אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה של כלי הדם והסרטן, כגון מנגנונים של פלסטיות אנדותל במצבים פתולוגיים שונים, כולל סרטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאינדוקציה חזקה של EndMT במבחנה מושגת על ידי טיפול בתאי אנדותל TGF-in MS-1. ראשית גדלו את תאי MS-1 בתנאי תרבית סטנדרטיים והימנעו מהתרבית להיות מתלכדת.

לאחר מכן, על צלחת של 10 ס"מ, שטפו את תאי MS-1 עם מי מלח 1x חוצץ פוספט. לאחר מכן מוסיפים 1 מ"ל טריפסין לצלחת ודוגרים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף 9 מ"ל של מצע תרבית לתאים הטריפסינים לניתוק.

לאחר מכן אסוף את תרחיף התאים הטריפסיני בצינור של 15 מ"ל. צנטריפוגה את מתלה התא בטמפרטורה של 300 עד 400 x G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש במונה תאים אוטומטי כדי לספור את מספר התאים הקיימאים.

לאחר מכן צלחו את תאי MS-1 על צלחות תרבית סטנדרטיות לא מצופות לתרבית ארוכת טווח. לאחר 24 שעות, יש לעורר את תאי האנדותל בריכוז סופי של 1 ננוגרם למיליליטר של TGF-2. לאחר מכן דגרו את צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

לאחר 48 שעות של טיפול, החלף את המדיום במדיום תרבית טרי ומחומם מראש המכיל TGF-2 לניתוח במורד הזרם, צלח את תאי MS-1 על שקופית תא תרבית בת 8 בארות מצופה מראש בג'לטין. לאחר 24 שעות, הוסף 10 M של מעכב ROCK לתרבית התאים. לאחר שעה, יש לעורר את תאי האנדותל בריכוז סופי של 1 ננוגרם למיליליטר של TGF-2.

לאחר מכן דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לתרבית ארוכה של 72 שעות, החלף את המדיום הישן במדיום טרי המכיל TGF-2 לאחר 48 שעות. לאחר יום שלם של טיפול ב-TGF, יש להסיר את המדיום.

לאחר מכן תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד ותמיסת מלח עם פוספט למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סיום תקופת הקיבוע, יש לשטוף את התאים במי מלח עם פוספט. לאחר מכן דגרו על התאים עם 0.2% טריטון X-100 למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר חמש דקות, שטפו שוב את התאים בתמיסת מלח עם פוספט 1x שלוש פעמים. לאחר שלוש כביסות, דגרו את התאים עם פלואונסצין פלואורסצנטי מדולל המכיל חיץ חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את התאים במי מלח 1x חוצץ פוספט, שלוש פעמים.

לאחר מכן צבעו את גרעיני התא באמצעות צבע קושר חומצת גרעין ציאנין למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, שטפו את המגלשה והרכיבו החלקת כיסוי על המגלשה באמצעות אמצעי הרכבה לשקופיות. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

התאים מראים ארגון מחדש של סיבי הלחץ העבים בטיפול ב-TGF-2. זה מצביע על העוצמה של TGF-2 בהשראת EndMT בתאי אנדותל. לאחר 72 שעות של טיפול ב-TGF-2, השליכו את המדיום וקבעו את התאים עם 0.5 עד 1 מ"ל של 50% מתנול קר ו-50% אצטון למשך חמש דקות.

לאחר מכן שטפו את התאים במי מלח עם חוצץ פוספט 1x, שלוש פעמים. לאחר השלמת שלוש השטיפות, דגרו על התאים עם נוגדנים ראשוניים בחסימת המאגר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, בחושך. למחרת, שטפו שוב את התאים במי מלח עם חוצץ פוספט 1x, שלוש פעמים.

לאחר מכן דגרו את התאים עם נוגדן משני מצומד בצבע ירוק ל-VE-cadherin במאגר חוסם, למשך שעה אחת בחושך. שוב שטפו את התאים במי מלח 1x חוצץ פוספט, שלוש פעמים. לאחר מכן צבעו את גרעיני התא באמצעות צבע קושר חומצת גרעין ציאנין למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר חמש דקות, שטפו את המגלשה והרכיבו החלקת כיסוי על המגלשה באמצעות מדיום הרכבה לשקופיות. לאחר מכן התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. התאים מראים ירידה בביטוי של VE-cadherin, וביטוי מוגבר של אקטין שריר חלק לאחר טיפול ב-TGF-2 במשך 48 עד 72 שעות.

לפני בדיקת התכווצות ג'ל הקולגן, תרבית את תאי MS-1 בנוכחות ובהיעדר TGF-2 למשך 72 שעות. לאחר מכן הכינו את ג'ל הקולגן מסוג 1 על קרח. לאחר מכן מערבבים 800 ליטר מתמיסת ג'ל הקולגן עם 200 מ"ל של הבקרה, או תאי אנדותל שטופלו ב-TGF-2.

לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל מתערובת זו לכל באר של צלחת תרבות בת 12 בארות. תנו לג'ל להתמצק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות. לאחר התמצקות הג'ל, הוסף 1 מ"ל של MEM Alpha, המכיל 10% סרום עגל עוברי, 50 יחידות למיליליטר פניצילין ו -50 גרם למיליליטר סטרפטומיצין, כדי לצוף את הג'ל.

לאחר מכן נתק את הג'ל מדופן הבאר, ודגר את הג'ל הצף בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות דגירה, סרוק את תמונות הג'ל מתחתית הצלחת באמצעות סורק. ניתן לראות שינויים מורפולוגיים מובהקים, ההופכים את התאים מהאבן המרוצפת לארכיטקטורה בצורת ציר מזנכימלי עקב חשיפה לטיפול ב-TGF-2 במשך 72 שעות.

מעניין לציין שטיפול TGF בטא 2 במשך 48 עד 72 שעות מראה עלייה הן ברמות ה-mRNA והן ברמות ביטוי החלבון של אקטין שריר חלק בתאי MS-1. בדיקת התכווצות הג'ל מראה גם כי בטיפול ב-TGF-2, ג'ל הקולגן מסוג 1 מתכווץ באופן משמעותי. מעניין לציין כי מחסור ב-TGF-2 מוריד את אקטין השריר החלק לרמה הבסיסית והתאים חוזרים למורפולוגיה המרוצפת, מה שמצביע על כך ש-EndMT הוא תהליך דינמי.

למעשה, עיכוב microRNA 31 על ידי מעכב מיקרו-RNA LNA באמצעות תאי MS-1, מחליש את השראת הסמנים המזנכימליים. עם זאת, המעכב אינו משפיע על השראת גנים ממוקדי TGF כגון פיברונקטין 1, PAI-1 ו-Smad 7. ניתן לבצע מעקב אחר הליך זה כשיטה כמו ביטוי גנים, נוקדאון או אפנון מיקרו-מערך, על מנת לענות על שאלות נוספות כמו גן ספציפי ותפקוד מיקרו-RNA ב-EndMT.