ניצול של אולטרסאונד מודרכת מכוון רקמות השרשה הסלולר להקמתה של גידול גרורתי רלוונטי מבחינה ביולוגית Xenografts

מטרת שיטה זו היא לבסס קסנוגרפים אורתוטופיים רלוונטיים מבחינה ביולוגית לסרטן למחקרים פרה-קליניים. תאי נוירובלסטומה שמקורם בחולה מוזרקים לבלוטת יותרת הכליה של העכבר על ידי הנחיית אולטרסאונד ללא ניתוח פתוח או החלמה ממושכת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות קריטיות בביולוגיה של הסרטן ובמחקר תרגומי, כגון מחקרים על אבולוציה של גידולים, תגובות טיפוליות במיקרו-סביבה המקומית וגרורות.

ידע כזה ישפר מאוד את האמינות של מחקרים פרה-קליניים ויקל על גילוי תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא נגזרת מהמטופל, מכוונת רקמות, יעילה ואמינה בהפקת מודל קסנוגרפי אורתוטופי למחקר טיפול בסרטן. מי שידגים את השלבים הקריטיים בהליך יהיו סהיטי צ'וקאפאלי, טכנאי בכיר ומנהל המעבדה שלנו, יחד עם טינה תומאס, עמיתת מחקר במעבדה שלנו.

צור תרחיף תאים סרטניים יחיד שמקורו בחולה מרקמת הגידול באמצעות ערכת דיסוציאציה של גידול. התחל בהעברת כחצי גרם של רקמת גידול לצלחת תרבית תאים של 100 מילימטר המכילה חמישה מיליליטר של מאגר RPMI בתוספת אנזימים. לאחר מכן, השתמש במספריים ובמלקחיים כדי לטחון את הגידול לחתיכות קטנות של שניים עד ארבעה מילימטרים.

הכניסו את תערובת הגידול לתוך צינור דיסוציאטר וסגרו את הצינור. הפוך את הצינור, חבר לשרוול של מפרק רקמות ונתק את הרקמה באמצעות התוכנית המתאימה. לאחר הניתוק, דגרו את תרחיף תאי הגידול על מתלה מסתובב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

יש לשלש את תרחיף התאים כל 15 דקות במהלך הדגירה. לאחר הדגירה, העבירו את תרחיף התא לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר והוסיפו 10 מיליליטר RPMI. לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא ב-314 גרם למשך חמש דקות.

לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה את הכדור בחמישה מיליליטר RPMI. העבירו את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון ואספו את התמיסה המתוחה, לתוך צינור טרי של 50 מיליליטר. לאחר שטיפת המסננת בחמישה מיליליטר של אמצעי RPMI, צנטריפוגה את תרחיף התא ב-314 גרם למשך חמש דקות כדי לאסוף גלולה.

ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, השעו את הגלולה ב-RPMI כדי לקבל ריכוז סופי של ארבע פעמים 10 לחמשת התאים לנפח של 10 מיקרוליטר. העבירו חמישה מיקרוליטרים של תרחיף תאים זה בכל הזרקה לצינור טרי, ואותו נפח של מטריצת קרום המרתף כדי ליצור 10 מיקרוליטר של תמיסת תאים לכל הזרקה ולהניח אותה על קרח.

העבר את העכבר לפלטפורמת ההדמיה כשצד הבטן כלפי מטה. התקן ואבטח את חרוט האף כדי לשמור על הרדמת איזופלורן. התחל את הליך ההשתלה באמצעות קרם להסרת שיער ומכונת גילוח כדי להסיר את החלק האחורי והצד של עכבר NSG מורדם כראוי בן שישה עד שמונה שבועות.

מרחו משחה אופטית על עיני החיה כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, הדביקו את העכבר למקומו כדי למנוע תנועה לא מכוונת. לאחר מכן, השתמש בהדמיית אולטרסאונד כדי לזהות את כבד העכבר, הווריד הנבוב, הטחול, הכליה השמאלית ובלוטת יותרת הכליה השמאלית הסמוכה.

טען מזרק המילטון מקורר, מצויד במחט קדח קטנה, עם 10 מיקרוליטר של תמיסת תאים. לאחר מכן, בהנחיית אולטרסאונד, החדיר בעדינות קטטר מקורר בקוטר 22 מד דרך העור ושריר הגב, ישירות לבלוטת יותרת הכליה השמאלית כדי לספק תעלה להזרקה תאית. הסר את המחט והשאיר את הקטטר במקומו.

הדמיה של בלוטת יותרת הכליה לאורך החדרת הצנתר, יחד עם המחט ומסלולה, היא הכרחית כדי להבטיח פגיעה מינימלית במבנים ובאיברים הסובבים ולהוריד את תחלואת העכברים. לאחר מכן, הנח את המזרק דרך הצנתר הממוקם במרכז בלוטת יותרת הכליה. מכיוון שהמזרק מונחה דרך הצנתר, חשוב לשמור על יציבות הצנתר ולצפות בהתקדמות המחט.

שימו לב שהמחט עצמה משתרעת כשני מילימטרים מעבר לסיום הצנתר, ומיקומה נראה בקלות באולטרסאונד. הזרקת התאים לרקמת יותרת הכליה הממוקדת. השאירו את המחט במקומה למשך דקה עד שתיים כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתייצב.

לאחר שמטריצת קרום המרתף התייצבה, הסר לאט את המחט, ואחריה הסרת הקטטר. לבסוף, הכניסו את העכבר לכלוב התאוששות עד שהוא יחזור להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה חזה לפני שהוא חוזר לכלוב הביתי. הדמיית אולטרסאונד עוקבת אחר התקדמות הגידול in vivo.

תמונה זו מציגה תמונת אולטרסאונד של בלוטת יותרת הכליה, שבוע לאחר ההזרקה. כאן, הדמיית זוהר של עכבר שהוזרק לנוירובלסטומה שבוע לאחר ההזרקה, מראה קריאות שאינן מעידות על השתלת גידול. לאחר שבועיים, הדמיית אולטרסאונד מראה השתלת הגידול והתקדמותו לשטח של כ-40 מילימטרים רבועים.

ביולומינסנציה שבועיים לאחר ההזרקה הראתה קרינה בגודל 10 עד השביעי, מה שמרמז על קליטת תאים וצמיחת גידול בקורלציה עם ממצאי אולטרסאונד. הדמיית אולטרסאונד שמונה שבועות לאחר ההזרקה הראתה המשך צמיחת הגידול עם מדידת שטח של יותר מ-100 מילימטרים רבועים. שוב, ביולומינסנציה אישרה את ממצאי האולטרסאונד עם רמות קרינה מוגברות של 10 עד תשע.

הדמיית אולטרסאונד תלת-ממדית של הגידול הראתה נפח גדול מ-100 מילימטר מעוקב, קו הבסיס בו משתמשת המעבדה שלנו להתחלת ניסויים טיפוליים פרה-קליניים. גידול שנכרת נמדד באופן גס בגודל של יותר מסנטימטר אחד, בקורלציה עם מדידות אולטרסאונד ואותות זוהר. מדיה זו מספקת הדגמה כיצד להקים בהצלחה קסנוגרפים אורתוטופיים של יותרת הכליה עם תאי נוירובלסטומה שמקורם בחולה, תוך שימוש בהנחיית אולטרסאונד.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מ-12 דקות לכל הזרקה אם היא מבוצעת כראוי.