לייזר Microdissection לכידה של מאוד טהור Meshwork Trabecular מעיני העכבר עבור ניתוח ביטוי גנטי

המטרה הכוללת של הליך מיקרו-דיסקציה לייזר זה היא לפתח שיטה חזקה וניתנת לשחזור לבידוד של רשת טרבקולרית מועשרת מאוד מעיני עכבר באמצעות מיקרוסקופ לכידת לייזר לבידוד RNA לאחר מכן וניתוח ביטוי במורד הזרם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום רפואת העיניים כגון מהם הגנים ומסלולי האיתות החשובים שכאשר הם מווסתים בצורה שגויה, עלולים להוביל למחלות עיניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבודד RNA איכותי מרשת טרבקולרית של עיני עכבר לצורך ניתוח ביטוי גנים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שמיקרו-דיסקציה בלייזר היא טכניקה רבת עוצמה הכוללת שלבי פתרון בעיות שונים לאורך כל הפרוטוקול. התחל הליך זה באיסוף רקמות אופטימלי למיקרו-דיסקציה בלייזר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ריססו תמיסת טיהור RNase על המברשת, המלקחיים, צנצנות הצימוד וצ'אק ההרכבה.

לאחר ניגוב יסודי יש לשטוף את המכשיר במים נטולי נוקלאז ולייבש. נגב את הקריוסטט עם 100% אתנול כדי למנוע זיהום צולב. סחטו כמות קטנה של O.C.T על צ'אק ההרכבה, ולאחר מכן הסירו את גוש הרקמות מהתבנית והניחו בזהירות את הבלוק על צ'אק ההרכבה.

לאחר שבלוק הרקמות על צ'אק ההרכבה קפוא מוצק, הכנס למחזיק הדגימה של הקריוסטט. לאחר מכן, כוונן את הקריוסטט כדי לחתוך חלקים של שמונה מיקרון וחתך בזהירות את בלוק ה-O.C.T כדי להגיע לדגימת הרקמה. לאחר התבוננות ברקמה, הפסק את החיתוך.

חתוך את הבלוקים הקפואים מכל הצדדים באמצעות סכין גילוח נקי והשאיר שלושה עד ארבעה מילימטרים של O.C.T סביב הרקמה כדי לאפשר טיפול עם מברשת הצבע. חתך דרך העין, עובד במהירות. הכתים כל חלק שלישי על ידי הצפת השקופית בכתם H&E מהיר בצעד אחד למשך 60 שניות.

שוטפים את החלק במי ברז ומייבשים באוויר. לאחר ניקוי הקטע בעזרת חומר ניקוי, הרכיב את הקטע על מגלשת זכוכית טעונה עם החלקת כיסוי, סקור תחת המיקרוסקופ. המשך בחתך עד שה-TM ניכר בחלקים המוכתמים.

ברגע שה-TM מתחיל להופיע, חתוך שני חלקים והרכיב אותם על שקופית זכוכית טעונה לצביעה שגרתית של H&E כדי ליצור מפה לחיתוך עם מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר. לאחר שקופית מפת H&E הראשונה, חתוך ויישר שישה חלקים סדרתיים בעובי שמונה מיקרון בקריוסטט ובו זמנית הרכיב אותם על שקופית ממברנת ה-PET. הדביקו את הרקמה על ידי החלקה קצרה של אגודל עטוי כפפה לאורך החלק האחורי של הממברנה.

לאחר ההרכבה, הנח את שקופית קרום ה-PET מיד לתוך קופסת שקופיות על קרח יבש. יש להמשיך לחתוך את העין. לאחר כל שתי שקופיות ממברנת PET עם שישה חלקים כל אחת, אסוף שני חלקים על שקופית זכוכית טעונה כדי ליצור שקופית מפה נוספת לצביעה H&E.

המשך לחתוך כ-100 חלקים סדרתיים בעובי שמונה מיקרון עד שה-TM כבר לא נראה לעין. אשר את היעדר המדיטציה הטרנסנדנטלית על ידי צביעה מהירה של חלק אחד על מגלשת זכוכית טעונה. לאחר ביצוע צביעת שקופיות מפת H&E כמתואר בפרוטוקול הטקסט, סקור את שקופיות H&E באופן חזותי באמצעות מיקרוסקופ.

זהה שקופיות מפה עם TM גלוי בבירור ונגיש לחיתוך. השתמש בשקופיות ממברנת ה-PET בין שקופיות המפה הללו עבור LCM. הסר את קופסת ההחלקה המכילה קטעי רקמה קפואים מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס והנח אותה על קרח יבש.

עבד את השקופיות אחת בכל פעם. תקן את החלקים על ידי הנחת השקופית מיד לתוך מעכבי RNase 75% אתנול קר למשך 30 שניות. טבלו בעדינות את השקופית במים נטולי נוקלאז למשך 10 עד 15 שניות כדי להמיס את ה-O.C.T מבלי להפריע לקטעי הרקמה.

פיפטה בזהירות 300 מיקרוליטר של תמיסת אצטט סגולה 1.5% קרסיל ישירות על החלקים ודגירה למשך 45 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את החלקים פעם אחת על ידי הכנסתם לאמבט אתנול 75% למשך 30 שניות. פיפטה 200 מיקרוליטר של תמיסת Eosin Y על החלקים ודגירה למשך שלוש עד חמש שניות.

ייבשו את הרקמה על ידי הנחת המגלשות לאחר מכן ב-75% אתנול, 95% אתנול, ולבסוף אמבט 100% אתנול למשך 30 שניות כל אחת. כתם את קצה השקופית עם מגבון טישו בין כל שלב כדי להסיר עודפי נוזלים. תן לאוויר המגלשה להתייבש לחלוטין מתחת למכסה המנוע למשך חמש דקות.

לאחר הייבוש, בצע LCM מיד לאחר מכן. הימנע משימוש בקסילן בשלב הפינוי האחרון. טיפול בקסילן יגרום לחלק הרקמה לעלות בצורה לא מספקת לשקופית הממברנה.

קסילן גם יפחית את יעילות לכידת הרקמה על ידי LCM. הנח את שקופית ממברנת ה-PET כשצד הרקמה המוכתמת פונה כלפי מטה ישירות על החלק העליון של שקופית זכוכית חדשה שהועמסה על המיקרוסקופ stage. ודא שהממברנה ושקופית הזכוכית מותאמים היטב על במת המיקרוסקופ.

הפעל את LCM על ידי הגדרת מגבלות ההחלקה תחילה. בחר את ההגדלה הנמוכה ביותר של פי 4 בחלונית האובייקטיב, ולאחר מכן הגדר את אזור העבודה של שקופית הממברנה על ידי הזזת שלב ה-XY של המיקרוסקופ עד לפינה השמאלית העליונה, שבה המתכת והממברנה נפגשים, נראית בהזנת הווידאו החי. בשלב זה, לחץ על כפתור הגבל 1 ומלבן אדום יופיע על מפת הדרכים.

לאחר מכן, העבר את ה-XYTAGה לפינה הנגדית ולחץ על כפתור הגבלה 2. לחץ על כפתור הסריקה כדי ליצור תמונת מפת דרכים של הממברנה והרקמות בין הגבולות שנקבעו. לחץ פעמיים ליד המדיטציה הטרנסנדנטלית של אחד מחלקי העיניים במפת הדרכים.

המדיטציה הטרנסנדנטלית יכולה להיות ממוקמת ליד קודקוד הזווית האירידו-קרנית. לאחר זיהוי המדיטציה הטרנסנדנטלית, הגדילו את ההגדלה ל-10X והתמקדו ידנית במדיטציה הטרנסנדנטלית. חזור על הפעולה עם יעדים של 20X ו-40X. כאשר המדיטציה הטרנסנדנטלית ממוקדת עם המטרה 40X, נווטו לאזור ריק, בחרו בכלי הציור ביד חופשית וציירו קו ארוך על אזור ריק של רקמה.

הגדר את פרמטרי הלייזר כך שמהירות החיתוך תהיה 34%, המיקוד הוא 58% וההספק הוא 70%ולאחר מכן לחץ על כפתור הגזירה. בצע התאמות לייזר עדינות לפרמטרי המהירות, המיקוד וההספק עד שנצפה קו חיתוך ברור ועדין. לחיתוך מדויק, ודא שפעולת החיתוך עוקבת אחר הקו המצויר.

לאחר מכן, טען את מכסה צינור הבידוד לתוך מחזיק המכסה ופתח את הצינור. חבר את מחזיק הכובע למעלית הכובע, וודא שהצינור הפוך. כמו כן, ודא שחומר הפקק הדביק בולט מעבר לקצה הכובע כדי להבטיח שהרקמה הרצויה נלכדת כהלכה.

זה קריטי לוודא חזותית שהרשת הטרבקולרית נאספת ומחוברת למכסה הבידוד. בחר במצב חיתוך ידני בלוח התוכנה. בדוק בזהירות שהמדיטציה הטרנסנדנטלית נמצאת ישירות מתחת לצינור הבידוד.

הגדר את איזון הלבן והתאם את הבהירות כדי להשיג איכות תמונה אופטימלית. כדי להתחיל לחתוך, התאם ידנית את המיקוד וצייר קו באמצעות הכלי ביד חופשית. ודא שמכסה האיסוף נשאר במצב למעלה, עדיין לא נוגע בקרום.

צייר עיגולים חלקיים ליד המקום שבו המדיטציה הטרנסנדנטלית פוגשת את הסקלרה ולחץ על גזור. לאחר סיום החיתוכים הראשונים, מקם את הכובע במצב למטה והתאם מחדש את המיקוד, ולאחר מכן צייר שני קווים בחלל הפתוח או הפנוי כדי לחבר את שני העיגולים החלקיים, והשלים את המעגל סביב ה-TM. לאחר מכן לחץ על גזירה ואסוף רקמות מהקטע. ודא שה-TM נאסף על ידי מכסה המיקרו-דיסקציה.

מקם את המכסה בחזרה למצב למעלה וחזור על החלקים הנותרים. כוונן מעט את מיקום המכסה כך שכל הדגימות המבודדות יתאימו למכסה ולא יחפפו. עבור קרום ה-PET הבא, הכנס צינור בידוד חדש וחזור על סעיף זה.

כדי לבצע ליזה של רקמת ה-TM המיקרו-מנותחת, פיפטה בזהירות 10 מיקרוליטר של מאגר ליזה על מכסה צינור האיסוף, וודא שמאגר הליזיס מכסה לחלוטין את ה-TM המיקרו-מנותח. סגור בעדינות את מכסה הדבק ודגר את צינור האיסוף הפוך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה בחום של 800 גרם למשך שתי דקות והניחו את הליזאט על קרח יבש. אחסן את הליזטים במינוס 80 מעלות צלזיוס לטיהור וניתוח מאוחר יותר.

RNA מתפרק במהירות יכול להשפיע על ניתוח ה-RNA במורד הזרם. יש למדוד ולכמת את איכות ה-RNA באמצעות פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה. תוצאות מייצגות של ניתוח ביטוי גנים של ה-RNA הכולל האיכותי המטוהר מהרשת הטרבקולרית מוצגות כאן.

הג'ל הדיגיטלי עבור ה-RNA הכולל שנותר מרקמת העין לאחר מיקרו-דיסקציה בלייזר מראה מספר תקינות RNA גבוה, הדרוש לניתוח ה-RNA במורד הזרם שלאחר מכן. לאחר מיצוי RNA איכותי מהרקמה, ניתן לבצע ניתוח במורד הזרם כגון מיקרו-מערך, RNA-Seq ו-qPCR. כאן, נעשה שימוש בניתוח PCR דיגיטלי כמותי כדי לנתח את הביטוי של הגנים הקשורים לרשת טרבקולרית, מיוצילין ו-ACTA2 מ-RNA שנאסף על ידי LCM.

זה מומחש על ידי מפת החום שנוצרה מנתונים שהתקבלו מניתוח מיקרו-מערך שניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להבין שינויים בביטוי גנים ברשת הטרבקולרית של עכברים מסוג בר ועכברי נוקאאוט עם פנוטיפ IOP מוגבר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יום אחד בלבד לכל חיה ביולוגית אם היא נעשית כראוי. הדגמה חזותית של שיטה זו חיונית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי המיקרו-דיסקציה בלייזר בשל הקושי בהדמיה של התאים המעניינים והיעדר תקנים לדגימות ייחודיות אלה.

הסתמכות על המפעיל המיומן היא קריטית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ש-RNA בכמויות קטנות של רקמה יכול להתפרק במהירות. יש לנקוט באמצעי זהירות כגון טיהור ציוד מ-RNase, מזעור החשיפה לאוויר ושמירה על קור הרקמות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההשפעות של לחץ תוך עיני מוגבר על ביטוי הגנים הספציפי לרשת הטרבקולרית, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון הערכת שינויים בביטוי גנים ברשתית הנגרמים על ידי לחץ תוך עיני מוגבר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו RNA-Seq או micro-array על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אילו מסלולי איתות משתנים ברשת הטרבקולרית של עכברים עם לחץ תוך עיני מוגבר. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור בצורה יעילה יותר שינויים בביטוי גנים ברשת הטרבקולרית במודלים של עכברים.