרובסטיגוטים מטציקליים.

חשוב לציין שיש עיכוב ראשוני של 24 שעות לזיהומים פרומסטיגוטים מטציקליים, המייצג את הזמן הדרוש לפרומאסטיגוטים מטאציקליים מופנמים להתמיין תחילה לאמסטיגוטים לפני שהם מתחילים להשתכפל. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 15 יום אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בזני העכבר המתאימים ולבצע כימות זהיר הן של תאי המקרופאג והן של תאי הטפיל כדי להבטיח MOIs עקביים בכל הניסויים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבית מקרופאגים שמקורם במח עצם ולהדביק אותם בלישמניה לצורך כימות צמיחת הטפיל התוך-תאי שלהם, לאחר צביעה גרעינית ב-DAPI. אל תשכח שעבודה עם ליסמניה עלולה להיות מסוכנת ביותר, וכי יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש בארון בטיחות ביולוגי, וציוד מגן אישי, והימנעות ממכשירים חדים בעת ביצוע הליך זה.