Name: פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: למד כיצד לשלב חומצות אמינו קאנונית בפפטידים אנטימיקרוביאליים כגון ניסין באמצעות Escherichia coli. שיטה זו מאפשרת הערכת פעילות אנטימיקרוביאלית באמצעות מבחני דיפוזיה באגר ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה לפיתוח תרופות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.H.N., שחפת, מ ב לאשר מימון על-ידי התוכנית האיחוד האירופי FW7 (SYNPEPTIDE). י. פ-ס ו טי להכיר במימון משרד החינוך הפדרלי, מדע (BMBF תוכנית "HSP 2020", TU-WIMIplus פרוייקט SynTUBio) ושל קרן מחקר גרמני (אשכול של מצוינות "Unifying מושגים זרז").

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

באמצעות SPI להכנסה של תחליפי פרולין, המבנים nisin יישוב יכול להיות משמעותי שונה, יצירת גרסאות הרומן פפטיד עם שילובים רצף ייחודי ומאפיינים כימי. בדרך זו, גבול בסיסי בטכנולוגיה גנטית קלאסית יכול שיפרו, אשר הוא מוגבל ל הצד שרשרת בדיקות, הביוכימיה של cAAs 20. In vivo גיוון הכימית של nisin כפי שהודגם לעיל ממחיש הגישה המשלימה PTMs טבעי וכדי לשפר באופן דרמטי את שטח הכימית של RiPPs. אנו מאמינים כי הרחבת הרפרטואר חומצות אמינו טבעיות מחזיקה הבטחה גדולה במיוחד עבור מגברים. בחלבונים, מגוון עצום של פונקציות יכול להתממש באמצעות סידור מוגדר של cAAs 20 מבנים תלת מימדיים. עם רק 7-100 aa אורך3, דרכים להשיג תכונות מבניות כגון רק דרך cAAs יהיה מוגבל עבור מגברים. זה ולכן לא מפתיע כי מגברים טבעי בצורה של RiPPs הם בדרך כלל ששונה בהרחבה post-translationally4. באותו אופן, ncAAs כאבני בנייה אלטרנטיבית החזק הבטחה גדולה כדי לשפר את הפרמטרים שלהם pharmacodynamic, פרמקוקינטיקה ופרמקודינמיקה (ראה באומן. ואח 201735 והפניות בו).
המתודולוגיה SPI המשמשים את יתרונות עבודה הגדרת הניסוי קל יחסית, ביצוע פעולה פשוטה, הפארמצבטית גבוהה. עקב החלפת גלובלית, ncAA ריבוי האתרים, שהשתלבה פפטידים המטרה היא גם אפשרית. מצד שני, השיטה לא ייתכן נאותה להחלפה של חומצות אמינו המתרחשים לעתים קרובות המוצר ג'ין היעד. באופן עקרוני, ניתן לשינוי עמדות בלתי רצויה על ידי מוטגנזה, אך שינויים נוספים אלה עשויים גם להשפיע על מספר מאפיינים המגבר כולל מבנה אתריים. ברגע זן auxotrophic לייצור זמין, ניתן לבחון את ncAAs מספר מבלי לדרוש שינויים נרחבים ברמה הגנטית. יתר על כן, השיטה אינה מוגבלת auxotrophic e. coli זנים, אך ניתן גם לבצע באמצעות המחשב המארח הייצור הטבעי. לדוגמה, ג'ואו. et al. הראה SPI לייצור של הרומן RiPPs פועל גם ב- באופן טבעי Trp-auxotroph ל' lactis: שימוש מוגדר מדיה, שלוש תחליפי טריפטופן שולבו בשעה ארבע עמדות nisin50.
מאז השיטה SPI מוביל להחלפת הכללית של הנבחרת סי על ידי ncAA, זה חלים באופן כללי על מגוון רחב של היעד פפטידים וחלבונים. מגוון של auxotrophic e. coli זנים זמין (ראה שלב 1), המאפשר מספר cAAs כל להיבדק להחלפה ע י ncAAs. פגשתי תחליפי שולבו באמצעות מטא-זנים לקוי (למשל, B834(DE3)) הם בדרך כלל מועסקים. דוגמאות isostructural Met מקבילים הן azidohomoalanine (Aha) ו homopropargylglycine (Hpg), ncAAs זמינים מסחרית אשר ניתן לשלב ביעילות. שניהם מציגים ידיות bioorthogonal אשר מאפשרים מצורף של מולקולות נושאת של אלקין תואם או פונקציונליות אזיד, בהתאמה. לדוגמה, צבעי פלורסנט או moieties פוליאתילן גליקול (PEG) יכול להיות מצורף על ידי נחושת (I)-מזורז אזיד אלקין cycloaddition (CuAAC)51.
למרות שתי השיטות התאגדות רקומביננטי ncAA (SPI ו- SCS) בדרך כלל להשיג יעד בכמות מספקת, התשואות מופחתים לעיתים קרובות יחסית ייצור פראי-סוג של פפטידים המתאימים, חלבונים. כפי purities תדירות לתאם עם יעילות הייצור, שלבי טיהור נוסף יהיה צורך, במיוחד עבור מינים נמוך-בשפע. במקרה ספציפי זה של ייצור nisin רקומביננטי, הרצף מנהיג שלו מתויג מאוד מפשט טיהור RiPP על ידי העשרת סלקטיבי של lysates התא. הטיהור שמוצג פרוטוקול זה משפר את הטוהר ואת ריכוז של nisin, אבל לעתים קרובות אינה נותנת כח purities מספיק כדי להחליט מה ביבול ובאיכות פעילות ספציפית. מלבד IMAC, שיטות לטיהור המגבר נפוצים כוללים HPLC, יונים כרומטוגרפיה (חברת החשמל), משקעים (למשל. באמצעות אצטון או חומצת חומץ טריכלור (TCA)) או צירופם - והתוצאה היא ערכה רב שלבי טיהור52 . יצוין כי שלהם בדרך כלל polycationic הטבע יכול להקל על חברת החשמל טיהור. ליופיליזציה משמש לעתים קרובות כדי לאחסן אמפר מטוהרים.
באופן אידיאלי, ncAAs על השתלבות אמפר הנמכרים במחירים סבירים או בקלות המיוצר על ידי סינתזה לשחזור ופשוט פרוטוקולים. תנאי מוקדם חשוב לא פחות עבור שיטת SPI הוא ncAA היא מזוהה, מופעל גובים על גבי tRNA cognate aaRS אנדוגני או ביטוי במשותף. זה יכול להיות נבדק במבחנה על ידי חומצת אמינו הפעלה או tRNA aminoacylation assay53. כחלופה נוחה, SPI ביטויים מבחן של מודל חלבונים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שנערך שניהם בנוכחות, בהעדר ncAA תוספי יכול להתבצע. יתר על כן, המסיסות צמיחה בינוני ותא פרמאביליות, כמו גם לשחיקה מהווים גורמים חשובים.
בדוגמה זו, פעילות מיקרוביאלית הוקרן באמצעות זן מחוון גראם חיוביים. זה מבטא את מנהיג peptidase NisP, השלב הסופי של התבגרות nisin מזורז. הסרה של הרצף מנהיג (שלו מתויג למטרות טיהור) יכול להיות גם בביצוע במבחנה על ידי טיפול עם מטוהרים NisP50 או טריפסין54. מעבר להיקף של עבודה זו, אורגניזמים פתוגניים וללחצים multidrug עמידים ואז ניתן לבחון עיכוב bacteriostatic או אחרים על-ידי אמפר באמצעות מתודולוגיה דומה. היעד הרלוונטית קלינית מינים כוללים MRSA, MDR שחפת Mycobacterium, VRE, Acinetobacter baumannii, סטרפטוקוקוס pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa , קלבסיאלה pneumoniae. מלבד פעפוע צלחת אגר assay המובאים כאן, הצמיחה עיכוב יכול גם להתבצע באמצעות המדיה המתאימה נוזלי מחוסן עם המין חיידקי, בתוספת כח. באמצעות שיטות לדילול ציר, הריכוז המעכב מינימלי (MIC) ניתן לקבוע באמצעות פפטידים טהור55. וזמינותו הפעילות המוצגת כאן יכול לשמש גם כדי להעריך את bioactivity ואת עוצמת מגבר המכיל פתרונות ביחס הפניה תרכובות, nisin לדוגמה זמינים מסחרית.
ייצור רקומביננטי RiPPs לעתים קרובות ריאלי39, אשר בדרך כלל כולל שיתוף ביטוי של גנים PTM. ברגע המתח הייצור הועבר לתוך מדיום מינימלי מוגדר באופן כימי או סינתטי המכיל של ncAA מתאימים, שאריות ספציפיים החלפה של המנהל האזרחי המתאימים מתקיים. לפיכך, RiPPs אחרים יכול להיות מיוצר על ידי המתודולוגיה זהה, ובלבד ייצורם רקומביננטי הוא ריאלי, תנאים ניתן למצוא איפה התאגדות המכללות, PTM תשואות כמויות מספיקות של המוצר היעד. שימו לב כי מלבד פרוטאום התא המארח, המכונות PTM פפטיד יכולים להפוך גם המכללות-השתנה במהלך SPI. כתוצאה מכך, העיתוי של היעד ביטוי אינדוקציה ואורך תקופת הדגירה הבאים תוכל לדרוש אופטימיזציה. מאז ncAA שהשתלבה אנזימים PTM יכול להשפיע על היציבות שלהם, פעילות, ייצור RiPP מעובד באופן עקרוני יושפעו. מספיק PTM אנזים היעילות שציין היווצרות של prepeptide מעובד, כפי שזוהו על-ידי מבחני MS ו- bioactivity. כפי שהובאו לעיל, היזמים inducible שונים יכול להיות מועסק על מנת לייצר את PTM גנים קודם (בהעדר ncAA) ואחריו אינדוקציה של הגן פפטיד קודמן בנוכחות של ncAA. באופן כללי, חייבים לדכא הייצור של המכילות סי פפטיד היעד לפני תוספת של ncAA, ולכן דיכוי חזק של הגן קודמן נדרש. בתוך פרוטוקול זה, זו מושגת על ידי דיכוי קטבולי באמצעות התוספת של גלוקוז למדיום הגידול. במיוחד מאז PTM אנזימים הדרושים לעיבוד prepeptide מקורן בדרך כלל מחשב מארח מרוחק מבחינה גנטית, השימוש טמפרטורה, codon הביטוי של הגנים המתאימים תוכל לדרוש אופטימיזציה אם הייצור רקומביננטי טרם בוטלה הקים. בעקרון, הנוכחות של ncAAs, prepeptide יכול להתערב עם זיהוי ועיבוד של אנזימים PTM, במקרה של nisin NisBC ו- NisP. עבור ליגת המכללות שהשתלבה אמפר, ובכך מומלץ לבצע ניסויים בקנה מידה קטן ביטוי תחילה כדי לזהות ביטוי מתאים לתנאים והאמינות של המגבר פעילות וזמינותו.

הגילוי של אנטיביוטיקה במאה העשרים, פיתוח מקביל של תרכובות חדשות מיקרוביאלית כנגד מיקרואורגניזמים פתוגניים מופעלת לפלח טיפולים של זיהומים חיידקיים. עם זאת, בשל הופעתה של פתוגנים multidrug עמידים כגון סטפילוקוקוס עמיד methicillin- Staphylococcusaureus (MRSA), enterococci vancomycin עמידים (VRE), הקלד MDR (multidrug עמידים) סלמונלה typhimurium phage 10 (DT10 ), קלבסיאלה pneumoniae, זה הכרחי ליצור antimicrobial סוכנים חדשים1. פפטידים מיקרוביאלית (אמפר) הם תרכובות רב צדדי, ספציפי לעיתים קרובות מאוד מבטיח מועמדים הפיתוח של תרופות חדשות בזכות תכונותיהם physicochemical, גמישות, גודל, hydrophobicity, ואת מצב של פעולה2. מגברים הם פפטידים קטן המורכב בדרך כלל 7-100 חומצות אמינו. לעתים קרובות, יש להם מבנה cationic עשיר הטעון חיובית שאריות ארגינין, ליזין, אשר אינטראקציה עם קרום התא יישוב חיידקים, אשר מחויב הפוך3. קבוצת משנה מסוימת של המגברים הינם פפטידים ribosomally מסונתז, ששונה posttranslationally (RiPPs)4. אלה מיוצרים על ידי אורגניזמים רבים מן הממלכה של פטריות, התחום של חיידקים. אחד RiPPs הידוע והשימוש בהם נפוץ הוא nisin, המיוצר באופן טבעי על ידי החיידק חומצה לקטית הכרוכים lactis (lactis ל'). פעיל נגד פאנל של חיידקים גראם חיוביים, nisin שימש בתור biopreservative בתעשיית המזון יותר מ-50 שנה בשל תכונותיו מיקרוביאלית ואת העדר התנגדות מפותחת בכל יישוב זני חיידקים5. מחקרים הראו nisin הזה שיערער ומייצר נקבוביות בחיידקיים קרום התא, שמוביל פעילות מיקרוביאלית נגד שני פתוגנים גראם גראם שליליים ו-6. באמצעות קשירה השומנים II, סינתזה הקיר תא החיידק הוא מאופק7. Nisin מקודד על ידי nisA כמו פפטיד קודמן ליניארי, אשר מורכב של מנהיג, אזור פפטיד הליבה (איור 1). לאחר סינתזה ribosomal, prenisin קודם שינה את dehydratase NisB. כאן, סרין, תראונין משקעים באזור הליבה prepeptide הם יבשים dehydroalanine (Dha), dehydrobutyrine (Dhb)8. לאחר מכן, משקעי מיובשת נמצאים ביחד עם ציסטאין טופס lanthionine טבעות (ומכאן השם "lantibiotic" lanthionine המכילים טבעת אנטיביוטיקה) על ידי תוספת מייקל מזורז-אנזים. את השינוי posttranslational (PTM) הוא מזורז על ידי cyclase NisC. ב- lactis ל', prenisin ששונה מועבר מכן מחוץ לתאים על-ידי טרנספורטר NisT ולאחר פפטיד המנהיג הוא ביקע מאת proteinase NisP לשחרר את הטופס הפעיל ובוגרת nisin9. מנהיג אחראי peptidase NisP יש ירידה לפרטים המצע גבוה, מאז זה רק תהליכי שינוי nisin ביעילות10.
באופן כללי, פעיל RiPPs תוצאה של הפעולה של אנזימים PTM (למשל NisBC), אשר באופן דרסטי להגדיל את שטח הכימית של פפטידים קצרים, למשל, דרך acetylation, גליקוזילציה, מתילציה או זירחון. רמה זו של מורכבות נוספת ניתן להרחיב באמצעות שילוב ישיר של ncAAs. אמנם לעתים קרובות ריאלי, סינתזה של מגברים הוא אתגר עבור ייצור בקנה מידה גדול עקב המורכבות מבניים שלהם. לדוגמה, סינתזה כימית סך של lactosin lantibiotic S בשלבים תגובה 71 הושגה עם תשואה הסופי של 10% וזו של nisin עם תשואה גולמי בלבד 0.003%11,12. לכן, ייצור ביולוגי מציע אלטרנטיבה מעשית, בגלל הדור stereocenters נכונה וריכוז מוצר גבוהה.
עד היום, יותר מ 150 ncAAs, למשל, שיש קבוצות פונקציונליות המכילים פלואור או azides, שולב חומרים ולאחר מספר דוגמאות של מגברים המכללות-השתנה כבר דווח על13,14, 15,16. עם כניסתה של ncAAs, מאפיינים physicochemical הרומן ניתן להפיק בהשוואה מוטגנזה מכוונת קונבנציונלי. המגוון של פפטידים הקיים יכול להיות מוגברת, שיכול להוביל אנטיביוטיקה הרומן.
שיטה אחת עבור שילוב של ncAAs לתוך פפטידים רקומביננטי היא התאגדות הלחץ הסלקטיבי (SPI) מבוסס על השימוש של זני חיידקים auxotrophic17. זנים אלו אינם מסוגלים לסנתז אנלוגי לפנות לסוכנות המקביל של ncAA. המתודולוגיה משתמש יחודיות הנצפה לעתים קרובות המצע רגועה, תכונה של aminoacyl הטבעי-tRNA רבים synthetases (aaRSs)18. מלבד מצעים לפנות לסוכנות הטבעי שלהם, אנזימים אלה לעיתים קרובות מסוגל לזהות ולהפעיל את המכללות הרצוי, כדי לטעון את זה על tRNA(s) cognate שלהם. זה מוביל ribosomal תיאגוד ncAA לתוך המוצר ג'ין היעד באופן ספציפי שאריות (קרי, לפנות לסוכנות ← ncAA החלפה). זה כמובן אפשרי רק כאשר ncAA הרצויה היא מבנית רחמנא ליצלן דומה לחומצה אמינית הקנוני, נסבל על ידי הפיזיולוגיה של התא, את מכונות תרגום ואת הרצף פפטיד או חלבון המטרה. ב מבנה ניסיוני מסוים, התאים מארח auxotrophic מתורבתים במדיום מוגדר מסופק עם ריכוז חומצת אמינו מקורית ביותר שיוחלפו המגביל. צמיחה סלולרי או exchange על-ידי מדיום נטול לפנות לסוכנות מובילה אל תאיים דלדול של המנהל האזרחי. בשלב הבא, ncAA נוסף, בביטוי הגן היעד הוא המושרה. באופן בלתי נמנע, ncAAs עכשיו גם משולבים בחלבונים רבים אחרים בתא המארח במהלך שלב זה היעד גנים. למרות זאת, הרעילות של ההתקנה SPI נשמרת ברמה נמוכה מאז המתח Escherichia coli (e. coli) משתנה עם פלסמיד נושא את הגן המטרה תחת שליטה של מקדם מכירות חזק (נפוץ מקדם T7 תחרותי / מערכת ה-RNA פולימראז)19. מיד לאחר אינדוקציה (בדרך כלל כאשר המנהל האזרחי הוא מותש), המארח תאים חדל לצמוח, machineries אנזימטי cytoplasmic שלהם משמשים בעיקר עבור ביטוי הגן מבוססת על פלסמיד היעד. מוטגנזה ניתן להגדיר את האתר של שאריות ספציפיים ncAA התקנת ג'ין היעד20.
כמו פפטיד מודל עבור שילוב של ncAAs, nisin כח pentacyclic A נבחר. 34 חומצות אמינו ארוך ויש רק משקע פרולין בודדת ברצף פפטיד הליבה (איור 1). כמו סבטיליזין ericin A, S, כמו גם epidermin nisin Z, nisin Q, פרולין שנשמרת נראה חיוני עבור פעילות9,21. פרולין לפנות לסוכנות ממלאת תפקיד חשוב במיוחד peptidyl-prolyl אמיד סיבוב וייצוב מבנה שניוני. שרשרת הצד שלו מצלצל הייצורים החיים (exo / אנדו קימוט) אחראים על ייצוב תרמודינמי ההדבקה אמיד. שינויים כימיים יישוב (כגון hydroxylations, fluorinations, methylations) של prolyl קימוט להשפיע לעיתים קרובות באופן ביקורתי את יציבות מתקפלים, קשיחות לגרדום והפונקציות של מבנים ביולוגיים רבים22. לכן סביר לצפות כי החלפות אנלוגי פרולין Pro→ להעניק טבעת B, הטבעת השנייה של nisin, עם הרומן ומאפיינים יוצא דופן.
כאן, של פרולין-auxotrophic e. coli זן שימש לייצור nisin רקומביננטי. פעולה זו דורשת את הביטוי של ג'ין prepeptide nisA , כמו גם את השינוי גנים של האנזים nisBC. המוצר פפטיד מקודדים גנטית נושא N-סופני שלו מתויג מנהיג עבור טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה. עבור פעילות נחישות, ל' lactis להביע והוא מפריש NisPT משמשת להפעלת על גרסאות רקומביננטי nisin lysates תא החיידק או דגימות פפטיד מטוהרים (איור 1). מגבר בוגר הוא שוחרר לאחר המחשוף של המנהיג על ידי NisP. בשיטה זו דיפוזיה אגר, המדגם המגבר מפזרת לתוך מדיום הגידול מוצק, יכול לעכב את הצמיחה של בקטריה גראם חיוביים. לאחר דגירה, זה יכול להיות שנצפו ויזואלית על ידי הצמיחה עיכוב הילות. בנוסף ל' lactis כמחוון, שינוי גרסאות nisin הראו פעילות מיקרוביאלית נגד Enterococcus faecalis, Bacillus קובו, Staphylococcus aureus, לקטובצילוס johnsonii 21,23.
שיטה אלטרנטיבית ושונה השפעול לשלב ncAAs ב RiPPs הוא stop codon דיכוי (SCS)24. בשביל זה, tRNA אורתוגונלית / aminoacyl-סינתזת המעביר (aaRS) זוג נדרש עבור ncAA המתאימים. באופן אידיאלי, כל שלושת הרכיבים האלה הם bioorthogonal, קרי, הם לא לקיים אינטראקציה עם tRNAs ו aaRSs אנדוגני. AaRS ncAA ספציפי יכול להיווצר על ידי שינוי של האתר הפעיל של אנזים והקרנת ספריות גנטי של מוטציה synthetases25. יתר על כן, המבוא של ncAA מחייב של codon אשר מוקצית, אשר לא קידוד עבור המנהל האזרחי. בדרך כלל, אמבר stop codon נמצא בשימוש24,26.
לאחרונה, SPI הוקמה עבור שילוב של α-chloroacetamide-המכילים ', לחץ על-כימיה-תואם ncAAs לתוך NisA27. לדוגמה, Nε- היתרים-ליזין סופחה את captistruin פפטיד לאסו בייעודי לאתר (SCS), שאריות ספציפיים (SPI) התאגדות שיטות, לאחר מכן שונה חוץ גופית בתוך מאת שיכול עיצורים מזורז רותניום28 . בהשוואה ל- SPI השיטה SCS מורכבת יותר מאז tRNA אורתוגונלית / זוג aaRS חייב להיות ביטוי במשותף. עד כה, o-זוגות על התאגדות פרולין היה מפותח29, אך לפי מיטב ידיעתנו, דווח אף דוגמא התאגדות אנלוגי פרולין.
יצוין, כי לא כל ncAAs ניתן לשלב באמצעות המתודולוגיה SPI. קודם כל, ספיגת ncAAs לתוך הציטופלסמה מוסדר על ידי מספר רב של חלבונים תחבורה מוטבעות ממברנה cytoplasmic, המהווה הקרום הפנימי עבור חיידקים גראם שליליים כמו e. coli. בדרך כלל, e. coli הוא המסוגל להעביר מגוון רחב של תחליפי חומצת אמינו לתוך התא עם שרשראות צד מבנית דומה מבחינה כימית הקנוני חומצות אמינו. שנית, רבים ncAAs תגובתי מבחינה כימית או לא יציב יכול לשמש מעכב לקראת צמיחה סלולרי, כפי שהם רעילים כי חילוף החומרים, פיזיולוגיה של המחשב המארח תא30. לפיכך, ספיגת ורעילות של ncAA עבור המארח הייצור צריך להיבדק מראש. כדי להימנע איון של מכונות PTM כתופעת לוואי, מלכודת מבוקר בקפדנות ביטוי של גנים אחראים יכול לשמש כדי לשלב את חומצת אמינו טבעי אנזימים השינוי (למשל, nisBC) ו- ncAA לתוך הגן היעד ( למשל, nisA). זה יכול להתבצע באמצעות שני היזמים שונים, אינדוקציה של ביטוי גנים היעד, כפי שמתואר ב SPI שתוכנן במיוחד פרוטוקולים31. כמתואר לעיל, שיטת SPI מסתמך על יחודיות המצע רגועה של aaRS, אשר מאפשר הפעלת המכללות tRNA cognate טעינה. לאחר מכן, סינתזת יועברו אל הריבוזום ואחריו אמיד בונד היווצרות וקיפול של פפטיד היעד (פולי). בתהליכי הזה, הגהה ועריכה מנגנונים עלולים להיות רלוונטי32. מסיבות אלו, יש חשיבות גדולה יש מטרה המכללות דומה מבחינה מבנית רחמנא ליצלן המנהל האזרחי. נקודות חיוניים אחרים הן יציבות מספקת (שניהם בתקשורת צמיחה, חשוף חילוף החומרים הסלולר), המסיסות של ncAA. בנוסף, זה צריך להיות או זמינים מסחרית או קל להיות מסונתז כימית.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור SPI, ומאפשר תיאגוד ספציפיים שאריות ncAAs לתוך RiPPs רקומביננטי. במיוחד, פרולין שונים תחליפי משולבים של פפטיד מיקרוביאלית nisin A באמצעות e. coli כמו האורגניזם המארח. ספקטרומטר מסה משמש לאימות החלפת חומצת אמינו, מוצרים פפטיד מנותחים על אתריים באמצעות מבחני עיכוב גדילה ומיקרוסקופיה פלורסצנטיות באמצעות זני חיידקים אינדיקטור.
הדרישה הבסיסית nisin רקומביננטי מוצלחת הביטוי מוגדר ncAAs דורשת פרולין מתאימים auxotrophic e. coli זן. על זה auxotrophy, proA חייב להיות לקוי, למשל מושגת על ידי הסתרה גנומית. התאים לגמרי משולל ביוסינטזה Pro תאיים (קרי, מחיקה של proABC) ללא אפשרות השחזור הם auxotrophs יציב. שיטות נוקאאוט גנטי נפוץ הן phage התמרה חושית או נוקאאוט יחיד-גנטי לפי דצנקו & Wanner33. יתר על כן, ניתן להשיג proA נוקאאוט זנים מאגרים ציבוריים כגון Addgene, CGSC או האוסף קאיו. מאז הביטוי רקומביננטי nisABC המוצגת כאן מסתמך על השימוש T7 היזמים, המתח מארח ביטוי יש לשאת את הגן inducible T7 RNA פולימראז. זה יכול להתבצע על ידי החדרת prophage λDE3 לתוך הגנום המארח, לדוגמה באמצעות ערכת מסחרי. לחלופין, זנים כמו BL21(DE3) יכול להתבצע auxotrophic כמתואר לעיל.

<table><tbody><tr><td>נתרן כלורי</td><td>קרל רות', גרמניה</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>גואנידין הידרוכלוריד</td><td>קרל רות', גרמניה</td><td>0035.2</td><td></td></tr><tr><td>דיפוטסיום מימן פוספט</td><td>קרל רות', גרמניה</td><td>P749.3</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט</td><td>קרל רות', גרמניה</td><td>3904.3</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דימימן פוספט מונוהידראט</td><td>קרל רוט, גרמניה</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>דיסודיום מימן פוספט</td><td>קרל רות', גרמניה</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>L-אלנין</td><td>קרל רות', גרמניה</td><td>3076.2</td><td></td></tr><tr><td>L-ארגינין</td><td>קרל רות', גרמניה</td><td>3144.3</td><td></td></tr><tr><td>L-אספרגין מונוהידראט</td><td>קרל רות', גרמניה</td><td>HN23.1</td><td></td></tr><tr><td>חומצה L-אספרטית</td><td>קרל רות', גרמניה</td><td>T202.1</td><td></td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>Carl Roth, גרמניה</td><td>3467.3</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Carl Roth, גרמניה</td><td>3772.1</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamic</td><td>acid Carl Roth, גרמניה</td><td>3774.1</td><td></td></tr><tr><td>L-glycine</td><td>Carl Roth, גרמניה</td><td>3187.3</td><td></td></tr><tr><td>L-histidine</td><td>Carl Roth, גרמניה</td><td>3852.3</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucine</td><td>Carl Roth, גרמניה</td><td>3922.3</td><td></td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>Carl Roth , גרמניה</td><td>3984.3</td><td></td></tr><tr><td>L-ליזין monohydrate</td><td>קרל רוט, גרמניה</td><td>4207.2</td><td></td></tr><tr><td>L-מתיונין</td><td>Carl Roth, גרמניה</td><td>9359.4</td><td></td></tr><tr><td>L-פנילאלנין</td><td>Carl Roth, גרמניה</td><td>4491.2</td><td></td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Carl Roth, גרמניה</td><td>T205.3</td><td></td></tr><tr><td>L-serine</td><td>Carl Roth, גרמניה</td><td>4682.4</td><td></td></tr><tr><td>L-threonine</td><td>Carl Roth , גרמניה</td><td>T206.2</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptophan</td><td>Carl Roth , גרמניה</td><td>4858.2</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrosine</td><td>Carl Roth , גרמניה</td><td>T207.2</td><td></td></tr><tr><td>L-valine</td><td>Carl Roth , גרמניה</td><td>4879.4</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום גופרתי</td><td>Carl Roth , גרמניה</td><td>3746.3</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט</td><td>קארל רות', גרמניה</td><td>0261.2</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>קארל רות', גרמניה</td><td>6780</td><td>הכינו תמיסה של 20% (w/v) להוספה לאגר מותך</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>קארל רות', גרמניה</td><td>PN93.2</td><td></td></tr><tr><td>ברזל(II) כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ', גרמניה</td><td>372870</td><td></td></tr><tr><td>תיאמין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ', גרמניה</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>קארל רוט, גרמניה</td><td>3822.2</td><td></td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט</td><td>Merck, גרמניה</td><td>102792</td><td></td></tr><tr><td>מנגן (II) כלוריד</td><td>קרל רות', גרמניה</td><td>KK36.2</td><td></td></tr><tr><td>אבץ כלוריד</td><td>Merck, גרמניה</td><td>108816</td><td></td></tr><tr><td>אימוניום אורתומוליבדט</td><td>סיגמא-אולדריץ', גרמניה</td><td>277908</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>קרל רוטגרמניה</td><td>7533.3</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן אמפיצילין</td><td>קארל רוט, גרמניה</td><td>K029.5</td><td>ריכוז עבודה 100 &micro; גרם/מ"ל עבור E. coli, הכינו מלאי 100 מ"ג/מ"ל ב-ddH2O</td></tr><tr><td>kanamycin sulfate</td><td>Carl Roth, גרמניה</td><td>T832.2</td><td>ריכוז עבודה 50 ומיקרו; גרם/מ"ל עבור E. coli, הכינו מלאי של 50 מ"ג/מ"ל ב-ddH2O</td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>קארל רוט, גרמניה</td><td>3886.1</td><td>ריכוז עבודה 5 ומיקרו; גרם/מ"ל עבור לקטובצילוס לקטיס, הכינו מלאי של 37 מ"ג/מ"ל באתנול</td></tr> <tr><td>(4S)-פלואורופרולין</td><td>באצ'ם, שוויץ</td><td>F-3970</td><td></td></tr><tr><td>(4R)-פלואורופרולין</td><td>באצ'ם, שוויץ</td><td>F-3975</td><td></td></tr><tr><td>(4S)-הידרוקסיפרולין</td><td>באצ'ם, שוויץ</td><td>F-1395</td><td></td></tr><tr><td>(4R)-הידרוקסיפרולין</td><td>באצ'ם, שוויץ</td><td>F-2980</td><td></td></tr><tr><td>(4S)-מתאנופרולין</td><td></td><td></td><td>חומצה</td></tr> הידרוכלורית <tr>מסונתזת כימית <td>(4R)-מתאנופרולין</td><td></td><td></td><td>מסונתזת כימית</td></tr><tr><td>(HCl)</td><td>קארל רות', גרמניה</td><td>P074.4</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VWR, גרמניה</td><td>20825.324</td><td></td></tr><tr><td>M17-broth</td><td>Sigmal-Aldrich, גרמניה</td><td>56156</td><td>מוצר מסחרי, ראה Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 לתכולה והכנה</td></tr><tr><td>אגר-אגר קארל</td><td>רוט, גרמניה</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>ניסין מ-Lactococcus lactis&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ', גרמניה</td><td>N5764</td><td>מוצר מסחרי, יכול לשמש כהתייחסות לביואקטיביות</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>קארל רות', גרמניה</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>imidazole</td><td>Carl Roth, גרמניה</td><td>3899.3</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון דגימה אוטומטית של 1.5 מ"ל עבור LC-MS</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>Supelco 854165</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>VWR, גרמניה</td><td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA עבור LC-MS, 83642</td><td>דרגת LC-MS נדרשת</td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>VWR, גרמניה</td><td>HiPerSolv CHROMANORM עבור LC-MS, דרגת 84865</td><td>LC-MS נדרשת</td></tr><tr><td>1 מ"ל עמודת Ni-NTA IMAC, למשל HisTrap FF Crude</td><td>GE Healthcare, UK</td><td>29-0486-31</td><td>יצרנים ושרפים שונים זמינים עבור IMAC</td></tr><tr><td>0.45 ומיקרו; יחידת מסנן עליונה של בקבוק m</td><td>VWR, גרמניה</td><td>10040-470</td><td>סינון סטרילי של תמיסות באמצעות משאבת ואקום</td></tr><tr><td>0.45 ומיקרו; מסנן מזרק m קרום PVDF</td><td>קרל רוט, גרמניה</td><td>CCY1.1</td><td>סינון סטרילי של תמיסות באמצעות מזרק ולהסרת חלקיקים מליזטים של תאים</td></tr><tr><td>מזרק נעילת לואר, PP, 50 מ"ל</td><td>קארל רוט, גרמניה</td><td>T552.2</td><td>סינון סטרילי של תמיסות&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות אפנדורף</td><td>אפנדורף, גרמניה</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי (פוליסטירן, סטרילי)</td><td>קארל רות', גרמניה</td><td>TA19</td><td></td></tr><tr><td>נילוס אדום</td><td>סיגמא-אולדריץ', גרמניה</td><td>72485</td><td></td></tr><tr><td>E. coli &Delta proA זן</td><td>CGSC, אוסף Keio</td><td>JW0233-2</td><td>פרולין-אוקסוטרופי E. coli K-12 זן</td></tr><tr><td>E. coli B834(DE3)</td><td>Novagen (Merck), גרמניה</td><td>69041</td><td>מתיונין-אוקסוטרופי E. coli B strain</td></tr><tr><td>&lambda; ערכת ליזוגניזציה DE3</td><td>Novagen (Merck), גרמניה</td><td>69734-3</td><td></td></tr><tr><td>Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT</td><td></td><td></td><td>זן אינדיקטור חיידקים, ראה Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890</td></tr><tr><td>צנטריפוגה ספסלית לצינורות אפנדורף 1.5 מ"ל</td><td>אפנדורף, גרמניה</td><td>5427 R</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>GE Healthcare, בריטניה</td><td>P1</td><td></td></tr><tr><td>מערכת FPLC</td><td>GE Healthcare, UK</td><td>&Auml; kta Purifier 10 או דומה</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td>TI Eclipse מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב&nbsp; עם 100x (NA 1.4) אובייקטיבי והגדרת דוגמה של מנורת כספית</td><td>למיקרוסקופ פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>מכפיל אלקטרונים CCD (EMCCD) מצלמת</td><td>אנדור טכנולוגיות, בריטניה</td><td>אנדור לוקה&nbsp;</td><td>הגדרה לדוגמה עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>מסנן עירור פלואורסצנטי</td><td>Thorlabs, ארה"ב</td><td>קובייה דיכרואית (TLV-U-MF2-TRITC)</td><td>הגדרה לדוגמה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>מסנן פליטת פלואורסצנטי</td><td>AHF Analysentechnik, גרמניה</td><td>T 560 LPXR</td><td>הגדרה לדוגמה לכיסוי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>24 x 60 מ"מ</td><td>קארל רוט, גרמניה</td><td>LH26.1</td><td>הגדרה לדוגמה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>שמן טבילה</td><td>קארל Zeiss, גרמניה</td><td>Immersol 518 F</td> הגדרה לדוגמה עבור סוניקטור <td>בדיקה מיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td></td><td>בנדלין, גרמניה</td><td>Sonopuls HD3200 עם סונוטרודה MS-72</td><td>200 W פלט HF מקסימלי</td></tr><tr><td>C5 עמודת HPLC (2.1x100 מ"מ, 3 ומיקרו; גודל חלקיקים m)</td><td>Sigma-Aldrich, גרמניה</td><td>567227-U</td><td>הגדרה לדוגמה לספקטרומטריית מסה</td></tr><tr><td>ESI-TOF בשילוב עם מערכת HPLC</td><td>Agilent, ארה"ב</td><td>Agilent 6530 Accurate Mass QTOF עם 1260 HPLC</td><td>הגדרה לדוגמה לספקטרומטריית מסה</td></tr></tbody></table>

פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

לטבע יש מגוון של אפשרויות ליצירת חלבון פונקציות חדשות על-ידי שינוי הרצף של אבני הבניין חומצת אמינו בודדות. עם זאת, כל הווריאציות מבוססים על 20 הקנוני חומצות אמינו (cAAs). דרך להציג מאפיינים נוספים physicochemical לתוך polypeptides, שילוב של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) משמשת יותר ויותר בהנדסת חלבונים. בשל אורכם הקצר יחסית, השינוי של פפטידים מסונתז ribosomally, post-translationally ששונה על-ידי ncAAs הוא אטרקטיבי במיוחד. פונקציונליות חדשה וידיות כימי יכול להיווצר על ידי שינויים ספציפיים של שאריות בודדים. השיטה ההתאגדות (SPI) הלחץ הסלקטיבי מנצל שמקודדים המארח auxotrophic הם משוללי חומצת אמינו חיונית בתקשורת צמיחה מוגדרים כימי. מספר תחליפי חומצת אמינו דומים מבחינה מבנית רחמנא ליצלן אז יכול להיות מופעל על ידי המעביר-aminoacyl-tRNA המתאים ומספקים ספציפיים שאריות cAA(s) ← ncAA(s) ההחלפות ברצף פפטיד או חלבון המטרה. למרות זאת, בהקשר של השיטה SPI, ncAAs גם משולבים פרוטאום מארח בשלב של ביטוי גנים רקומביננטי, רוב המשאבים של התא מוקצות הביטוי של הגן היעד. פעולה זו מאפשרת שאריות ספציפי יעיל, תיאגוד ncAAs מלווה לעיתים קרובות עם כמויות גבוהות של יעד שונה. העבודה הציג מתאר את ויוו השתלבות של שישה פרולין תחליפי פפטיד מיקרוביאלית nisin, lantibiotic המיוצר באופן טבעי על ידי lactis הכרוכים. מאפיינים מיקרוביאלית של nisin ניתן לשנות, הרחיב במהלך התסיסה שלו, ביטוי auxotrophic Escherichia coli זנים בתקשורת צמיחה מוגדרים. ובכך, ההשפעות של החלפת ספציפיים שאריות של cAAs עם ncAAs יכול לספק שינויים ב פעילות מיקרוביאלית וספציפיות. מבחני פעילות מיקרוביאלית, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות משמשים כדי לבדוק את גרסאות nisin חדשות עבור עיכוב גדילה של זן מחוון גראם חיוביים lactis הכרוכים . לספקטרומטרית משמש כדי לאשר התאגדות המכללות nisin ביואקטיביות משתנים.

פרוטוקול זה תוכנן כדי לאפשר הייצור של ליגת המכללות-השתנה nisin גרסאות עם שאריות ספציפיים התאגדות של פרולין תחליפי בשיטת SPI. בעבר, הכדאיות ואת התשואות של 24 מ ג/ליטר דווחו לייצור רקומביננטי nisin פראי-סוג שונה לחלוטין39. שימוש בשיטת SPI, היעד אלקטרופיזיולוגיה/תשואות טובות לעתים קרובות, יכולים להגיע כמויות קרוב ייצור פראי-סוג48. כמו הניסויים הראשונים, הפקה RiPP פראי-סוג רקומביננטי צריך להיבדק במארח auxotrophic שבחרת. הנה, פרולין auxotrophic e. coli MG1655 ΔproBA:: והשפלתם Δלשגרה:: והשפלתם (DE3) שימש מארח זן. כהכנה לסיפוח ncAAs, טיפוח, אינדוקציה ניתן למטב הרכב בתזמון, כמו גם בינוני וטמפרטורה לכיוון תשואה מקסימלית פפטיד.
פעילות מיקרוביאלית assay ייצור פראי-סוג nisin רקומביננטי, טיהור בוצעו בעקבות בפרוטוקול לעיל. במקרה זה, פרולין שימש במקום ונגזרותיו ncAA בשלב 3.6. וזמינותו פעילות מיקרוביאלית שימש כדי לוודא RiPP ייצור וכדי להשוות את פעילות מיקרוביאלית לפני ואחרי טיהור. עבור פעילות וזמינותו, שברים • תנאי ו IMAC זרימה דרך היו בשימוש ישירות, כנגדם המתח מחוון גראם חיוביים lactis ל' (איור 2). זן זה מבטא NisP, nisin וריאציות הכלול lysates תא החיידק או מטוהרים פפטיד דגימות, בהתאמה, להיות מופעל על ידי פצילות הפרוטאוליטי של פפטיד מנהיג. אין ספק, הזרימה דרך הראה צמיחה-מעכבות פעילות. זו יכולה להיות מוסברת על ידי חומר ביו לא מחייב את העמודה ה-IMAC. כל השברים • תנאי שנבדקו הראו פעילות מוגברת בהשוואה המדגם ולזרימה, המציינת את ריכוז פפטיד מתויג שלו על ידי ה-IMAC. שימו לב כי המאגר • תנאי (כמו שליטה שלילי) לא להשפיע על הגידול של ל' lactis assay הזה.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig2.jpg"> איור 2 . פעילות מיקרוביאלית בודק לאחר טיהור IMAC של recombinantly מיוצר פראי-סוג nisin. • תנאי שברים 5-15, את הזרימה של ה-IMAC טיהור נבדקו בהשוואה lysate בתא ולזרימה (מדולל עבור OD נירמול600 ) נגד המתח מחוון lactis ל' . הגודל של הילות עיכוב גדילה מציין פעילות מיקרוביאלית. כלורמפניקול-ריכוז של 400 µg/mL שימש בתור פקד חיובי ושאר המאגר • תנאי IMAC שליטה שלילי. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
כדי להוכיח את פעילות מיקרוביאלית של recombinantly מיוצר nisin משתנים המכילים שש תחליפי פרולין שונים, וזמינותו פעילות בוצעה לבחון עיכוב של המתח מחוון lactis ל' . איור 3 מראה הצמיחה עיכוב חמש מתוך שש דגימות המיוצר באמצעות תחליפי פרולין. התוצאות הטובות ביותר (כפי נשפט מן ההילה גדלים) נצפו על הניסויים התאגדות של אנלוגי (4R) - fluoroproline, (4R) - hydroxyproline ו- (4S)-methanoproline. השוואת גודל ההילה עיכוב גדילה כדי nisin פראי-סוג המיוצרים ובדק במקביל, כל שלושת המשתנים nisin הראה כוח עיכוב דומה. עם זאת, גודל הילה לבד לא יכול להיות פעם התחת פעילות ספציפית, מאז הריכוז של המגבר לא נקבע. לכן, מבחני לשרת רק בדיקה איכותית אם פעילות מיקרוביאלית של המשתנים nisin וכתוצאה מכך הוא נשמר או אבד. כדי לקבוע את פעילות ספציפית, הריכוז של המשתנים nisin להיות כימות (ראה דיון).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig3.jpg"> איור 3 . פעילות מיקרוביאלית וזמינותו של lysates התא המכיל את nisin וריאציות המיוצר באמצעות SPI עם תחליפי פרולין. השוואה של nisin משתנים עם דגימות פראי-סוג רקומביננטי. כל הדגימות היו יתר600-מנורמל לאחר פירוק התא ביחס הצפיפות תרבות תא שנקטפו. הילות מציינים אתריים בצורה של מחוון זן הצמיחה עיכוב. בשורה הראשונה משמאל לימין: (4R)-fluoroproline, (4R) - hydroxyproline, (4R) - methanoproline, כלורמפניקול (400 µg/mL; מיקרוביאלית בקרה חיובית). שורה שנייה: (4S)-fluoroproline, (4S) - hydroxyproline, (4S) - methanoproline, פרולין (פראי-סוג פקד). הערה המינוח הכימי; למשל, (4R) - fluoroproline גם נקרא טרנס-4 - fluoroproline. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
ספקטרומטר מסה LC-ESI-תוף לאחר טיהור IMAC, שיתוף ncAAs לתוך nisin נותחה על ידי LC-ESI-תוף ספקטרומטר מסה. איור 4 מציג את ספקטרום המוני deconvoluted של משתנה nisin המכיל (4R)-fluoroproline. וריאנט זה היה ה-IMAC מטוהרים כמתואר לעיל, לאחר מכן נותחו על ידי LC-ESI-תוף ספקטרומטר מסה, אז זה עדיין נשא המנהיג. הפסגה המרכזית איור 4A תואמת nisin ששונה המכיל (4R)-fluoroproline עם מסה deconvoluted של דה 6883.18 (המסה המחושבת 6882.05 דא, לחשב כמות פפטיד פראי-סוג התואם עם פרולין- עמדת 9 הינה 6864.06 Da). שתי הפסגות עם שפע התחתון, מסה גבוהה יותר שיתאימו נתרן adducts כמצוין. איור 4 B מראה אחרת טעונה מינים של הראשי במתחם כפי שנמצא על ידי האלגוריתם deconvolution. לדוגמה, הפסגה-מ 1148.11/z מתייחס המינים טעונים six-fold ([M + 6H]6 +).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig4.jpg"> איור 4 . LC-ESI-תוף ספקטרומטר מסה של טיהור-IMAC nisin רקומביננטי משתנים המכילים (4R)-fluoroproline. (א) Deconvoluted chromatogram ספקטרומטר מסה (הגדלה שיבוץ) עבור הגרסה nisin (עדיין נושא את המנהיג) עם (4R)-fluoroproline (צפוי ההמונים (Da): [M + H]+ = 6882.05, [M + Na]+ = 6904.03, [M + 2Na]2 + = 6926.02). (B) במתחם spectra עבור מינים [M + H]+. צפוי ההמונים (Da): [M + 5H]5 + = 1377.41, [M + 6 H]6 + = 1148.01, [M + 7 H]7 + = 984.15, [M + 8 H]8 + = 861.26, [M + 9 H]9 + = 765.67, [M + 10 H]10 + = 689.21, [M + 11 H]11 + = 626.64, [M + 12 H] 12 + = 574.50. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ניתן גם להראות פעילות מיקרוביאלית של nisin רקומביננטי והווריאנטים שלה המכילים המכללות על ידי התבוננות ישירה ל' lactis מחוון זן באמצעות קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. הנילוס אדום, הפלורסנט מאוד הידרופוביות, שימש כדי להכתים את קרום תא החיידק. איור 5 מראה את השינוי האיכותי של מצב צבירה של תרבית תאים, תא בודד מורפולוגיה. התאים היו מוכתמים באדום הנילוס, שהופקדו על שקופית כיסוי מיקרוסקופ. בשורה העליונה מציגה את התאים ישירות בהתחלה כאשר מאגר, רקומביננטי פראי-סוג nisin, או nisin המכיל (4R)-fluoroproline, או (4R)-hydroxyproline נוספו. החלונית התחתונה מציגה את התמונות המתאימות לאחר 20 דקות של דגירה.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig5.jpg"> איור 5 . קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה של nisin רקומביננטי השפעות על תאים גראם חיובי. תמונות מיקרוסקופיות של 30 µL ל' lactis מחוון זן (OD600 = 1) מסומן עם הנילוס אדום צולמו לפני (החלונית העליונה) ואחרי (החלונית התחתונה) הדגירה 20 דקות עם מאגר 1 µL (A), 0.3 µL רקומביננטי פראי-סוג nisin (B), 0.6 משתנים nisin של µL, המכילים (4R)-fluoroproline (ג) ו- (4R)-hydroxyproline (D). העיגולים הכחולים לסמן אזורים עם תאים צבור או מעוות, כחול נקודת חצים לאזורים שבהם יכול להיות שנצפו פעפוע של קרום פלורסנט קטעים. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
איור 5 א מראה כי המראה הכללי של התאים לא השתנה בתוך 20 דקות של התבוננות. רק את מספר התאים שנוצרו בזמן הוורד זמן ולכן כמות גדולה של תאים הוא גלוי בתוך מיקרומטר מיקרומטר 80 x 80 האזור שנצפו. איור 5 B מראה התאים גראם חיוביים הופיע צבורים מטושטשים (מסומנים בעיגולים כחולים) לאחר 20 דקות של חשיפה פראי-סוג nisin, נוספו גם כאשר נמוך כמויות (כאן, • IMAC תנאי µL 0.3). בנוסף, חומר אור פיזור מתאי למאגר, המציין כי קרום שברי המסומנים הנילוס אדום הונעו במהלך מסגרת הזמן (מסומן על ידי החצים הכחולים). ממצאים אלה מצביעים על פירוק התא כמוצג זה היה להתרחש בעת טיפול עם6,nisin49. תופעות דומות נצפו לאחר דגירה עם nisin variant המכיל (4R) - fluoroproline (איור 5C) וגם nisin המכיל (4R) - hydroxyproline (איור 5D) מציג שני גדולים כמויות של תאים מעוותים ולא צבורים אחרי 20 דקות, בניגוד בולט המדגם שליטה (איור 5א).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
			<td>ריכוז</td>
		</tr>
<tr>
<td>(NH4) 2 אז4 </td>
			<td>7.5 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>8.5 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>2פו ח'4
</td>
			<td>22 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>K-2-HPO-4
</td>
			<td>50 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>1 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-גלוקוז</td>
			<td>20 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>כל חומצות האמינו הקנונית (פרט אחד כדי להחליף)</td>
			<td>50 מ"ג/ליטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 +
</td>
			<td>µg 1/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe2 +
</td>
			<td>µg 1/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>יסודות קורט (Cu2 +Zn2 +, Mn2 +, MoOH2 +)</td>
			<td>µg 0.01/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>תיאמין</td>
			<td>µg 10/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ביוטין</td>
			<td>µg 10/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. ההרכב של NMM19 מוגדרים כימי בינוני התפתחות חיידקים לאחר הכנה לפי שלב 2.

הפרוטוקול מציג את Escherichia coli-המבוסס על הלחץ הסלקטיבי השתלבות של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) nisin פפטיד מיקרוביאלית lactococcal. ניתן לשנות את מאפייניו במהלך רקומביננטי ביטוי באמצעות החלפת עם ncAAs הרצוי בתקשורת צמיחה מוגדרים. השינויים הנובעים מכך באתריים ממופים על ידי הצמיחה עיכוב מבחני פלורסצנטיות מיקרוסקופ.

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לשלב חומצות אמינו לא קנוניות בפפטידים אנטי-מיקרוביאליים המסונתזים ריבוזומלית. פפטיד דנטורציה חדש מיוצר, נבדק לנוכחות ncAA ונבדק לפעילות אנטי-מיקרוביאלית באמצעות מבחני דיפוזיה של אגר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על כמה שאלות מפתח בתחום האנטי-מיקרוביאלים או החיידקים, כגון תפקידם של מיקומי פפטידים מסוימים באופן הפעולה או בפיתוח עמידות.על פי אותם עקרונות של מגוון פרופסים כגון פפטידים פחותים או ניתן לייצר וניתן לבדוק את הזיהוי כנגד פתוגנים כגון MRSA. ניתן לייצר פפטידים חדשים בטבע לפיתוח חומרים אנטי-מיקרוביאליים כדי להילחם בפתוגנים ולהתגבר על החוסרים של תרופות אנטי-מיקרוביאליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבדוק את מגוון חומצות האמינו הלא קנוניות במקביל מבלי לדרוש שינויים ברמה הגנטית.כתוצאה מכך, קל יחסית לייצר מספר פפטידים מותאמים במקביל. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו 25 מיליליטר של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה ואחוז אחד של גלוקוז בבקבוק ארלנמאייר של 100 מיליליטר. חסנו אותו באמצעות מושבה של תאי חיידקים שזה עתה עברו טרנספורמציה, או תאים ממאגר תאים קפוא.דגרו על התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד. למחרת, הוסף 10 מיליליטר תרבית לילה לליטר אחד של מדיום טרי סטרילי. מערבבים ומפצלים את התרבית לשתי תרביות של 500 מיליליטר כל אחת בבקבוק ארלנמאייר של שני ליטר ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך שעתיים לאחר שעתיים, מודדים את ה-OD 600 באמצעות מדיום סטרילי כריק.המשך בדגירה ומדוד את ה-OD במרווחי זמן קבועים עד שה-OD 600 שווה ל-0.5. לאחר מכן, משוך גם תרביות חיידקים וגם צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ו -4, 500 x גרם למשך 15 דקות. לאחר מכן, שפכו והשליכו את הסופרנטנט.השעו מחדש את כדור התא בדלי צנטריפוגה המונח על קרח עם 20 מיליליטר NMM19 המכיל אנטיביוטיקה ואחוז אחד גלוקוז. העבירו את תרחיף התאים לצינור של 50 מיליליטר וצנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ו -4, 500 x גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר מאותו מדיום טרי על קרח.העבירו את תרחיף התא לתוך 500 מיליליטר של מדיום טרי ודגרו בחום של 30 מעלות צלזיוס ו -200 סל"ד למשך שעה. לאחר שעה, חלקו את התרבית לשני חלקים שווים בצלוחיות בודדות, אחת לכל ncAA או בקרה בהתאמה. לכל תרבית, הוסף את מלאי ncAA לריכוז סופי של מילימולר אחד ולבקרת סוג הבר, הוסף מלאי L-proline למילימולר אחד.לאחר מכן, לגרום לביטוי גן מטרה באמצעות IPTG מילי-מולרי אחד. דגרו על התרביות למשך הלילה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד. למחרת, מדוד את ה-OD וקח מיליליטר אחד מכל תרבית לבדיקות הפעילות.אוספים את התאים הנותרים של כל תרבית על ידי צנטריפוגה חוזרת ונשנית בארבע מעלות צלזיוס ו -5,000 x גרם למשך 20 דקות. בכל פעם, הוציאו והשליכו את הסופרנטנט עד שכל התאים נאספו. אחסן את כדוריות התא במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לטיהור הפפטיד.להכנת צלחות GM17-agar, הכינו תחילה תרבית לילה של חמישה מיליליטר של זן האינדיקטור ממלאי גליצרול קפוא במרק M17 עם אחוז אחד של גלוקוז וחמישה מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול בבקבוק ארלנמאייר של 25 מיליליטר. דגרו על 30 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד. למחרת, מדוד את ה-OD באמצעות מדיום GM17 כריק הוסף את חמשת המיליליטר של מדיום טרי בבקבוק חדש.יש לחסן ל-OD 600 השווה ל-0.1 ולהמשיך בדגירה. לאחר שעתיים, מדוד את ה-OD במרווחי זמן קבועים עד שהערך מגיע ל-0.4 עד 0.6. לאחר מכן מניחים ושומרים את התרבות המוקדמת על הקרח.הכינו 1.5 אחוז אגר על ידי שקילת 4.5 גרם אגר בבקבוק מדיה מזכוכית. מוסיפים 300 מיליליטר מים מזוקקים כפולים, ואז מערבבים ומחטטים. מכינים שני מרק M17 ב -300 מיליליטר מים מזוקקים כפולים וחיטוי.הוסף מיליליטר אחד של תרבית קדם לקטוקוקוס לקטיס ל-25 מיליליטר של שני ציר M17 המכילים 10 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול ושני אחוז גלוקוז. לאחר מכן מוסיפים 25 מיליליטר תערובת אגר מותכת פושרת ויוצקים את התמיסה לצלחת פטרי גדולה. תוך שמירה על תנאים סטריליים, יבש את הצלחת למשך 10 עד 15 דקות.לאחר מכן, עקרו את הקצוות של פיפטת פסטר מזכוכית על ידי להבה לאחר שהפיפטה התקררה, השתמש בקצה הרחב שלה כדי ליצור חורים באגר המוצק. סמן את החלק התחתון של צלחת הפטרי עבור כל דגימה ליד מיקום החור המתאים. לצורך בדיקת הפעילות, קח את דגימות המיליליטר של תרביות הייצור של E.coli וצנטריפוגה אותן למשך שלוש דקות ב-7,000 x g שאפו את המדיום הנותר והשעו מחדש את כדור התא ב-500 מיקרוליטר של מאגר נתרן פוספט על ידי פיפטינג.לאחר מכן, סוניקציה של הדגימה על קרח על ידי טבילת קצה בדיקת הסוניקטור לתוך תרחיף התא. התחל את הסוניקציה. לאחר מכן, צנטריפוגה של התא ליזאט למשך 10 דקות ב-13,000 x גרם לפסולת תאים.העבירו את הסופרנטנט לצינור תגובה חדש על קרח. לדלל ולנרמל את הסופרנטנטים למיליליטר אחד של OD 600 השווה ל-0.6, ביחס לצפיפות התאים שנקטפו, עם מאגר נתרן פוספט ומערבבים. כדי לבדוק את הפעילות המיקרוביאלית, הוסף 40 מיקרוליטר מהדגימה המנורמלת לחור המיועד של אגר המחוון.המתן עד שכל הדגימות יתפזרו לאגר. דגרו את הצלחת למשך הלילה בחום של 30 מעלות צלזיוס. למחרת, צלם את צלחת האגר באמצעות סורק מיטה שטוחה או מצלמה דיגיטלית.ניתן למדוד את גודל הילת עיכוב הגדילה ביד או באמצעות תוכנה. למיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הכינו תמיסת מלאי נילוס אדום של 10 מילי-מולר ב-DMSO. עבור בדיקת הפעילות, תרבית מתח המחוון ל-OD 600 שווה לאחד.צנטריפוגה מיליליטר אחד של התרבית למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס ו-5,000 x גרם. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הדגימה במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה והשעתה שוב.לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי אדום הנילוס ומערבבים בעדינות. לרכישת תמונה מיקרוסקופית, הוסף 30 מיקרוליטר של הכנת תאים על שקופית כיסוי תוך כדי מרגש ב-520 ננומטר. הגדר את זמן הרכישה ל-0.2 שניות, סדרה קינטית ל-0.1 הרץ ואורך הסדרה ל-200 תמונות.לאחר מכן, הוסף 0.3 עד 1.5 מיקרוליטר של ליזאט תאים או דגימות פפטיד מטוהרות. עקוב ורשום את פליטת הקרינה באורך גל השווה או גדול יותר ל-560 ננומטר. אחסן את רצפי התמונות כקבצי avi ונתח את התמונות באמצעות ImageJ.איור זה מציג את עיכוב הצמיחה של זן האינדיקטור החיידקי על ידי פפטידים אנטי-מיקרוביאליים רקומביננטיים המכילים אנלוגים של פרולין. כחלק מבדיקת דיפוזיה של ריתוך אגר, הילות עיכוב נראות סביב עמדות הדגימה. סרטון זה מציג מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מתח המחוון ללא תוספת של הפפטידים האנטי-מיקרוביאליים.עם הזמן, תאי חיידקים מופקדים על שקופית הכיסוי מכיוון שנוסף רק חיץ, מראה התאים אינו משתנה תוך 20 דקות של תצפית. חלוף זמן זה של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מראה את ההשפעות של פפטיד אנטי-מיקרוביאלי על תאים של זן האינדיקטורים. עם הזמן, תאי החיידקים נראים מצטברים ומטושטשים לאחר חשיפה לוריאנט ניסין המכיל את חומצת האמינו הלא קנונית 4R הידרוקסיפרולין כפי שמודגש על ידי החץ.מסומן במעגלים, חומר קל מתפזר מהתאים לתוך המאגר מה שמצביע על כך ששברי הממברנה גויסו. איור זה, מראה את ההשפעות לאחר הדגירה של זן האינדיקטור בהווה של ניסין מסוג בר או גרסאות המכילות חומצות אמינו לא קנוניות. לאחר חשיפה לפפטיד האנטי-מיקרוביאלי, תאי החיידקים מצטברים כפי שמוצג על ידי העיגולים.מציין ליזטים של תאים, חומר אור נראה סביב התאים כפי שמוצג על ידי החצים. כמות גדולה של תאים מעוותים ומצטברים קיימת לאחר 20 דקות של דגירה בניגוד לבקרה השלילית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבעה ימים.זה כולל ייצור של פפטידים שעברו שינוי ncAA, ובדיקת פעילות באמצעות מבחני דיפוזיה של ריתוך אגר ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בתרביות חיידקים טריות ובאמצעי גידול מתאימים ולטפל בהן בזהירות. לבדיקת פעילות, כלול תמיד בקרות חיוביות ושליליות מתאימות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות לטיהור פפטידים על ידי כרומטוגרפיה זיקה ו/או HPLC. ספקטרומטריית מסה היא חובה כדי להוכיח את שילוב חומצת האמינו הלא קנונית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור פפטידים אנטי-מיקרוביאליים חדשים יותר, מארח אנטיבקטריאלי או מיקרוביאלי אחר יכול לשמש לייצור על פפטידים שונים ולבדיקת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלב חומצות אמינו לא קנוניות בפפטידים אנטי-מיקרוביאליים.

antimicrobial-peptides-produced-selective-pressure-incorporation-non

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מתוארת שיטה פשוטה וכללית לסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות הקרנת מיקרוגל. הליך זה מאפשר סינתזה של פפטידים מחזוריים של עמוד השדרה עם אוסף של קונפורמציות שונות תוך שמירה על שרשראות הצד והחלקים הפרמקופוריים., ולכן מאפשר לסנן את הקונפורמציה הביו-אקטיבית.

פיתוח של עמוד השדרה ספריית פפטיד מחזורי כנגד טפילי פוטנציאל Therapeutics שימוש מיקרוגל הקרנה

פרוטוקול ביטוי קל לשימוש ונטול תאים לשילוב ספציפי לשאריות של אנלוגים של חומצות אמינו לא קנוניות בחלבונים, כולל ניתוח במורד הזרם, מוצג למחקרים רפואיים, פרמצבטיים, מבניים ופונקציונליים.

שאריות ספציפיות התאגדות של חומצות אמינו Noncanonical לחלבוני דגם שימוש<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; חינם-Cell מערכת-תמלול תרגום

המטרה של פרוטוקול זה היא לפתח התייחסות חלבונים מתבדרת בקבוצה חסר קוהרנטי לקריטריונים במינוח והסיווג. הפניה זו יקל על ניתוח ודיון של הקבוצה בכללותה, יכול לשמש שמות הוקמה.

ליצירה והחלה הפניה כדי לקדם את הדיון ואת הסיווג של חלבונים בתוך קבוצה מגוונת

ביולוגיה סינתטית מאפשר ההנדסה של חלבונים עם מאפיינים חסרת תקדים באמצעות החדרת חומצות אמינו קאנונית co-translational. . הנה, הצגנו איך spectrally אדום-העביר גרסה של fluorophore GFP-סוג עם מאפייני ספקטרוסקופיות הרומן פלורסצנטיות, הנקרא חלבון פלואורסצנטי "זהב" (GdFP), מופק ב e. coli באמצעות הלחץ הסלקטיבי ההתאגדות (SPI).

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצר גראם שליליים Escherichia coli (e. coli) spheroplasts, גראם חיוביים Bacillus megaterium (נולד ב- megaterium) protoplasts כדי להמחיש באופן ברור ולאפיין במהירות אינטראקציות פפטיד-חיידקים. זה מספק שיטה שיטתית כדי להגדיר ממברנה ההתאמה לשפות אחרות, translocating פפטידים.

ייצור והדמיה של חיידקי Spheroplasts ו- Protoplasts כדי לאפיין פפטיד מיקרוביאלית לוקליזציה

מחקר זה מציג אסטרטגיה חלופית לשיטה הקונבנציונלית הרעילה האנטי-אנלוגית בזיהוי מפיקי מיתר של חומצות אמינו באמצעות סמנים נדירים-מאוד עשירים להשגת דיוק, רגישות ותפוקה גבוהה בו זמנית.

זיהוי חומצת אמינו מפיקי יתר באמצעות נדירים-Codon-מסמנים עשירים

כדי להתגבר על המגבלות של מוטגנזה קלאסית מכוונת אתר, אנלוגים פרולין עם שינויים ספציפיים שולבו במספר חלבונים פלואורסצנטיים. אנו מראים כיצד החלפת מימן על ידי פלואור או של היחיד על ידי קשרים כפולים בשאריות פרולין ("ניתוח מולקולרי") משפיעה על תכונות חלבון בסיסיות, כולל קיפולם ואינטראקציה עם אור.

חילופי פרולין ספציפיים לשאריות על ידי אנלוגים פרולין בחלבונים פלואורסצנטיים: כיצד "ניתוח מולקולרי" של עמוד השדרה משפיע על קיפול ויציבות

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקבלת נתונים כמותיים על הפעילות האנטי-פטרייתית של פפטידים ותרכובות אחרות, כגון חומרים אנטי-פטרייתיים בעלי מולקולות קטנות, כנגד קנדידה אלביקנס. השימוש בו בצפיפות אופטית במקום לספור יחידות יוצרות מושבה כדי לכמת עיכוב גדילה חוסך זמן ומשאבים.

כימות הפעילות האנטי פטרייתית של פפטידים נגד קנדידה אלביקנס

פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור והערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית והציטוטוקסיות של הפפטיד הקטיוני Mel4 ושל הפפטיד המדמה RK758. על ידי שילוב סינתזה כימית, ביטוי רקומביננטי ובדיקות פונקציונליות סטנדרטיות, הוא מספק תהליך עבודה יעיל לייצור ובדיקה של פפטידים וחיקוי מולקולות קטנות.

ייצור ובדיקות של פפטידים אנטימיקרוביאליים והחיקויים שלהם

Isotachophoresis (ITP) היא הפרדה electrokinetic חזקים בטכניקה preconcentration עם יישומים החל איתור הרעלן הכנת המדגם. אנו בודקים את עקרונות פיסיקליים של ITP ו המתודולוגיה של יישום טכניקה זו שני יישומים דוגמה ספציפית: הפרדה וזיהוי של מולקולות קטנות וטיהור של חומצות גרעין מ lysate תרבית תאים.

על שבב Isotachophoresis להפרדה של יוני וטיהור של חומצות גרעין

למד כיצד לשלב חומצות אמינו קאנונית בפפטידים אנטימיקרוביאליים כגון ניסין באמצעות Escherichia coli. שיטה זו מאפשרת הערכת פעילות אנטימיקרוביאלית באמצעות מבחני דיפוזיה באגר ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה לפיתוח תרופות חדשות.

פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית

גלה סרטונים נוספים