Name: דור של Huntingtin Exon1 טבעית, לא מתויגות מונומר, הסיבים משתמש באסטרטגיה פיוזן סומו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: למד פרוטוקול לייצור מונומרים וסיבים של Huntingtin ללא תגית באמצעות אסטרטגיית פיוז'ן SUMO. שיטה זו משפרת שחזוריות ומאפשרת מחקר מבני ופונקציונלי של חלבונים הנוטים להתקבצות במחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן בעיקר על ידי מענקים קרן CHDI, הקרן הלאומית למדע שוויצרי. אנו מודים ד ר סופי Vieweg לדיונים שימושי במהלך הפיתוח של מערכת חדשה זו הביטוי ואת שאר חברי הקבוצה Lashuel לשיתוף ניסיונם עם מערכת זו ביטוי ועל המשוב שלהם קלט ובעל ערך. אנו מודים גם פרופסור אוליבר Hantschel עבור מספקים את פלסמיד ULP1. המחברים תודה ד ר ג'ון B. וורנר, ד ר יצחק ק' Thangaraj על סקירה ביקורתית של כתב היד

<ol><li>Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Biology of Huntingtin.</a> Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).</li>
<li>MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14528049">Huntington's disease.</a> Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).</li>
<li>Li, S., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+contribute+to+the+pathogenesis+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 1, 19(2006).</li>
<li>DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+Huntingtin+in+Neuronal+Intranuclear+Inclusions+and+Dystrophic+Neurites+in+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Sathasivam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+splicing+of+HTT+generates+the+pathogenic+exon+1+protein+in+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).</li>
<li>Mangiarini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+1+of+the+HD+gene+with+an+expanded+CAG+repeat+is+sufficient+to+cause+a+progressive+neurological+phenotype+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice.</a> Cell. 87 (3), 493-506 (1996).</li>
<li>El-Daher, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+proteolysis+releases+non-polyQ+fragments+that+cause+toxicity+through+dynamin+1+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation.</a> EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).</li>
<li>Lunkes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases+acting+on+mutant+Huntingtin+generate+cleaved+products+that+differentially+build+up+cytoplasmic+and+nuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions.</a> Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intein-based+Strategy+for+the+Production+of+Tag-free+Huntingtin+Exon+1+Proteins+Enables+New+Insights+into+the+Polyglutamine+Dependence+of+Httex1+Aggregation+and+Fibril+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Georgalis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+aggregation+monitored+by+dynamic+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+polyglutamine-containing+huntingtin+fragments+into+amyloid-like+fibrils%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).</li>
<li>Muchowski, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+and+hsp40+chaperones+can+inhibit+self-assembly+of+polyglutamine+proteins+into+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).</li>
<li>Heiser, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+huntingtin+fibrillogenesis+by+specific+antibodies+and+small+molecules%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).</li>
<li>Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+nuclear+or+cytoplasmic+protein+aggregates+precedes+inclusion+body+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation.</a> Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).</li>
<li>Tam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperonin+TRiC+blocks+a+huntingtin+sequence+element+that+promotes+the+conformational+switch+to+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).</li>
<li>Nekooki-Machida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+conformations+of+in+vitro+and+in+vivo+amyloids+of+huntingtin-exon1+show+different+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).</li>
<li>Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+and+Hsp40+attenuate+formation+of+spherical+and+annular+polyglutamine+oligomers+by+partitioning+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).</li>
<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+recognize+distinct+conformational+epitopes+formed+by+polyglutamine+in+a+mutant+huntingtin+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).</li>
<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+huntingtin+fragments+form+oligomers+in+a+polyglutamine+length-dependent+manner+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).</li>
<li>Nucifora, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+potentially+toxic+oligomers+formed+in+vitro.+from+mammalian-derived+expanded+huntingtin+exon-1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).</li>
<li>Dahlgren, P. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17292058">Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation.</a> Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).</li>
<li>Poirier, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+spheroids+and+protofibrils+as+precursors+in+polyglutamine+fibrilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).</li>
<li>Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction+imaging+of+huntingtin+protein+aggregates+by+fluorescence+blink-microscopy+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy.</a> Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).</li>
<li>Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+alpha-synuclein+and+huntingtin+exon+1+assemblies+are+toxic+to+the+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells.</a> Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).</li>
<li>Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+between+the+chaperone+Hsc70+and+the+N-terminal+flank+of+huntingtin+exon+1+modulates+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).</li>
<li>Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-State+Nuclear+Magnetic+Resonance+on+the+Static+and+Dynamic+Domains+of+Huntingtin+Exon-1+Fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils.</a> Biochemistry. 54 (25), 3942-3949 (2015).</li>
<li>Malakhov, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+fusions+and+SUMO-specific+protease+for+efficient+expression+and+purification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Function+Genomics%22%5BJournal%5D)">SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins.</a> Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).</li>
<li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).</li>
<li>Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+X-ray+Diffraction+Dataset+for+Bacillus+licheniformis+Gamma+Glutamyl+Transpeptidase-acivicin+complex%3A+SUMO-Tag+Renders+High+Expression+and+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Journakl%22%5BJournal%5D)">High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility.</a> Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).</li>
<li>Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Production+and+Characterization+of+SAC%2C+the+Core+Domain+of+Par-4%2C+by+SUMO+Fusion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).</li>
<li>Reif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semisynthesis+of+biologically+active+glycoforms+of+the+human+cytokine+interleukin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 253(2007).</li>
<li>Smith, B. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20512673">SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).</li>
<li>Lawrence, A. M., Besir, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+proteins+in+gels+with+Coomassie+G-250+without+organic+solvent+and+acetic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19892187">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li>
<li>Chen, S. M., Wetzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+disaggregation+of+polyglutamine+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides.</a> Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).</li>
<li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM%3A+from+grid+preparation+to+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li>
<li>O'Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).</li>
<li>Greenfield, N. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15063655">Analysis of circular dichroism data.</a> Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).</li>
<li>Aiken, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+threonine+3%3A+implications+for+Huntingtin+aggregation+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).</li>
<li>Satakarni, M., Curtis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+peptides+as+fusions+with+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant peptides as fusions with SUMO.</a> Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).</li>
<li>Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+aortic+amyloid+polypeptide+medin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin.</a> Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).</li>
<li>Chen, S., Wetzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+disaggregation+of+polyglutamine+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides.</a> Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם שאין ניגודי אינטרסים עם התוכן של מאמר זה.

ב פרוטוקול זה, אנחנו המחולקות הליך יעיל עבור להשיג כמויות מיליגרם של מקורי, לא מתויגות Httex1 המכילים שאריות גלוטמין 23 או 43. דבר זה הושג על ידי הבעת Httex1 כמו פיוז'ן C-מסוף כדי שלו6-סומו תג, אשר משמש כדי לבודד את חלבון כימרי מהתא lysate על ידי ה-IMAC הוא ביקע לפני טיהור HPLC של Httex1. ואילו האסטרטגיה סומו שימש בייצור של מספר חלבונים אחרים, השיטה שלנו מראה כי תכונותיו הייחודיות שסומו יכול לשמש גם כדי ליצור ממהותם מגרה, צבירת-מועדים, חלבון amyloidogenic הוכחו בעבר קשה מאוד לטפל ולהפיק43,44. אנו מציגים פרוטוקול זה פשוט, קל לשימוש, להשוות פרוטוקול לדור של חלבון "נאותה". פיוז'ן סומו solubilizes ומייצב Httex1 במהלך השלב טיהור IMAC וביטוי. פצילות מוקדמת של התג, כפי שנצפה עם אסטרטגיה intein10 , צבירת היו כבר לא בעיה.
חלבונים ממהותם המתוסבכים פגיעים במיוחד השפלה. בעוד N-מסוף השפלה באזור N17 אינה בעיה באמצעות פרוטוקול זה, truncations של ההקלטה של Httex1 יכול להתרחש. החלבונים קטום דומים מאוד Httex1 hydrophobicity, תשלום, בגודל, הסרתם באמצעים כרומטוגרפי הוא מאתגר, ולכן עדיף למנוע היווצרות שלהם מלכתחילה. נצמדים היטב הפרוטוקול, תמיד עובד על הקרח ושימוש כמות מספקת של מעכבי פרוטאז אמור לעזור לשמור על הרמה של החיתוך שנצפה נמוך מאוד. החלת תג פיוז'ן ב C-הסופית של Httex1 יכול להסיר truncations ההקלטה בקלות כמו החלבון קטום יפסיד תג קירבה. עם זאת, אם הרצף המקורי צריך להיות מתוחזק שאין אפשרות להחיל את אפשרות זו כפי Httex1 מסתיים עם פרולין, לפי מיטב ידיעתנו ישנם אין תגיות פיוז'ן C-מסוף ידועים לזירוז פצילות traceless ויעילה לאחר פרולין.
החלק הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא טיפול Httex1 משוחררת לאחר המחשוף של התג סומו ע י ULP1. החלבון צריך להיטהר באופן מיידי על-ידי RP-HPLC. למרבה המזל, זה לתגובה, מהיר ויעיל, בדרך כלל שהושלמו ב- 10-20 דקות ב 4 º C. לעומת זאת, האסטרטגיה intein נדרש מספר שעות למחשוף מלאה של intein, וכך מצריכים פשרה בין תחילת צבירת המחשוף לא שלם על מנת למקסם את התשואה. בדיקה מהירה נדרשת עבור מוטציה Httex1, כמו זה יהיה להתחיל לצבור על הריכוז הגבוה יחסית נוכח התגובה המחשוף, ואילו הגרסה 23Q יציב למשך זמן ארוך יותר. במהלך הטיהור RP HPLC, יתרון נוסף של סומו הופך לכאורה: בעוד intein DnaB Ssp דוחה מים נדבק בחריפות העמודה, סומו הוא יותר הידרופיליות, elutes לחלוטין מן העמודה הפוך-פאזי C4. ULP1 מסחרי אמנם קצת יותר יקר, החלבון יכול להיות בקלות מיוצר תשואה גבוהה בעקבות פרוטוקולים שפורסמו בעבר29.
חשיבות קריטית החלת נוהל disaggregation לפני שימוש Httex1 לא יכול להיות מתוח מספיק. Lyophilized polyQ חלבונים כגון Httex1 יציבים, יכולים להיות מאוחסנים תקופות ארוכות, אך אינם לגמרי מסיסי מים, מאגרי. הנוכחות של preformed oligomers או הסיבים יכול להיות השפעה משמעותית על צבירת קינטיקה ומאפיינים ביופיזיקלי חלבון45. פרוטוקול disaggregation המתוארים כאן מאפשר את disaggregation של החלבון, הסרה של אגרגטים preformed, דור של פתרון של Httex1 monomeric מתוך מדגם lyophilized. הבחנו מורפולוגיה קינטיקה, fibril צבירת דומה עבור Httex1 שהושג עם בגלל הסומו ואסטרטגיה intein.
לעומת שיטות קודמות לייצור Httex1, האסטרטגיה סומו המתוארים כאן מציעה מספר יתרונות, מרחיבה את מגוון מחקרים ניתן לחקור את מבנה ומאפייני פונקציונלי של חלבון זה על בריאות ומחלה. החלבון פיוז'ן סומו-Httex1 קל לטפל, שניתן יהיה קפוא, לאחסן או שמרו על פתרון עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר, בעוד mHttex1 חינם צבירה במהירות. יציבות, המסיסות גבוהה החלבונים פיוז'ן סומו-Httex1 מספקים גמישות רבה יותר לתמרן החלבון ו/או להציג את השינויים אנזימטי והכימיות לתוך mHttex1 שאחרת לא היה אפשרי לאחר המחשוף. זה כולל המבוא של שינויים post-translational, fluorophores, ספין תוויות, ביוטין תגיות, וכו ' ההתקדמות המובאת כאן צריך 1) לקדם מחקרים עתידיים התירי קשרי גומלין מבנה פונקציה של Httex1; 2) ליצור כלים חדשים לחקור Htt צבירת והפצת פתולוגיה; 3) לאפשר הפיתוח של מבחני חדש לזיהוי מולקולות לייצב את המוטציה Httex1 ולמנוע צבירת שלה; . ו-4) לעודד מדענים מתחומים אחרים להביא לעבוד על חלבון זה ולהצטרף החיפוש שלנו כדי למצוא תרופות עבור מחלת הנטינגטון.

Htt הוא חלבון 348 kDa, היה מעורב פונקציות פיזיולוגיים מספר1. Htt כוללת אזור polyQ המורחב של שאריות יותר מ 36 אמיני שלה, היא גורמת HD2,3. פתולוגיה HD מאופיין תכלילים הסלולר סטריאטום ואת קליפת המוח, אשר מוביל למוות עצביים, ניוון של רקמות המושפעת4,5. מספר קטעים N-מסוף Htt המכילים את דרכי חזרה polyQ זוהו במוח פוסט-מורטם מחולים HD, הם חשבו להיות שנוצר על-ידי עיבוד הפרוטאוליטי של חלבון huntingtin6. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי Httex1 גם יכול להיווצר עקב החדרת ה-mRNA חריגה. Httex1 מכיל את המוטציה polyQ פתולוגית, שלה ביטוי אצל בעלי חיים יכולים לסכם רבים של התכונות העיקריות של HD7, ובכך הארת תפקיד מרכזי אפשרי של קטע זה ב HD פתולוגיה ומחלות התקדמות6, 8,9.
עקב צבירת גבוהה נטיה של מוטציה Httex1 (mHttex1) עם polyQ המורחב בדרכי, הרוב המכריע של מערכות קיימות ביטוי מבוססים על הפיוז'ן ארעית של Httex1 חלבונים (כגון גלוטתיון-S-טרנספראז (GST), thioredoxin (TRX) או מלטוז-מחייב-חלבון (MBP) ו/או פפטידים (פולי-היסטידין) באופן שונה לשפר את הביטוי, יציבות, טיהור ו/או מסיסות10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. הזוג פיוז'ן מקושר Httex1 עם רצף קצר המכיל אתר המחשוף פרוטאזות כמו טריפסין, tabacco לחרוט פרוטאז וירוס (אס) או PreScission כדי לאפשר המחשוף ושחרור של Httex1 לפני אתחול של צבירת או טיהור. החסרונות של שיטות אלה כוללים את האפשרות להשאיר משקעים נוספים בשל מחשוף traceless ויצירת של קטעים שנחתכו עקב miscleavage בתוך הרצף של Httex1, בנוסף הטרוגניות עקב המחשוף לא שלם ( ראה Vieweg et al. . לדיון מעמיק יותר על היתרונות ועל המגבלות של גישה זו)10. כדי לטפל מגבלות אלה, שפיתחנו לאחרונה אסטרטגיית הבעה המאפשרת את הדור של Httex1 ללא תג מקורית בפעם הראשונה על-ידי ניצול פיוז'ן N-מסוף ארעית של Synechocystis sp. (Ssp) Intein DnaB Httex110. בעוד המחשוף intein הוא traceless, מדויקת, התשואות mg בכמות החלבונים, היא עדיין סובלת שני החסרונות יכול להפחית את התשואה: כלומר, מוקדמת המחשוף של intein אשר יכול להתרחש במהלך הביטוי, ואת העובדה המחשוף מתרחשת מעל שעות מספר, אשר יכול להוביל לאובדן חלבון עקב צבירת, במיוחד עבור Httex1 עם polyQ המורחב חזרה.
כדי לטפל מגבלות אלה וכדי לחדד את האסטרטגיה שלנו לייצור של מקורי, ללא תג Httex1, פיתחנו מערכת ביטוי חדשה המבוססת על הפיוז'ן ארעית של הסומו, יותר בדיוק השמרים homolog Smt3 כדי Httex1. היישום של מערכת סומו לייצור של חומרים פורסם לראשונה ב 200429, שבה הודגם שיעור מוגבר של הביטוי, המסיסות של חלבון כימרי סומו. יכול להיות ביקע התג סומו מאת אוביקוויטין כמו חלבון ספציפי פרוטאז 1 (ULP1), אשר אינו דורש אתר הכרה, אבל מזהה את מבנה שלישוני של סומו, למעשה מבטלת את האפשרות של miscleavage30. יתר על כן, המחשוף בתיווך ULP1 מהיר, traceless, אינו משאיר משקעים נוספים. המחשוף מוקדמת של התג פיוז'ן, כפי שנצפה עם autocatalytic intein10, לחלוטין נמנעת על ידי הדרישה פרוטאז חיצוניים. ואילו האסטרטגיה סומו משמש כיום נרחב חלבון רקומביננטי ייצור31,32,33, נדגים בעיתון הזה שזה שימושי במיוחד עבור הדור של המתוסבכים מיסודה, חלבון amyloidogenic נוטה צבירה, כגון Httex1. אנו מאמינים כי פשטות, יעילות ועמידות בשיטה שלנו סומו-פיוז'ן מבוססי להפוך Httex1 מקורי, ללא תג יותר נגיש חוקרים מדיסציפלינות שונות מסלק את הצורך להשתמש שנוצרה רצפים של Httex1 במבחנה . זה מקדמה חשובה זה יקל על מחקרים עתידיים להבהיר את הקשר מבנה פונקציה של Httex1.
הפרוטוקול מתאר הטיהור של Httex1 מ L 12 של התרבות חיידקי, אך הפרוטוקול יכול להתאים בקלות להפקות בקנה מידה קטן או גדול יותר. הפרוטוקול מתאר את הייצור של פראי סוג Httex1 (wtHttex1) עם polyQ אני חוזר אורך מתחת (23Q), מוטציה Httex1 (mHttex1) עם polyQ חוזר אורך לעיל (43Q) הסף פתוגניים (36Q).

<table><tbody><tr><td>Uranyl formate (UO2(CHO2)2)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 רשתות</td><td>EMS</td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr> תא <tr><td>דיוק גבוה עשוי קוורץ SUPRASIL נתיב אור 1 מ"מ מבית Hellma Analytics</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca ו-Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>מרק לוריא (מרק LB של מילר)</td><td>&nbsp; Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB # E4130</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&nbsp; קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד הנטינגטין, a.a. 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD עז נגד עכבר IgG (H + L)</td> <td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 טור&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>C4 HPLC עמוד</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168. P0</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 10 ומיקרו; m C4 300 &Aring;, עמוד LC 250 x 21.2 מ"מ, פנומנקס, עמוד שמירה 19x10 מ"מ, לא מצופה טמפרטורה</td></tr><tr><td>אצטוניטריל HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר חצי מיקרו קובטה</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop, אביזרי 1/16 אינץ' (&Auml; KTAdesign), 50 מ"ל</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות GREINER עבור FPLC 16 x 100 מ"מ, פקק 12.0 מ"ל</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; מיקרוקון 100 kD&nbsp; מסנני זרימה מהירה</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130 מעבד נוזלי קולי</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA 900 מצויד בקולט שברים&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 דיכרואיזם מעגלי</td><td>מערכת UPLC Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters&nbsp;</td><td></td><td></td> מים <td>C8 BEH acquity 2.1x100 מ"מ עמודה 1.7 מיקרון&nbsp; , עמוד מחומם מראש (40 &deg; C), קצב זרימה של 0.6 מ"ל לדקה, נפח הזרקה של 4 &mu; </td></tr><tr>מערכת <td></td><td></td><td>מים L HPLC</td><td>גלאי UV 2489 ומודול שיפוע רבעוני 2535, לולאה של 20 מ"ל בבית FlexInject</td></tr><tr><td>ESI-MS: Finnigan LTQ</td><td>Thermo Fisher מכשיר</td> ליופילייזר מדעי <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit BioTWIN&nbsp;</td>מיקרוסקופ אלקטרונים <td>FEI</td><td></td><td>מצויד באקדח LaB6 ומצלמת 4K x 4K FEI Eagle CCD (FEI) ומופעל ב-80 קילו וולט</td></tr><tr><td>37 מעלות; C טלטול&nbsp; חממה</td><td>Infors HT multitron ביופוטומטר סטנדרטי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלוס</td><td>אפנדורף</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

דור של huntingtin exon1 טבעית, לא מתויגות מונומר, הסיבים משתמש באסטרטגיה פיוז'ן סומו

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

מחלת הנטינגטון (HD) היא מחלה תורשתית ניווניות קטלנית הנגרמת על ידי הרחבה החטיבה (≥36) ב אקסון הראשון של הגן HD, והתוצאה היא הביטוי של החלבון Huntingtin (Htt) או N-מסוף קטעים הימנו עם (polyglutamine המורחב מתיחה polyQ).
Exon1 של החלבון Huntingtin (Httex1) נמצא השבר Htt הקטן ביותר זה recapitulates רבות מהתכונות של HD בסלולר, חיה מודלים, נמנה שברי למדה הנפוצים Htt. גודל קטן של Httex1 הופך השפעול יותר נוטה biophysical אפיון באמצעות טכניקות סטנדרטי, רזולוציה גבוהה לעומת קטעים ארוכים או Htt באורך מלא. עם זאת, צבירת גבוהה נטיה של מוטציה Httex1 (mHttex1) עם תוכן מוגבר polyQ (≥42) הפכה אותו קשה לפתח ביטוי יעילה ומערכות טיהור לייצר חלבונים אלה בכמויות מספיקות ולגרום להם נגיש מדענים מתחומים שונים ללא שימוש פיוז'ן חלבונים או שיטות אחרות שמשנות את רצף מקורית של החלבון. אנו מציגים כאן שיטה חזקה ממוטב הייצור של כמויות מיליגרם של ילידים, תג בחינם Httex1 מבוסס על הפיוז'ן ארעית של צירוף קשורים אוביקוויטין קטן (סומו). הפשטות והיעילות של האסטרטגיה יבטל את הצורך להשתמש שנוצרה רצפים של Httex1, ובכך הפיכת חלבון זה יותר נגיש לחוקרים ושיפור הפארמצבטית את הניסויים בין מעבדות שונות. אנו מאמינים כי ההתפתחויות הללו גם יקל על מחקרים עתידיים מכוון שחקרתי את הקשר מבנה פונקציה של Htt וכן בפיתוח כלי אבחון הרומן של טיפולים לטיפול או להאט את ההתקדמות של HD.

Httex1 מתבטאת e. coli עם N-מסוף שלו6-סומו תג. התוצאות נציג של הביטוי, טיהור של החלבון פיוז'ן מסוכמות באיור1. רצף Httex1 מורכב שאריות 2-90 Htt ומתחיל עם Ala2, כי Met1 מלא cleaved ויוו42. המספור חומצות אמינו מתייחסת 23Q variant, הסדרה מלאה של החלבון פיוז'ן ביטוי מוצג איור 1א'. פלסמידים יופקד אצל Addgene בעתיד הקרוב לשיתוף עם הקהילה. תיאור סכמטי של פלסמיד ואת החלבון פיוז'ן ביטוי מוצג באיור 1ב'. Httex1 His6-סומו מבטאת ברמה בינונית (איור 1C), רוב החלבון היתוך הוא נוכח השבר מסיסים לאחר פירוק, גם את 23Q וגם את הווריאציה 43Q. החלבון פיוז'ן נודד גבוה מהצפוי, מבוסס על משקל מולקולרי. זה בין השאר בשל העדר חזקה של סומו אלא בעיקר בגלל ההרכב רצף חריג של Httex1, המכיל בעיקר שאריות וגם גלוטמין פרולין. את wildtype (23Q) והן החשבונאי (43Q) חלבון כימרי יכול להיות מועשר לטוהר ~ 80% על-ידי IMAC (איור 1D) הנוכחות של שיתוף טיהור מארח חלבון יכולה להיות מוסברת על-ידי רמת ביטוי נמוך יחסית של Httex1, המדגם גדול נפח חלה על העמודה.
המחשוף שלו6-סומו תג ולטיהור Httex1 מוצג באיור 2א. UPLC הוא כלי יעיל כדי לנטר את המחשוף שלו6-סומו תג (איור 2B). הפסגה המקורי של החלבון היתוך הוא נצרך ושל פסגות חדשות, מופרדים היטב שני המקביל שלו6-תג סומו, Httex1 מופיעים. התגובה המחשוף מסתיים בעוד 10-20 דקות. המערבי כתם (WB) הוא איטי מדי לפקח ביעילות את התגובה המחשוף, אבל זה כבר נכלל באיור לעיון וכדי להדגים את שלמות התרגום של המחשוף סומו. שני Httex1 23Q ו- 43Q ניתן להפריד מנקודת מבט שלו6-סומו תג על ידי RP-HPLC (איור 2C), התקבלו אצל טוהר גבוהה, כפי שהראה UPLC, MS וניתוח מרחביות-דף (איור 2D).
כדי להמחיש כי החלבונים Httex1 שהוכנו על ידי שיטה זו לשמור על המאפיינים צבירת הצפוי של Httex1, אנחנו לאומדן של קינטיקה fibrillization של מוטציה Httex1 ב 37 מעלות צלזיוס וזמינותו שיקוע, פיקוח שינויי מבנה שניוני באמצעות תקליטור ספקטרוסקופיה, מאופיין המורפולוגיה של מצרפי מאת TEM. ערכת נתונים נציג של קינטיקה צבירת היווצרות fibril mHttex1 כפי שנקבע על ידי וזמינותו שקיעת מוצגבאיור 3א. אובדן מסיסים Httex1 43Q לאורך זמן, עקב היווצרות fibril היה לכמת על-ידי UPLC. אנו מבחינים של דלדול מלא של חלבון מסיס לאחר 48 שעות של דגירה. בנוסף, אנחנו נקבע את מבנה שניוני של החלבון על ידי תקליטור ספקטרוסקופיה (איור 3ב). Httex1 43Q משמרות החל לא מובנים (λmin 205 nm) כדי בעיקר β-גיליון עשיר קונפורמציה (λmin 215 ננומטר) לאחר 48 שעות של דגירה. השינוי המבני הזה מלווה היווצרות של אגרגטים זמן fibrillar כמו הנצפה על ידי TEM ב 48 שעות (איור 3ג').
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> איור 1 . הביטוי ולטיהור שלו6-חלבון כימרי סומו Httex1.  (א) שלו על רצף חומצות אמיניות6-סומו-Httex1-QN פיוז'ן בונה (שלו6-סומו ירוק ו- Httex1-QN ב orange); (B) סקירה סכמטי של הביטוי, טיהור של החלבון פיוז'ן; (ג) אנליזה מרחביות-דף של הביטוי, המסיסות החלבון פיוז'ן לאחר פירוק; (ד) Chromatogram של הטיהור IMAC של החלבון פיוז'ן וניתוח של שברים מאת מרחביות-דף (הבר באדום: שבר לא מאוגד, בלו בר: שטיפת שבר, שחור בר: שברים המכיל הפסגה • תנאי); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> איור 2 . המחשוף שלו6 טיהור החלבונים Httex1-QN ללא תגית ותגית סומו. סקירה סכימטי (א); (B) ניתוח של המחשוף של התג סומו עם ULP1 על ידי UPLC (כחול: לפני תוספת של ULP1; שחור: 20 דקות (23Q), בהתאמה 10 דקות (43Q) לאחר תוספת של ULP1) ו WB (MAB5492 1:2000, עז משני אנטי עכבר נוגדן 1:5000); (ג) Chromatogram של הטיהור RP-HPLC מפוח של Httex1; D: ניתוח Httex1 מטוהרת על-ידי UPLC, למען חברה דמוקרטית-דף ו- ESI-MS; משקל מולקולרי הצפוי הוא 9943 Da (23Q) ודה 12506 (43Q) בהתאמה. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> איור 3 . צבירה של Httex1-43Q: assay שיקוע (A) מבוסס על UPLC. (B) CD ספקטרום של המבנה משני הו ו 48 ה (ג) micrographs TEM של מצרפי-48 שעות (סולם ברים הם 200 ננומטר). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת ועמיד לייצור כמויות מיליגרם של מונומרים מקורי, ללא תג, הסיבים של exon1 של החלבון Huntingtin (Httex1) המבוסס על הפיוז'ן ארעית של צירוף קשורים אוביקוויטין קטן (סומו).

דור של Huntingtin Exon1 טבעית, לא מתויגות מונומר, הסיבים משתמש באסטרטגיה פיוז'ן סומו

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

שיטה זו מאפשרת לנו לייצר אקסון אחד נטול תגים הנושא את הרצף המקורי של החלבון ומספקת הזדמנויות חדשות לחקר תפקוד המבנה של חלבון זה, ובכך מאפשרת לנו להבין את תפקידו בבריאות ובחולי. היתרונות העיקריים כאן הם הפשטות, היעילות והחוסן של השיטה. על ידי ביטול ההטרוגניות של הרצף, שיטה זו תאפשר ותקל על השוואה ושחזור בין מעבדות שונות.למרות ששיטה זו פותחה לייצור אקסון אחד של הנטינגטין, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות המועדות לצבירה כמו פפטיד עמילואיד-בטא ואלפא-סינוקלאין. ראשית, סנן סופרנטנט שבודד בעבר המכיל חלבון היתוך אחד אקסון His-SUMO Huntingtin באמצעות מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר. הסר דגימה של 20 מיקרוליטר של הסופרנטנט המסונן לניתוח SDS-PAGE.מלאו את הליזט המובהר לסופרלופ. בודד את חלבון ההיתוך האחד של אקסון His-SUMO Huntingtin מהליזאט החיידקי המובהר על ידי כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת על מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים מהירים בארבע מעלות צלזיוס. העבירו 10 נפחי עמודות או 200 מיליליטר של מאגר A ב-10 מיליליטר לדקה כדי לשטוף את החלבונים הלא קשורים.יש לסלק את חלבון ההיתוך עם נפחי עמודה של 2.5 או 50 מיליליטר של 100% מאגר B בשני מיליליטר לדקה. קח 20 מיקרוליטר מכל שבר לניתוח SDS-PAGE. הוסף 20 מיקרוליטר צבע טעינה לכל דגימה.טען שני מיקרוליטרים של החלבון הגולמי, החלק הלא קשור, שבר הכביסה וכל חלק משיא הפליטה על ג'ל של 15%. הפעל את הג'ל למשך 90 דקות בחום של 180 וולט. בסיום הריצה יש להכתים את הג'ל בצבע Coomassie לפי הוראות היצרן.אגדו את השברים המכילים את חלבון ההיתוך לפי שיא הכרומטוגרמה. לאחר מכן הוסיפו DTT של 100 מילי-מולרית ו-L-ציסטאין של 100 מילי-מולרי לשברים המאוגדים, והמיסו על ידי היפוך עדין של הצינור. להכנת ממס A לטיהור HPLC, הוסף שני מיליליטר של חומצה טריפלואורואצטית לבקבוק מים של שני ליטר.להכנת ממס B, הוסף 2.5 מיליליטר חומצה טריפלואורואצטית לבקבוק אצטוניטריל בנפח 2.5 ליטר. הכן את מערכת HPLC כפי שהוצע על ידי היצרן. בצע ריצה ריקה כדי להבטיח עמודה נקייה.לאחר מכן, קח 100 מיקרוליטר של חלבון ההיתוך לפני הוספת ULP1 כדי לנטר את תגובת המחשוף על ידי UPLC. העבירו 20 מיליליטר מחלבון ההיתוך לצינור חדש של 50 מיליליטר, והוסיפו 0.4 מיליליטר של תמיסת מלאי ULP1. דגרו את הדגימה על קרח, ושמרו את חלבון ההיתוך הנותר על קרח.אין לאחסן את החלבון בשלבי הביניים, והמשך בטיהור עד לסיום. כל 10 דקות, הסר 100 מיקרוליטר מתגובת המחשוף כדי לעקוב אחר התקדמות UPLC. לאחר צנטריפוגה של הדגימות, נתח שני מיקרוליטרים של כל סופרנטנט על ידי UPLC.השווה את הכרומטוגרמות שהתקבלו עבור הדגימה לפני הוספת ULP1 לבין הדגימות שנלקחו לאחר מכן. לאחר השלמת מחשוף ה-SUMO, סנן את הדגימה עם מסנן מזרק של 22 מיקרומטר. לאחר מכן, טהר את הדגימה המסוננת על ידי HPLC שלב הפוך.נתח את שברי ה-HPLC על ידי UPLC ו-ESI-MS. שברירי בריכה בטוהר דומה בצינורות פלסטיק של 50 מיליליטר. מקפיאים את הדגימות בחנקן נוזלי וליופיליזציה.לאחר מכן העבירו את החלבון הליופילי לצינורות פלסטיק של שני מיליליטר, ואחסנו במינוס 20 מעלות צלזיוס. ממיסים 100 מיקרוגרם של אקסון הנטינגטין שעבר ליופיליזציה אחד מכל שמונה מיקרוליטרים של חומצה טריפלואורואצטית מסודרת בצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר, יש לאדות בזהירות את החומצה הטריפלואורואצטית מתחת למכסה אדים עם זרם חנקן או ארגון.לאחר שהחלבון יבש, ממיסים אותו ב -100 מיקרוליטר מים. לאחר מכן נתח שני מיקרוליטרים של דגימה על ידי UPLC. כעת מערבבים 20 מיקרוליטר של תמיסת חלבון עם 20 מיקרוליטר של צבע טעינה פי 2.נתח דגימות של 1 עד 10 מיקרוגרם של חלבון על ידי SDS-PAGE. הפעל את הג'ל למשך 90 דקות בחום של 180 וולט. בסיום הריצה יש להכתים את הג'ל בצבע Coomassie לפי הוראות היצרן.הכן 10 מיליליטר DPBS בצינור של 50 מיליליטר. סנן את תמיסת ה-DPBS דרך מסנן של 2 מיקרומטר לפני כל שימוש. לאחר מכן, ממיסים 150 מיקרוליטר של אקסון הנטינגטין ליופיליזציה אחד מכל 12 מיקרוליטר של חומצה טריפלואורואצטית מסודרת בצינור של 1.5 מילימטר.לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר, יש לאדות בזהירות את החומצה הטריפלואורואצטית במכסה אדים עם זרם חנקן או ארגון. ממיסים את החלבון המפוזר במיליליטר אחד של DPBS מקורר מראש, והתאם את ה-pH בין 7.2 ל-7.4 עם נתרן הידרוקסיד מולארי אחד. לאחר מכן מסננים את תמיסת החלבון דרך מסנן צנטריפוגלי של 100 קילודלטון לצינורות פלסטיק של 1.5 מיליליטר.קבע את הריכוז של אקסון הנטינגטין אחד באמצעות עקומת כיול UPLC המבוססת על זיהוי ניתוח חומצות אמינו. לאחר מכן חשב את כמות ה-DPBS שצריך להוסיף כדי לקבל ריכוז של אקסון הנטינגטין אחד בעל שלושה מיקרומולרים. לדלל את החלבון לשלושה מיקרומולר על ידי הוספת הכמות המחושבת של DPBS למבחנה.שמור את הצינור על קרח עד לתחילת פרוטוקול הצבירה. יש לבצע את האימות על ידי אלקטרו-מיקרוסקופיה וטכניקות אחרות על מנת לאמת שפרוטוקול ההפרדה הצליח להסיר אגרגטים מוכנים מראש. רצף חומצות האמינו המלא של חלבון ההיתוך המבוטא מוצג כאן.סכימה של הפלסמיד וחלבון ההיתוך המתבטא מוצגת כאן. אקסון His-SUMO Huntingtin אחד מתבטא ברמה בינונית, ורוב חלבון ההיתוך קיים בחלק המסיס לאחר ליזה, הן עבור 23 גלוטמינים והן עבור גרסת 43 גלוטמין. ניתן להעשיר גם את חלבון ההיתוך מסוג הבר וגם את חלבון ההיתוך המוטנטי לטוהר של כ-80% על ידי כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת.מחשוף תג ה-His-SUMO וטיהור האקסון הראשון של הנטינגטין מוצגים כאן. שיא חלבון ההיתוך המקורי נצרך, ומופיעות שתי פסגות חדשות ומופרדות היטב המתאימות לתג His-SUMO ואקסון הנטינגטין אחד. ניתן להפריד גם אקסון הנטינגטין אחד 23 גלוטמינים וגם 43 גלוטמינים מתג His-SUMO על ידי HPLC שלב הפוך והתקבלו בטוהר גבוה כפי שמוצג על ידי ניתוח UPLC, MS ו-SDS-PAGE.קינטיקה הצבירה של תצורת סיבים אחת של אקסון m-Huntingtin כפי שנקבעה על ידי בדיקת שקיעה מראה דלדול מוחלט של חלבון מסיס לאחר 48 שעות דגירה. ספקטרוסקופיה CD של המבנה המשני של החלבון מראה מעבר של אקסון הנטינגטין אחד 43 גלוטמינים מקונפורמציה לא מובנית לקונפורמציה עשירה ביריעות בטא. שינוי מבני זה מלווה בהיווצרות אגרגטים סיביים ארוכים כפי שנצפה על ידי TEM.לאחר שליטה, ניתן לבצע שיטה זו לביטוי וטיהור של אקסון הנטינגטין תוך שלושה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לזכור שלחלבוני אקסון 1 של הנטינגטין, במיוחד חלבון עם מתיחת פוליגלוטמין מורחבת, יש נטייה גבוהה מאוד להצטבר. הודות לשיטה זו, אנו מסוגלים לייצר מספיק חלבוני אקסון אחד של הנטינגטין ולבצע מחקרים שלא היו נגישים בעבר כדי לחקור את המבנה, הצבירה והרעילות של החלבון ולפתח בדיקות חדשות לאיתור וכימות צורה הקשורה למחלה של אקסון הנטינגטין אחד.היציבות והמסיסות הגבוהה של חלבון ההיתוך SUMO מספקות גמישות רבה יותר במניפולציה של החלבון ומאפשרות הכנסת שינוי בהקשר של חלבוני ההיתוך שאחרת לא היו אפשריים לאחר המחשוף. אנו מקווים שהפשטות והיעילות של שיטה זו יבטלו את הצורך בשימוש ברצפים ומערכות מודל לא ילידיות ויעודדו חוקרים מדיסציפלינות שונות להצטרף למסע שלנו להבנת הביולוגיה של חלבון חשוב זה ולפתח טיפולים יעילים לטיפול במחלת הנטינגטון.

generation-native-untagged-huntingtin-exon1-monomer-fibrils-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

חלבונים יכולים לאמץ מבנה מקורי או להתקפל בצורה לא נכונה לעמילואיד בלתי מסיס. תנאים המעדיפים את מסלול הקיפול הלא נכון מובילים להיווצרות סוגים שונים של סיבי עמילואיד. השיטות המתוארות כאן מאפשרות המרה מהירה של חלבונים מקומיים לעמילואיד במבחנה.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

סינתזה של פלסמידים מותאמים אישית גוזלת עבודה וזמן. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיבוט הרכבה של גיבסון כדי להפחית את העבודה ומשך הליך שיבוט ה-DNA המותאם אישית. הפרוטוקול המתואר מייצר גם מבני חלבון מתויגים אמינים לביטוי יונקים בעלות דומה לשיבוט ה-DNA המסורתי של גזירה והדבקה.

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

דו"ח זה מתאר שיטת Bioengineering לתכנן ולבנות גורמי שחבור מלאכותיים רומן (ASFs) כי דווקא לווסת את השחבור של גני המטרה בתאי יונקים. שיטה זו ניתן להרחיב עוד להנדס גורמים מלאכותיים שונים כדי לתפעל היבטים אחרים של חילוף החומרים RNA.

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

שיטה מתוארת עבור fractionation של מינים huntingtin מוטציה לא מסיסים ולא מסיסים מתרבות המוח ותא העכבר. השיטה המתוארת שימושית עבור כימות של huntingtin חלבון השטף ועזרי בניתוח הומאוסטזיס חלבון בפתוגנזה של המחלה, בנוכחות לפליטת...

Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים

Oligonucleotides antisense שונים (AONs) הוכחו לגרום אקסון הכללה (splice אפנון) והצלה SMN ביטוי עבור ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA). כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור און lipotransfection לזירוז אקסון להיכלל הגן SMN2 ואת שיטות ההערכה כדי לקבוע את יעילות fibroblasts חולה SMA.

הערכה של הכללה אקסון שנגזרות אחוי Oligonucleotides Antisense מיתוג ב SMA החולה Fibroblasts

מאמר זה מתאר פרוטוקולים כדי להעריך את ההשפעה של חלבונים פלורסנט על צבירה ורעילות של התרחבות misfolded polyglutamine על הערכה מהירה של חלבון פלואורסצנטי uncharacterized לאחרונה בהקשר של עיתונאים פלורסנט.

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

המטרה של מאמר זה היא לתאר את השלבים הדרושים עבור הדור של סיבים אלפא-synuclein, בקרת איכות הבאים, והשימוש של סיבים מראש בvivo.

דור של אלפא-סינונוקלאומין מראש בנוי ממונמרים והשימוש ב Vivo

פרוטוקול זה מתאר את ההמרה של פיברובלסטים בעור לתוך myoblasts ואת הבידול שלהם myotubes. קווי התאים נגזרים מחולים עם הפרעות נוירומוסקולריות וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות.

תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

אנו מספקים פרוטוקולים מדרגיים המכסים תכנון מבנה, טרנספקציה חולפת, וביטוי וטיהור של גרסאות של חלבון ציד אנושי באורך מלא בתאי HEK293.

ייצור יעיל וניתן להרחבה של גרסאות ציד אנושיות באורך מלא בתאי יונקים באמצעות מערכת ביטוי חולפת

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי חלבונים קושרי מולקולות קטנים באמצעות תיוג פוטו-אפיניטי. היתרון בטכניקה זו הוא שקישור ותיוג קוולנטי של חלבוני המטרה מתרחש בסביבה התאית החיה, ומסיר את הסיכון לשיבוש מבנה החלבון המקומי ותנאי הקישור עם ליזיס התאים.

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

למד פרוטוקול לייצור מונומרים וסיבים של Huntingtin ללא תגית באמצעות אסטרטגיית פיוז'ן SUMO. שיטה זו משפרת שחזוריות ומאפשרת מחקר מבני ופונקציונלי של חלבונים הנוטים להתקבצות במחלות נוירודגנרטיביות.

דור של Huntingtin Exon1 טבעית, לא מתויגות מונומר, הסיבים משתמש באסטרטגיה פיוז'ן סומו

גלה סרטונים נוספים