Name: אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: חקור שיטה אמינה להשראת מעבר אנדותל-מזנכימלי (EndMT) בתאי אנדותל MS-1 באמצעות TGF-β2. הפרוטוקול מאפשר ניתוח מולקולרי מעמיק של שינויים מורפולוגיים ומולקולריים, כולל מיקרו-RNA, לחקר מנגנוני פלסטיות אנדותלית במחלות כלי דם וסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Zea אחרי הכרזת העצמאות בהודו, Kohei Miyazono על הצעות הכנה של היד. H.I.S., מ. ה נתמכים על ידי אנדרטת Uehara קרן מחקר לאגודה, H.I.S. נתמכת את המלגה של ממוריאל Hayaishi וסאמא עבור מחקר בחו ל. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של קרן המדע טקדה (A.S.).

1. אינדוקציה של EndMT
<ol><li>לשמור על MS-1 תאים בתנאים סטנדרטיים תרבות ולהימנע confluency. מקור התאים MS-1 מתוארת בטבלה של חומרים. עבור MS-1 תאים, השתמש מינימום הכרחי בינוני-α (MEM-α) עם 10% עגל עוברית סרום (FCS), פניצילין U/mL 50 50 סטרפטומיצין μg/mL.</li>
	<li>לשטוף את MS-1 תאים ב- 10 ס מ צלחת עם 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ולהוסיף 1.0 מ"ל של טריפסין לצלחת. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>ניתוק התאים באמצעות 9 מ של תרבות התקשורת. לאסוף את ההשעיה תא בשפופרת 15 מ"ל.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא ב x 300 – 400 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בזהירות להסיר את תגובת שיקוע והשהה בגדר תא בתקשורת תרבות ומחוממת מראש.</li>
	<li>ספירת התאים קיימא באמצעות פתרון Trypan Blue ו hemocytometer רגיל או מונה הניתן תא אוטומטית.</li>
	<li>צלחת MS-1 תאים אל תרבות רגיל ללא ציפוי לוחות-0.5 x 103 תאים לכל ס מ2 לתרבות לטווח ארוך. לדוגמה, צלחת 5.0 x 103 תאים לכל טוב ב 6 תרבות טוב בצלחת. השתמש באותה מדיה תרבות כולל ריכוז זהה של FCS. MS-1 תאים, TGF-β גורם EndMT בתרבות לטווח ארוך (לפחות 48-72 שעות) עם השימוש של FCS.</li>
	<li>לעורר תאי אנדותל עם TGF-β2 (ריכוז סופי של 1 ng/mL) לאחר 24 שעות.</li>
	<li>התרבות התאים חממה humidified (5% CO2, 37 ° C). לפקח על תאים מדי יום בעת התמקדות שינויים מורפולוגיים.</li>
	<li>החלף את המדיה טריים מראש ומחוממת תרבות המדיה המכילה TGF-β2 לאחר 48 שעות של טיפול עם TGF-β בתרבות לטווח ארוך.</li>
	<li>המשך הבדיקות במורד הזרם. בדרך כלל, רה-ארגון אקטין נצפית לאחר 24 שעות של טיפול, downregulation של סמני אנדותל, קולטנים upregulation של סמנים mesenchymal שנצפו לאחר 48-72 שעות של טיפול עם TGF-β.</li>
</ol>2. Immunocytochemical ניתוח
<ol><li>לשמור על MS-1 תאים בתנאים סטנדרטיים תרבות.</li>
	<li>צלחת MS-1 תאים על גבי 4 תא טוב תרבות קאמרית שקופיות ב- 1.0 x 103 תאים לכל טוב (1.7 ס מ2). שקופיות הם מצופים מראש עם ג'לטין. שימוש 0.5-1.0 מ"ל של תרבות התקשורת לכל טוב.</li>
	<li>לעורר תאי אנדותל עם TGF-β2 (ריכוז סופי של 1 ng/mL) לאחר 24 שעות. בעת ניתוח המעורבות של רוק EndMT, להוסיף מעכב Y-27632 רוק (10 μM) 1 h לכהן לטיפול TGF-β. בעת הערכת ההשפעה של עיכוב איתות TGF-β, TGF-β קולטן קינאז מעכבי יכול לשמש.</li>
	<li>התרבות התאים חממה humidified (5% CO2, 37 ° C). אקטין רה-ארגון נצפית בתאי MS-1 לאחר 24 שעות של טיפול עם TGF-β. שינויים אחרים נהיים ברורים לאחר 48-72 שעות של טיפול. לתרבות 72 h, החלף את המדיה טריים המדיה המכילה TGF-β לאחר 48 שעות של טיפול עם TGF-β.</li>
	<li>
צביעת F-אקטין
	<ol>
<li>לאחר 24 שעות של טיפול TGF-β, להסיר מדיה, לתקן תאים עם 4% paraformaldehyde ב- PBS 1 x עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף תאים עם 1 x PBS.</li>
		<li>דגירה עם 0.2% טריטון X-100 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף תאים שלוש פעמים עם 1 x PBS.</li>
		<li>דגירה עם phalloidin-tetramethylrhodamine isothiocyanate B מן-אמנית מדולל 150-fold עם מאגר החסימה לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף תאים שלוש פעמים עם 1 x PBS.</li>
		<li>כתם הגרעינים עם איגוד חומצת גרעין cyanine צבעני 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הר coverslips ושקופיות יש לשטוף פנים למטה בשקופית באמצעות שקופיות הרכבה מדיה.</li>
		<li>שימו לב עם מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש לייזר nm 543 מסנן פליטה של 560 – 615 nm גילוי של זריחה של phalloidin. השימוש בלייזר nm 633 מסנן פליטה יותר מ 650 nm עבור צביעת גרעינית. בעת טיפול עם TGF-β, היווצרות של סיבי סטרס עבה תיענה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
VE-קדהרין וα-SMA מכתים
	<ol>
<li>לאחר 72 h הטיפול TGF-β, להסיר מדיה, לתקן תאים עם מתנול 50% קר, אצטון 50% (0.5-1.0 מ"ל לכל טוב) במשך 5 דקות.</li>
		<li>לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS 1 x (0.5-1.0 מ"ל לכל טוב).</li>
		<li>דגירה עם נוגדנים העיקרית במאגר חסימה למשך הלילה ב 4 ° C בחושך על פי הריכוז המומלץ של היצרן. השתמש VE-קדהרין נוגדנים חד-שבטיים (BV13, דילול מטריים) וα-SMA Cy3 מצומדת נוגדנים חד-שבטיים (1A4, דילול 1:200)20.</li>
		<li>לשטוף תאים שלוש פעמים עם 1 x PBS.</li>
		<li>דגירה תאים עם ירוק מצומדת צבע משני נוגדן ל VE-קדהרין נוגדן במאגר החסימה לשעה בטמפרטורת החדר בחושך על פי הריכוז המומלץ של היצרן.</li>
		<li>לשטוף תאים שלוש פעמים עם 1 x PBS.</li>
		<li>כתם הגרעינים עם איגוד חומצת גרעין cyanine צבעני 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הר coverslips ושקופיות יש לשטוף פנים למטה בשקופית באמצעות שקופיות הרכבה מדיה.</li>
		<li>שימו לב עם מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש לייזר nm 543 מסנן פליטה של 560 – 615 nm גילוי של α-SMA (Cy3). השתמש 488 ננומטר לייזר של מסנן פליטה של 505 – 550 ננומטר גילוי של VE-קדהרין. בדרך כלל, בעת טיפול עם טיפול TGF-β, הדירי VE-קדהרין אותות, עלייה α-SMA אותות תיענה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. תלת מימדי קולגן ג'ל התכווצות Assay
<ol><li>בצע לתרבות של MS-1 תאים עם או בלי TGF-β עבור 72 h לפני קולגן ג'ל התכווצות assay.</li>
	<li>להכין את הסוג אני קולגן ג'ל על קרח. לערבב פתרון קולגן קר, x 10 מרוכזים MEM בינוני ו קולגן דילול מאגר המכיל 0.05 N NaOH, 2.2% NaHCO3ו- 200 מ מ HEPES pH 7.4-8:1:1 יחס.</li>
	<li>לערבב 200 mL של פקד או השעיות TGF-β-טיפול תאי אנדותל (1.0 x 106 תאים/200 μL) ו- 800 μl של הפתרון ג'ל קולגן. TGF-β דגימות שטופלו, הוסיפו TGF-β2 (1 ng/mL) כדי התליה תא.</li>
	<li>להוסיף 1.0 מ"ל של התערובת כל טוב של תרבות. ובכן 12 צלחות ולאפשר שבמהלכו בחממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.</li>
	<li>לאחר gelatinization, כיסוי 1.0 מ"ל של מאמ-α המכיל 10% FCS, 50 פניצילין U/mL ו- 50 μg/mL סטרפטומיצין להפריח את הג'ל. TGF-β דגימות שטופלו, הוסיפו TGF-β2 (1 ng/mL) בכלי התקשורת. הערה: עבור TGF-β דגימות שטופלו, להוסיף TGF-β ג'ל והן תרבות המדיה.</li>
	<li>דגירה של ג'לים צפה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.</li>
	<li>סריקת התמונות של ג'לים מהחלק התחתון של צלחות באמצעות סורק. לחלופין, להקליט התמונות של ג'לים באמצעות מצלמה דיגיטלית ממרחק קבוע מעל ג'לים.</li>
	<li>לכמת את ג'ל פני השטח בהתבסס על מספר הפיקסלים באמצעות ImageJ. בחר את הג'ל באמצעות מבחר ביד חופשית או כלי בחירה הקשורה, או בחר את ג'ל באמצעות "תמונה | התאם | צבע הסף"כלי ולאחר מכן לקבוע את האזור של ג'ל באמצעות" נתח | הפקודה מידה".</li>
</ol>4. עיכוב של miRNA פעילויות על-ידי miRNA מבוססי חומצת גרעין נעול מעכבי
<ol><li>לשמור על MS-1 תאים בתנאים סטנדרטיים תרבות.</li>
	<li>Transfect נעול חומצת גרעין (מגבר קדם) מעכבי miRNA, דופלקסים miRNA סינתטי או siRNAs (20 או 50 ננומטר) בעזרת ריאגנטים lipofection על פי הוראות היצרן. פרטים ומקורות של מעכבי miRNA מגבר קדם, miRNA סינתטי דופלקסים ו siRNAs תוארו שלנו26,הקודם דוחות27. MS-1 תאים, נהלים תקנים רגיל המבוסס על הוראות היצרן עובד היטב עבור הקדמה של מגבר קדם מעכבי miRNA, דופלקסים miRNA סינתטי או siRNAs.</li>
	<li>לאחר 16 – 48 h, לעורר תאי אנדותל עם TGF-β2 (ריכוז סופי של 1 ng/mL).</li>
	<li>המשך ניתוח במורד הזרם שונים לרבות RNA ניתוח ביטוי (RT-PCR כמותי וניתוחים RNA-רצף (RNA-seq)), ניתוח immunocytochemical assay כתב. ניתוחים במורד הזרם תוארו שלנו הקודם דוחות20,26,27.</li>
</ol>

<ol><li>Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases%3A+Developmental+signaling+pathways+gone+awry%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry.</a> Developmental Dynamics. , (2017).</li>
<li>Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0012160675903218">Structural analysis of endocardial cytodifferentiation.</a> Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).</li>
<li>Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+atrioventricular+valvuloseptal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis.</a> Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+are+progenitors+of+cardiac+pericytes+and+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells.</a> Nature Communications. 7, 12422(2016).</li>
<li>DeRuiter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+endothelial+cells+transdifferentiate+into+mesenchymal+cells+expressing+smooth+muscle+actins+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro.</a> Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).</li>
<li>Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+occurs+during+embryonic+pulmonary+artery+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endothelium%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development.</a> Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).</li>
<li>Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+partial+endothelial-mesenchymal+transitions+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).</li>
<li>Zeisberg, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+contributes+to+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis.</a> Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+drives+atherosclerosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).</li>
<li>Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+in+atherosclerotic+lesion+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification.</a> Atherosclerosis. , 124-127 (2016).</li>
<li>Qiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+fate+mapping+in+mice+with+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).</li>
<li>Ranchoux, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25593290">Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension.</a> Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).</li>
<li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li>
<li>Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+fibroblasts+and+mechanism+of+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis.</a> Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).</li>
<li>Cooley, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+mediates+endothelial-to-mesenchymal+transition+%28EndMT%29+during+vein+graft+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling.</a> Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234(2014).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+Growth+Factor-beta1+Induces+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition+via+Akt+Signaling+Pathway+in+Renal+Transplant+Recipients+with+Chronic+Allograft+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction.</a> Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).</li>
<li>Xu-Dubois, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%3A+Evidence+for+Antibody-Endothelium+Interaction+during+Antibody-Mediated+Rejection+in+Kidney+Recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+endothelial+to+mesenchymal+transition+as+a+source+for+carcinoma-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts.</a> Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).</li>
<li>Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-Induced+Endothelial-Mesenchymal+Transition+in+Fibrotic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li>
<li>Mihira, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+mesenchymal+transition+of+MS-1+endothelial+cells+requires+Smad-dependent+cooperative+activation+of+Rho+signals+and+MRTF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A.</a> Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).</li>
<li>Hashimoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).</li>
<li>Suzuki, H. I., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+microRNA+biogenesis%3A+crosstalk+between+p53+network+and+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway.</a> Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).</li>
<li>Suzuki, H. I., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+complexity+of+microRNA+generation+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Emerging complexity of microRNA generation cascades.</a> Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).</li>
<li>Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19262572">MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).</li>
<li>Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-23+restricts+cardiac+valve+formation+by+inhibiting+Has2+and+extracellular+hyaluronic+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production.</a> Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).</li>
<li>Katsura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-31+is+a+positive+modulator+of+endothelial-mesenchymal+transition+and+associated+secretory+phenotype+induced+by+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta.</a> Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).</li>
<li>Suzuki, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TGF-beta-mediated+endothelial-mesenchymal+transition+by+microRNA-27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27.</a> Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).</li>
<li>Camenisch, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+distinct+TGFbeta+ligand+requirements+during+mouse+and+avian+endocardial+cushion+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis.</a> Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).</li>
<li>Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cells+for+use+in+vascular+tissue+engineering+obtained+by+endothelial-to-mesenchymal+transdifferentiation+%28EnMT%29+on+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices.</a> Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).</li>
<li>Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta2+promotes+Snail-mediated+endothelial-mesenchymal+transition+through+convergence+of+Smad-dependent+and+Smad-independent+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling.</a> Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).</li>
<li>Krizbai, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+of+brain+endothelial+cells%3A+possible+role+during+metastatic+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation.</a> PLoS One. 10 (3), e0119655(2015).</li>
<li>Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+1+promotes+the+differentiation+of+endothelial+cells+into+smooth+muscle-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro.</a> Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).</li>
<li>Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+induces+transdifferentiation+of+iBREC+to+alphaSMA-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).</li>
<li>Paranya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li>
<li>Maleszewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+and+TGFbeta2+synergistically+induce+endothelial+to+mesenchymal+transition+in+an+NFkappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner.</a> Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-endothelial+transition+contributes+to+cardiac+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization.</a> Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+balance+of+aberrant+Rasal1+promoter+methylation+and+hydroxymethylation+regulates+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis.</a> Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Endothelial+Cells+with+Distinct+Patterns+of+TGFbeta-Driven+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בעבר דווח כי הטיפול Ras ו- TGF-β מופעל במשך 24 שעות ביממה המושרה EndMT בתאים MS-1, בעוד TGF-β לבד לא הצליחה לגרום EndMT זו תקופה קצרה21. באופן עקבי, הבחנו כי TGF-β באופן משמעותי המושרה EndMT לאחר טיפול ארוך יותר (48-72 שעות) ב- MS-1 תאים20... EndMT נצפתה שוב ושוב לאחר טיפול ממושך עם TGF-β (2-6 ימים) בתאי האנדותל שונים כגון הטבור האנושי הווריד תאי אנדותל (HUVEC), עורית microvascular אנדותל תאים אנושיים (HCMEC), תאי אנדותל כלילית אדם ( HCEC), העכבר ריאות אנדותל תאים (MLEC), ע...

המעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT) היא התהליך שבאמצעותו תא אנדותל הבדיל עובר מגוון שינויים מולקולריים, וכתוצאה מכך פיברובלסט דמוי תא mesenchymal1. EndMT תוארה בתחילה טרנספורמציה תא אנדותל במהלך הפיתוח של הלב2,3. בהתפתחות הלב המוקדמת, הצינור הלב מורכב endocardium הפנימי של שריר הלב החיצוני. שתי שכבות אלה מופרדים באמצעות שכבה של מטריצה חוץ-תאית, קרא את הג'לי הלב. התאים endocardial עובריים, אשר רוכשים תאי אנדותל סמנים, מעבר לתאי mesenchymal, לפלוש הריבה הלב הבסיסית, ולקדם היווצרות הכרים הלב, מתן הקרן עבור שסתומים atrioventricular ומחצה השסתומים semilunar. יתר על כן, EndMT הוצע להיות מקורות pericytes תאי השריר החלק בכלי הדם במערכות אחרות כלי דם עובריים כולל הדם הכליליים, העורק הראשי של עורק הריאה-4,-5,-6. בנוסף, הייתה שם EndMT ב האנגיוגנזה פיזיולוגיים הלבלוב7.
לצבירת ראיות הציע כי EndMT מעורבת גם מספר מחלות לב וכלי דם, מחלות אחרות,1,8. תנאים הקשורים EndMT לכלול הסתיידות כלי הדם, טרשת עורקים, יתר לחץ דם עורקי ריאתי, מום חלול, איברים פיברוזיס, שיפוץ שתל הווריד, תפקוד להשתלת השתלת כליה וסרטן8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. לאחרונה דו ח תיאר כי מספר סמנים מולקולריים EndMT יכול להיות כלי חיזוי האבחנה והפרוגנוזה של חוסר תפקוד כליות שתל כליה השתלת17. אפנון של הקשורות EndMT הסלולר איתות המסלולים הוכחו דהוא מספר תנאים המחלה כולל הלב פיברוזיס, וריד שתל שיפוץ של בעל חיים מודלים8,15. לכן, הבנת המנגנונים EndMT הבסיסי הוא חשוב לפתח אסטרטגיות איבחוניות מיקוד EndMT.
EndMT מאופיין על ידי אובדן של צמתי תא-תא, הגדלת הפוטנציאל נודדות, downregulation של גנים ספציפיים אנדותל כגון VE-קדהרין ולאחר קולטנים upregulation של גנים mesenchymal כולל שריר α-חלק אקטין (α-SMA). בנוסף, EndMT ו- mesenchymal-אפיתל המעבר (אמבולנס), תהליך דומה הממירה לתאי האפיתל לתאי mesenchymal, הם קשורים שינו בייצור רכיבים שונים מטריצה חוץ-תאית, אשר עשוי לתרום להתפתחות של רקמת פיברוזיס8,19.
לאחרונה, מספר במבחנה מחקרים של EndMT יש מבואר הפרטים של המנגנונים המולקולריים של EndMT15,20. EndMT הנגרמת על ידי איתות המסלולים השונים כולל הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β, ונ ט, וחלק1. ביניהם, TGF-β ממלא תפקיד מרכזי אינדוקציה של החובשים והן EndMT. ב- EndMT, ממושך חשיפה תוצאות TGF-β EndMT בתאי האנדותל שונים, בזמן חשיפה קצרה שנראה אין די21. אנחנו כאן תיאר פרוטוקול פשוטה עבור אינדוקציה EndMT, איזה מייל סוון 1 (MS-1) תאי אנדותל microvascular בלבלב עכבר עוברים EndMT במבחנה לאחר חשיפה ממושכת ל TGF-β20. במודל זה, ניתן לבצע ניתוחים במורד הזרם מרובים כדי לחקור תכונות סימן ההיכר של EndMT, כולל שינויים מורפולוגיים, downregulation של סמני אנדותל, קולטנים upregulation של סמנים mesenchymal, גנים דלקתיים, cytoskeletal rearrangements, התכווצות ג'ל קולגן.
Rna (miRNAs) הם ~ 22 nt קטן RNAs רגולציה ישירה הדיכוי posttranscriptional של mRNA שונים מטרות22,23. דרך זיהוי המטרה בתיווך רצף זרע, miRNAs לדכא את מאות גנים היעד, לווסת פונקציות הסלולר מגוונים כגון תאית התמיינות, התפשטות, תנועתיות. זהו גם המקרה של רגולציה של החובשים, EndMT, דווח על מספר miRNAs כמבקרי סמביוזה24,החובשים, EndMT25. המודל EndMT שהוצגו בסקירה זו ניתן לשלב בקלות miRNA נהלים אפנון לבחון את התפקידים של miRNAs ב- EndMT. הסקירה הנוכחית מסכמת שלנו בצרות לחקור TGF-β-induced EndMT בתאים MS-1, כולל גם השוואה של תנאים האינדוקציה EndMT על ידי TGF-β בתאי האנדותל אחרים.

<table><tbody><tr><td>תאי MS-1</td><td>אוסף תרבית מסוג אמריקאי</td><td>CRL-2279</td><td></td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32571036</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta2</td><td>R& D</td><td>302-B2-002</td><td></td></tr><tr><td>4 באר Lab-Tek II שקופית קאמרית</td><td>תרמו פישר 154526</td><td></td><td></td>מדעי</tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>חסימת אחד</td><td>נקלאי טסק</td><td>03953-95</td><td></td></tr><tr><td>פלואידין-טטרמתילרודמין B איזותיוציאנט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3 יודיד</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>VE נוגדן חד שבטי קדרין (BV13)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-1441-82</td><td></td></tr><tr><td>אלפא-SMA נוגדן חד שבטי Cy3 (1A4)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז אנטי עכבר IgG (H + L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי החלקה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת קולגן</td><td>Nitta gelatin Inc.</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>מאגר דילול קולגן</td><td>Nitta gelatin Inc.</td>מעכב <td>CELLMATRIX I-P</td><td></td></tr><tr><td>LNA miRNA</td><td>EXIQON&nbsp;</td><td>miRCURY LNAmicroRNA מעכב כוח (בקרה שלילית B ו-miRNA מטרה)</td><td></td></tr><tr><td>miRNA דופלקס סינתטי</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>miScript miRNA Mimic</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778030</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr></tbody></table>

אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

גמישות פנוטיפית תאי אנדותל ביסוד פיתוח מערכת הלב וכלי דם, מחלות לב וכלי דם והתנאים שונים הקשורים עם פיברוזיס איברים. בתנאים אלה, תאי אנדותל הבדיל רוכשים פנוטיפים כמו mesenchymal. תהליך זה נקרא מעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT), והוא מאופיין על-ידי downregulation של סמני אנדותל, קולטנים upregulation של סמנים mesenchymal, שינויים מורפולוגיים. EndMT הנגרמת על ידי מספר איתות המסלולים, לרבות הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β, ונ ט, חריץ, ומוסדרת על ידי המנגנונים המולקולריים דומים לאלה של אפיתל mesenchymal המעבר (החובשים) חשוב עבור gastrulation, פיברוזיס רקמות, ו גרורות סרטן. הבנת המנגנונים של EndMT חשוב לפתח גישות איבחוניות מיקוד EndMT. אינדוקציה חזקים של EndMT במבחנה זו שימושית לאפיין את חתימות ביטוי גנים משותפים, לזהות את המנגנונים המולקולריים druggable להבדק מאפננים של EndMT. כאן, אנו מתארים שיטה במבחנה עבור אינדוקציה של EndMT. תאי אנדותל microvascular בלבלב עכבר MS-1 עוברים EndMT לאחר חשיפה ממושכת TGF-β ולהראות קולטנים upregulation של סמנים mesenchymal, שינויים מורפולוגיים, כמו גם אינדוקציה של מספר נוגדנים דלקתיים וכן ציטוקינים. שיטות לניתוח של אפנון microRNA (miRNA) הינם כלולים גם. שיטות אלה מספקים פלטפורמה לחקור את המנגנונים שבבסיס EndMT ועל תרומתה של miRNAs כדי EndMT.

TGF-β הוא משרן חזק של EndMT בתאי האנדותל שונים. לאחר 24 שעות טיפול עם TGF-β בתאים MS-1, צביעת עבור F-אקטין מראה רה-ארגון של אקטין מתח סיבים (איור 1 א')20. רעלני עם מעכב רוק Y-27632 מעכב את תנאי הגיוס של אקטין רה-ארגון20. תאי אנדותל MS-1 שנה של מורפולוגיה ריצוף דמוי הקלאסית מורפולוגיה בצורת פלך mesenchymal על טיפול TGF-β (איור 1B). תאי TGF-β-מטופלים שננתק את הקשר תא-תא. לאחר טיפול עם...

עבור במבחנה אינדוקציה של המעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT), אשר הוא שימושי עבור חוקרים הסלולר איתות המסלולים מעורב EndMT, פרוטוקול המתואר. במודל זה ניסיוני, EndMT הנגרמת על ידי טיפול עם TGF-β בתאי האנדותל MS-1.

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה של כלי הדם והסרטן, כגון מנגנונים של פלסטיות אנדותל במצבים פתולוגיים שונים, כולל סרטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאינדוקציה חזקה של EndMT במבחנה מושגת על ידי טיפול בתאי אנדותל TGF-in MS-1. ראשית גדלו את תאי MS-1 בתנאי תרבית סטנדרטיים והימנעו מהתרבית להיות מתלכדת.לאחר מכן, על צלחת של 10 ס"מ, שטפו את תאי MS-1 עם מי מלח 1x חוצץ פוספט. לאחר מכן מוסיפים 1 מ"ל טריפסין לצלחת ודוגרים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף 9 מ"ל של מצע תרבית לתאים הטריפסינים לניתוק.לאחר מכן אסוף את תרחיף התאים הטריפסיני בצינור של 15 מ"ל. צנטריפוגה את מתלה התא בטמפרטורה של 300 עד 400 x G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש במונה תאים אוטומטי כדי לספור את מספר התאים הקיימאים.לאחר מכן צלחו את תאי MS-1 על צלחות תרבית סטנדרטיות לא מצופות לתרבית ארוכת טווח. לאחר 24 שעות, יש לעורר את תאי האנדותל בריכוז סופי של 1 ננוגרם למיליליטר של TGF-2. לאחר מכן דגרו את צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.לאחר 48 שעות של טיפול, החלף את המדיום במדיום תרבית טרי ומחומם מראש המכיל TGF-2 לניתוח במורד הזרם, צלח את תאי MS-1 על שקופית תא תרבית בת 8 בארות מצופה מראש בג'לטין. לאחר 24 שעות, הוסף 10 M של מעכב ROCK לתרבית התאים. לאחר שעה, יש לעורר את תאי האנדותל בריכוז סופי של 1 ננוגרם למיליליטר של TGF-2.לאחר מכן דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לתרבית ארוכה של 72 שעות, החלף את המדיום הישן במדיום טרי המכיל TGF-2 לאחר 48 שעות. לאחר יום שלם של טיפול ב-TGF, יש להסיר את המדיום.לאחר מכן תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד ותמיסת מלח עם פוספט למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סיום תקופת הקיבוע, יש לשטוף את התאים במי מלח עם פוספט. לאחר מכן דגרו על התאים עם 0.2% טריטון X-100 למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר חמש דקות, שטפו שוב את התאים בתמיסת מלח עם פוספט 1x שלוש פעמים. לאחר שלוש כביסות, דגרו את התאים עם פלואונסצין פלואורסצנטי מדולל המכיל חיץ חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את התאים במי מלח 1x חוצץ פוספט, שלוש פעמים.לאחר מכן צבעו את גרעיני התא באמצעות צבע קושר חומצת גרעין ציאנין למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, שטפו את המגלשה והרכיבו החלקת כיסוי על המגלשה באמצעות אמצעי הרכבה לשקופיות. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.התאים מראים ארגון מחדש של סיבי הלחץ העבים בטיפול ב-TGF-2. זה מצביע על העוצמה של TGF-2 בהשראת EndMT בתאי אנדותל. לאחר 72 שעות של טיפול ב-TGF-2, השליכו את המדיום וקבעו את התאים עם 0.5 עד 1 מ"ל של 50% מתנול קר ו-50% אצטון למשך חמש דקות.לאחר מכן שטפו את התאים במי מלח עם חוצץ פוספט 1x, שלוש פעמים. לאחר השלמת שלוש השטיפות, דגרו על התאים עם נוגדנים ראשוניים בחסימת המאגר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, בחושך. למחרת, שטפו שוב את התאים במי מלח עם חוצץ פוספט 1x, שלוש פעמים.לאחר מכן דגרו את התאים עם נוגדן משני מצומד בצבע ירוק ל-VE-cadherin במאגר חוסם, למשך שעה אחת בחושך. שוב שטפו את התאים במי מלח 1x חוצץ פוספט, שלוש פעמים. לאחר מכן צבעו את גרעיני התא באמצעות צבע קושר חומצת גרעין ציאנין למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר חמש דקות, שטפו את המגלשה והרכיבו החלקת כיסוי על המגלשה באמצעות מדיום הרכבה לשקופיות. לאחר מכן התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. התאים מראים ירידה בביטוי של VE-cadherin, וביטוי מוגבר של אקטין שריר חלק לאחר טיפול ב-TGF-2 במשך 48 עד 72 שעות.לפני בדיקת התכווצות ג'ל הקולגן, תרבית את תאי MS-1 בנוכחות ובהיעדר TGF-2 למשך 72 שעות. לאחר מכן הכינו את ג'ל הקולגן מסוג 1 על קרח. לאחר מכן מערבבים 800 ליטר מתמיסת ג'ל הקולגן עם 200 מ"ל של הבקרה, או תאי אנדותל שטופלו ב-TGF-2.לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל מתערובת זו לכל באר של צלחת תרבות בת 12 בארות. תנו לג'ל להתמצק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות. לאחר התמצקות הג'ל, הוסף 1 מ"ל של MEM Alpha, המכיל 10% סרום עגל עוברי, 50 יחידות למיליליטר פניצילין ו -50 גרם למיליליטר סטרפטומיצין, כדי לצוף את הג'ל.לאחר מכן נתק את הג'ל מדופן הבאר, ודגר את הג'ל הצף בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות דגירה, סרוק את תמונות הג'ל מתחתית הצלחת באמצעות סורק. ניתן לראות שינויים מורפולוגיים מובהקים, ההופכים את התאים מהאבן המרוצפת לארכיטקטורה בצורת ציר מזנכימלי עקב חשיפה לטיפול ב-TGF-2 במשך 72 שעות.מעניין לציין שטיפול TGF בטא 2 במשך 48 עד 72 שעות מראה עלייה הן ברמות ה-mRNA והן ברמות ביטוי החלבון של אקטין שריר חלק בתאי MS-1. בדיקת התכווצות הג'ל מראה גם כי בטיפול ב-TGF-2, ג'ל הקולגן מסוג 1 מתכווץ באופן משמעותי. מעניין לציין כי מחסור ב-TGF-2 מוריד את אקטין השריר החלק לרמה הבסיסית והתאים חוזרים למורפולוגיה המרוצפת, מה שמצביע על כך ש-EndMT הוא תהליך דינמי.למעשה, עיכוב microRNA 31 על ידי מעכב מיקרו-RNA LNA באמצעות תאי MS-1, מחליש את השראת הסמנים המזנכימליים. עם זאת, המעכב אינו משפיע על השראת גנים ממוקדי TGF כגון פיברונקטין 1, PAI-1 ו-Smad 7. ניתן לבצע מעקב אחר הליך זה כשיטה כמו ביטוי גנים, נוקדאון או אפנון מיקרו-מערך, על מנת לענות על שאלות נוספות כמו גן ספציפי ותפקוד מיקרו-RNA ב-EndMT.

molecular-analysis-endothelial-mesenchymal-transition-induced

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה פשוטה מתוארת לאינדוקציה של אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) במגוון רחב של סוגי תאים. שיטות לניתוח של תאים במדינות EMT ידי immunocytochemistry כלולים.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

הוכח כי ויסות שחבור חלופי תורם למעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), תוכנית תאית חיונית בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן אנו מתארים שיטה המשתמשת במודל EMT הניתן להשראה לזיהוי שחבור חלופי במהלך EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

כאן, אנו מתארים את הפיתוח והיישום של בדיקת התכווצות ג'ל להערכת תפקוד התכווצות בתאים מזנכימליים שעברו מעבר אפיתל-מזנכימלי.

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

כתב יד זה מתאר בדיקת היווצרות צינור כדי לכמת את ההשפעות של תרכובת או מצב נתון על אנגיוגנזה על ידי שימוש בהיווצרות צינור תא אנדותל בסביבה מבוקרת.

Assay גיבוש האנדותל תא Tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- Growth Factor מופחתת מטריקס

אנו מציגים כאן שיטה תרבית תאים עבור גרימת מעברים-אפיתל mesenchymal (MET) בתאים סרקומה מבוסס על ביטוי אקטופי בשילוב של בני המשפחה microRNA-200 ו grainyhead דמוי 2 (GRHL2). שיטה זו מתאימה יותר להבנת ההשפעה הביולוגית של גמישות פנוטיפית על תוקפנות הסרטן וטיפולים.

אינדוקציה של מעברי אפיתל- mesenchymal בתאי סרקומה

אנו מציגים את התפוקה הגבוהה כוח המתיחה שיטת המציא עם גומי סיליקון (PDMS). העיבוד החדשני הזה מתאים ללימוד שינויים פיזיים בתהליך ביולוגי ומחלות בתהליכים ביולוגיים וביורפואיים שונים. אנו מדגימים את כלי השירות של שיטה זו על-ידי מדידת העליה התלויה של TGF-β במהלך המעבר האפיתל-למסמצ'אל.

תפוקה גבוהה המתיחה כוח מיקרוסקופ באמצעות PDMS מגלה השפעות תלויי מינון של שינוי מקדם הצמיחה-β על המעבר אפיתל-to-מעבר משנה

miRNA הרפוי יש פוטנציאל משמעותי בוויסות התקדמות סרטן. המודגמות כאן גישות אנליטיות משמשים לצורך זיהוי הפעילות של טיפול miRNA קומבינטורית להפסקת מחזור התא, אנגיוגנזה.

ניתוח של miRNA קומבינטורית טיפולים כדי להסדיר מחזור התא, אנגיוגנזה

אנו מתארים זרימת עבודה שיטתית כדי לחקור איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי β TGF על ידי לימוד ביטוי החלבון והגנים המעורבים במסלול איתות זה. השיטות כוללות סופג מערבי, בדיקת כתב לוציפראז, qPCR, וכתמי כשל חיסוני.

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

אנו מתארים שיטות לחקור TGF-β2-induced EndMT בתאי אנדותל על ידי התבוננות בשינויים במורפולוגיה של התא ובחינת הביטוי שינויי סמן הקשורים EndMT באמצעות כתמי כשל חיסוני. עריכת גנים CRISPR/Cas9 תוארה ושימשה לרוקן את חילזון קידוד הגנים כדי לחקור את תפקידה ב- EndMT הנגרמת על ידי TGF-β2.

אנדותל בתיווך TGF-β למעבר מסנצ'ימלי (EndMT) וההערכה הפונקציונלית של אפקטי EndMT באמצעות עריכת גנים CRISPR/Cas9

כאן, אנו מקימים פרוטוקול כדי לדמיין ולנתח בו זמנית מתחמי SMAD מרובים באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA) בתאי אנדותל החשופים לתנאי לחץ גזיר נוזלים פתולוגיים ופיזיולוגיים.

הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

הפרוטוקול הנוכחי מאפשר התאוששות של מבנים דמויי צינור שנוצרו במבחן היווצרות צינור אנגיוגנזה קלאסי במבחנה שבו תאים, כגון תאי טרופובלסט, מתארגנים במבנים דמויי נימים על גבי שכבה של מטריצת קרום בסיס חוץ-תאית. המבנים המשוחזרים משמשים לבידוד RNA וחלבונים לניתוחים ביוכימיים שונים.

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

חקור שיטה אמינה להשראת מעבר אנדותל-מזנכימלי (EndMT) בתאי אנדותל MS-1 באמצעות TGF-β2. הפרוטוקול מאפשר ניתוח מולקולרי מעמיק של שינויים מורפולוגיים ומולקולריים, כולל מיקרו-RNA, לחקר מנגנוני פלסטיות אנדותלית במחלות כלי דם וסרטן.

אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות

גלה סרטונים נוספים