Name: Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: למדו שיטת אימונופלואורסצנציה וניקוי רקמות לכימות זקיקים בשחלות תרבותיות של עכברים צעירים. שיטה זו שומרת על מבנה תלת-ממדי ומאפשרת ניתוח אוטומטי יעיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים רבקה ויליאמס ו ג'ואנה דלה קרוס של הדמיה קורנל BRC ו אנדרו Recknagel על ההערות המועילות וסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על המכונים הלאומיים לבריאות גרנט S10-OD018516 (כדי מתקן הדמיה של קורנל), T32HD057854 כדי J.C.B., R01-GM45415 כדי J.C.S.

אוניברסיטת קורנל של טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) אישר את כל השיטות המתוארות כאן, תחת פרוטוקול 2004-0038 למטות.
1. הכנת כלי נגינה ומדיה תרבות
<ol><li>לנגב אזור עבודה נקי עם 10% מלבין ולאפשר האקונומיקה להישאר על משטח אזור העבודה לפחות 5 דקות. לאחר 5 דקות, להסיר את עודף אקונומיקה עם מגבות נייר נקי ו-70% אתנול (EtOH). לנקות את המיקרוסקופ ויבתר ביסודיות עם 70% EtOH. הערה: חשוב כי אזור העבודה להיות לפחות חצי סטרילי כדי למנוע זיהום של תרבויות איברים.</li>
	<li>לעטוף נקי מלקחיים ומספריים במגבת נייר לחה עם 70% EtOH עד למועד השימוש. הערה: כלי ניתוח אידיאלי עשוי להשתנות לפי מידת/הגיל של השחלה. התוצאות הטובות ביותר מתקבלים באמצעות אחת חדה מיקרו ויבתר מספריים, עצה בסדר שני מלקחיים (או מספר 5 או 55) ומיקרו אחד לנתח מספריים איריס.</li>
	<li>צינור חרוטי, ודא 50 מ של השחלה תרבות המדיה וחמים באמבט מים 37 º C.<ol>
<li>כדי להפוך את השחלה תרבות בינוני4, תוספת 1 x תקשורתי חיוני מזערי (מאמ) עם 10% סרום שור עוברית (FBS), 25 מ מ (-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 חומצה (HEPES), 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100, 0.25 µg/mL המפוטריצין (למשל, 45 מ ל גברתי, 5 מ של חום להשבית FBS, 1.25 מ של HEPES ו- 0.5 מ ל 100 x מלאי של פניצילין, סטרפטומיצין, ו- B שהוא גוסס).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין צלחות מוסיף לפני התרבות השחלה.<ol>
<li>בשכונה תרביות רקמה, להוסיף 1 מ"ל של השחלה תרבות בינוני צלחת תרביות רקמה 35 מ מ.</li>
		<li>להשרות טרום הכנס רפידה עם המדיום תרבות. הוסף מדיה מספיקה, בדרך כלל בערך 0.55 מ"ל לכל, צלחת תרביות רקמה מנשא טוב 24 והמקום תרבות תא להוסיף בתוך הבאר. ודא ממברנה שתותב נוגע לתקשורת.</li>
		<li>הכן את מספר צלחות 35 מ מ ווולס עם תא מוסיף תרבות לפי המספר הצפוי של השחלות לניסוי. מקם את הצלחות 35 מ מ המכיל 1 מ"ל הלוח המוביל 24-ובכן המכיל מוסיף 37 ° C, 5% CO2ו החממה באטמוספירה של2 O ומדיה תרבות ומדיה תרבות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לארגן צלחת חמה ליד הטווח לנתיחה והגדר את הטמפרטורה 37 מעלות צלזיוס. שמור של 37 ° C, 5% CO2 והוא החממה באטמוספירה של2 O קרוב לחדר ניתוח.</li>
</ol>2. השחלה לנתיחה ותרבות איברים
הערה: השחלות יכול להיות גזור בטמפרטורת החדר כל עוד החשיפה הטמפרטורה לא אידאליות הוא מינימלי.
<ol><li>המתת חסד העכברים נקבה ביום אחרי לידה 5, על-ידי עריפת ראש, אחד בכל פעם. הערה: המתת חסד להתבצע בהתאם להנחיות IACUC נוכח המתקן שבו מתבצע המחקר.</li>
	<li>לרסס את החיה עם 70% EtOH. מקם את החיה על מגבת נייר יבש מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. מניחים צלחת תרביות רקמה 35 מ מ המכיל השחלה מדיה תרבות קרוב המיקרוסקופ לנתיחה.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים או ניתוח מיקרו איריס מספריים, לעשות חתך דרך העור של החיה, לתוך חלל הבטן, באמצעות התראה לא לחתוך לתוך המעיים. לדחוף את המעיים מתוך חלל הבטן ואתר השחלות. לחלץ את השחלות, למקם אותם לתוך המנה תרביות רקמה 35 מ מ המכיל תרבות המדיה.</li>
	<li>ברגע השחלות יש כבר גזור מן החיה, להגדיל את דרגת ההגדלה של מיקרוסקופ לנתיחה כדי להמחיש השחלות ואת כל הרקמה המצורפת. עם לנקות עצה בסדר מלקחיים, להסיר את כל הרקמות ללא השחלות, בורסה ו רקמות שומן. להיות זהירים כדי להשאיר את השחלות ללא שינוי בעת הסרת הרקמה ללא השחלות המצורפת.</li>
	<li>לאחר השחלות מבודד, למקם את הזוג הכיסויים התרבות תאים טרום רטוב של צלחת 24-ובכן המוביל (עיין שלבים 1.4.2 ו 1.4.3) ולכוונן את העוצמה של המדיום כדי להבטיח כי זה מספיק לשמור את האיבר לחות (ללא לחלוטין השוקע זה). זהירות: היזהרו לא דקרו הממברנה של התא הקדמי תרבות בעת העברת השחלות.</li>
	<li>המקום explanted איברים 37 ° C, 5% CO2ו החממה באטמוספירה של2 O.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.1-2.6 עד השחלות של כל בעל חיים גזור והניח על התרבות התא הכנס של צלחת 24-ובכן המכיל המדיום תרבות השחלה.</li>
	<li>שינוי המדיום תרבות השחלה כל יומיים, באמצעות חימם השחלה מדיה aliquots מ באמבט מים 37 ° C והמשך חלק 3 של הפרוטוקול בנקודת הזמן ניסיוני הרצויים.</li>
</ol>3. רקמות קיבוע
<ol><li>צינור חרוטי 15 מ"ל, להכין 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (למשל, להוסיף 2 מ"ל של 16% PFA מיקרוסקופ אלקטרונים כיתה 6 מ של PBS 1 x). התראה: PFA הוא חומר מסוכן ויש לטפל ברדס כימי.</li>
	<li>לתקן את השחלות בתרבית, מבלי להסיר את הרקמה מהמכסה התרבות, על ידי כיסוי הרקמה עם הפתרון PFA הטרי של 4%. לאטום את הקצוות של הצלחת עם דבק פלסטיק (כדי למנוע אידוי) מקום הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: על מנת להקל על הטיפול ושלמות הרקמות, להימנע ועקרו מבתיהם השחלות מהמכסה התרבות התא לאורך ההליך כולו. בתרבית מצורף אל פני השטח של הקדמי שהשחלות יתרון לטיפול ללא גרימת נזק או אובדן איבר המין.</li>
	<li>לשטוף את הרקמה 3 x עם 70% EtOH ולאחר מכן המשך לשלב 4.1 או חנות זה נצנוץ הבקבוקונים מלאים 70% EtOH ב 4 ° C עד יותר עיבוד. הערה: אם באמצעות רקמות endogenously המבטאים חלבונים פלורסנט, אחסון הדגימות עם 70% EtOH ייתכן מאוד לצמצם את האות. לחלופין, רקמות יכול להיות לשטוף ומאוחסנים מגניב עם אזיד הנתרן 0.2% (נאן3). נאן3 , אולם הוא רעיל מאוד מהווה סיכון רציני אינהלציה. להפוך את הפתרון מניות בשכונה fume וטפל ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כגון מעבדה מעילו ואת nitrile כפפות.</li>
</ol>4. כל הר Immunofluorescence
<ol><li>מקום הרקמה קבוע 1 x PBS ב RT לפחות 4 שעות לפני השלב permeabilization 4.3.</li>
	<li>להכין permeabilization פתרון פתרון חסימה.<ol>
<li>להכין פתרון permeabilization כמתואר. כדי 1 x PBS, להוסיף 0.2% אלכוהול (PVA), 0.1% נתרן borohydride (NaBH4) פתרון (מתוך wt.% 12 בפתרון הידרוקסיד הנתרן (NaOH) 14 מ') ו- 1.5% פוליאתילן טרט -octylphenyl גליקול (דטרגנט חומרים פעילי שטח ללא יונית). צינור חרוטי 50 מ ל, הוסף 5 מ של 10 x PBS, 0.1 גר' PVA µL 50 NaBH4, µL 750 של דטרגנט חומרים פעילי שטח ללא יונית, ולאחר מכן להוסיף הנדסה גנטית מים עד 50 מ ל, להתסיס היטב בטמפרטורת החדר עד שהתערובת לחלוטין בפתרון.</li>
		<li>להכין פתרון חסימה כמתואר. 1 x PBS, מוסיפים חומרים פעילי שטח ללא יונית 0.1% דטרגנט, 0.15% של 2.5 מטר גליצין pH 7.4, סרום עז נורמלי 10%, 3% אלבומין שור (BSA), נאן 0.2%3, 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100 ו 0.25 µg/mL שהוא גוסס B. להכין פתרון מניות של 2.5 גליצין מ' על ידי המסת g 93.8 של גליצין במים הנדסה גנטית לאמצעי הסופי 500 מ"ל (pH 7.4) ופתרון מניות של 10% נאן3 על ידי המסת 5 g ב- 50 מ ל מים הנדסה גנטית; לאחר מכן, צינור חרוטי 50 מ ל להכין את הפתרון חסימה על-ידי הוספת 5 מיליליטר 10 x PBS, 50 µL של חומרים פעילי שטח ללא יונית דטרגנט, 750 µL של פתרון מניות גליצין, 5 מ של עז סרום, 1.5 גר' BSA, 1 מ"ל של נאן3 מניות פתרון , ו- 0.5 מ ל 100 x מלאי של פניצילין, סטרפטומיצין, ו- B שהוא גוסס. מוסיפים מים הנדסה גנטית עד נפח סופי של 50 mL ומזרק מסנן הפתרון הסופי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להסיר, למחוק את PBS 1 x מ המבחנה, ולאחר מכן להוסיף לפתרון permeabilization מספיק לגמרי להטביע את השחלות. מקם את הדגימה permeabilization פתרון על שייקר מסלולית (למשל, nutator) בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות. הערה: זמן הדגירה עשויים להשתנות בהתאם לעובי איברים.</li>
	<li>החלף את הפתרון permeabilization מספיק לפתרון חוסם לגמרי להטביע את השחלות. לאטום את המבחנה עם דבק פלסטיק ולהשאיר את הרקמה המקננת למינימום 12 שעות בטמפרטורת החדר-תפקודי לב / נשימה.</li>
	<li>להכין נוגדן ראשוני דילול בפתרון חסימה לפי גליון הנתונים של היצרן. הערה: שימו לב כי לא כל נוגדנים תואם הסוכן סליקה. אמצעי האחסון הממוצע צורך לכל דגימה היא בערך 750 µL.<ol>
<li>על כימות oocyte, להשתמש TAp63 (סמן גרעיני oocyte) ו MVH (סמן cytoplasmic תא הנבט). הערה: הנוגדנים בשימוש של תמונות immunofluorescence הם העכבר anti-p63 וארנבת אנטי-MVH). הפתרון נוגדן ראשוני ניתן לשימוש חוזר 2 x או יותר אם האחסון ב 4 ° C בין מכתים פרוטוקולים, טופלו כהלכה כדי למנוע התפתחות חיידקים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למקם את תותב המכיל את הרקמה לתוך צלחת 24-ובכן, להוסיף בערך 750 µL של נוגדן ראשוני פתרון. ודא כי השחלות לגמרי טובע. חותם את הצלחת עם דבק פלסטיק למזער אידוי ולעזוב את הרקמה המקננת ארבעה ימים בטמפרטורת החדר-תפקודי לב / נשימה.</li>
	<li>להכין את הפתרון כביסה.<ol>
<li>להכין פתרון כביסה כמתואר. להפוך 1 x PBS, להוסיף דטרגנט חומרים פעילי שטח ללא יונית PVA ו- 0.15% 0.2%. צינור חרוטי 50 מ ל, הוסף 5 מ של 10 x PBS, 0.1 גר' PVA, µL 75 של דטרגנט חומרים פעילי שטח ללא יונית ומים הנדסה גנטית עד נפח סופי של 50 מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להסיר נוגדן ראשוני לדילול ומוסיפים כמות נדיבה של הפתרון כביסה. תמיד הקפידו להטביע את השחלות. לאפשר את השחלות כדי להשרות את הפתרון ללילה בטמפרטורת החדר-תפקודי לב /.</li>
	<li>להחליף את הפתרון כביסה, דגירה על תפקודי לב / נשימה במשך שעתיים או יותר.</li>
	<li>חזור על השלב 4.9 פעם נוספת.</li>
	<li>להכין נוגדן משני הדילול בחסימה פתרון. הערה: הנוגדנים משני המשמש הן אנטי-העכבר 488 הפלורסנט וגדל עז אנטי-ארנב 594 הפלורסנט העולות עז. ראה שלב 4.5. עבור אמצעי האחסון הממוצע צורך לכל דגימה.</li>
	<li>הפתרון כביסה להסיר השחלות ולהוסיף פתרון נוגדנים משניים. להגן על הדגימות מפני אור (צלחת פלסטיק ברדיד אלומיניום) ויסגור את הצלחת עם דבק פלסטיק כדי למזער את אידוי. דגירה דוגמאות על תפקודי לב / נשימה בטמפרטורת החדר במשך יומיים. הערה: המשך הגנה על הדגימות מן האור באמצעות נייר אלומיניום במהלך כל השלבים הבאים הדגירה.</li>
	<li>הסרת פתרון נוגדנים משניים מדגימות ולהוסיף הפתרון כביסה. דגירה על תפקודי לב / נשימה במשך 8 שעות. הערה: אם, 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (דאפי) צביעת רצוי להוסיף 50 ננוגרם למ"ל של דאפי לצעד רחיצת הראשון (~ 8 h הדגירה).</li>
	<li>החלף את הפתרון כביסה ושטוף לילה.</li>
	<li>בעת הכנת הפתרון סליקה (ראו סעיף 5), להחליף את הלילה שטיפה פתרון פתרון טריים, שומרים את הדגימות-תפקודי לב / בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>5. השחלה ניקוי והדמיה
<ol><li>להכין ScaleS(0) ניקוי פתרון.<ol>
<li>להכין ScaleS(0) ניקוי פתרון10 על-ידי הוספת ריאגנטים ביחס נתון של: 40% D-(-) בסורביטול (w/v), גליצרול 10%, אוריאה 4.3 מ' ו- 20% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), pH 8.1 (למשל צינור חרוטי 50 מ ל, להוסיף 2.5 מ של גליצרול, 10 גרם של בסורביטול , 5 מ של דימתיל סולפוקסיד ולאחר 12 מ של 9 מטר אוריאה עבור הנפח הכולל של 25 מ ל. לערבב פתרון על-ידי היפוך ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, דגה לפני השימוש.)</li>
	</ol>
</li>
	<li>להסיר את הפתרון כביסה ויציפו את הדגימות לפנות פתרון. לקבלת תוצאות טובות יותר לשמור על דגימות על ניעור מסלולית.</li>
	<li>להחליף את פתרון סליקה 2 x מדי יום עד הרקמה הופך שקוף (כ- 2 ימים).</li>
	<li>ברגע הרקמה אינה מסומנת, להכין את הדגימה עבור הדמיה על-ידי הסרת בזהירות את הקרום הוספה המכיל את השחלות תרבותי עם קנס עצה המדגם. אזמל והצבת על משטח זכוכית.</li>
	<li>המשך הדמיה הדגימות על מיקרוסקופ המסוגל חלוקתה אופטי.</li>
</ol>6. oocyte כמת
הערה: ישנם תוכניות מחשב שונים רבים יכולים לכמת תאים. המתוארים להלן הוא פרוטוקול על כימות oocyte באמצעות החבילה עיבוד התמונה מסחרי, פיג'י-ImageJ14.
<ol><li>באמצעות הקרנה שעברו שיטוח העוצמה המקסימלית של Z -מחסנית התמונה הסדרה עבור הסמנים סלולרית ספציפית עניין (ללא הערוץ דאפי), המירו את התמונה לתמונת שחור-לבן 8 סיביות תחת סוג ב התמונה הנפתחת תפריט.</li>
	<li>תחת התפריט הנפתח התמונה , לסמן את הכרטיסיה התאם ולאחר מכן בחר הסף.</li>
	<li>כוונן באופן ידני את הסף לרמה הטובה ביותר המזהה כל oocyte בודדים. ברגע הרמה נקבעת, לחץ על החל כדי להפיק תמונה בשחור-לבן. עם סיום, לכמת את הדגימה באמצעות התוחמים את סמל סגלגל או פריהנד . הערה: פיג'י-ImageJ יש אפשרויות שונות לחידוד התמונה שתשמש עבור כימות של חלקיקים. למשל, ב- תהליך | בינארי טאב, קיימות אפשרויות שונות, יכול לשמש כדי לשפר את הגילוי של מה ייספרו. איור 4, האפשרויות להשתמש טוב יותר לצורך זקיקים היה לשחוק, ואחריו למלא חורים, ולבסוף קו פרשת המים.</li>
	<li>תחת התפריט הנפתח נתח , בחר נתח חלקיקים. להגדיר את הפרמטרים על פי הרזולוציה הרצויה.</li>
</ol>

<ol><li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li>
<li>Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+Co-Culture+of+Mouse+Ovaries+and+Ovarian+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+retinoids+on+the+meiosis+in+the+fetal+rat+ovary+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).</li>
<li>Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+null+mutation+protects+mouse+oocytes+from+radio-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis.</a> Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).</li>
<li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+follicle+counts+-+not+as+simple+as+1%2C+2%2C+3%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11(2003).</li>
<li>Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+sampling+on+the+reproducibility+of+ovarian+follicle+counts+in+mouse+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies.</a> Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).</li>
<li>Skodras, A., Marcelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Generated+Ovaries+to+Assist+Follicle+Counting+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments.</a> PLOS ONE. 10 (3), e0120242(2015).</li>
<li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Whole-Mount+Approach+for+Accurate+Quantitative+and+Spatial+Assessment+of+Fetal+Oocyte+Dynamics+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Inhibition+of+the+DNA+Damage+Checkpoint+Prevents+Radiation-Induced+Oocyte+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death.</a> Genetics. , genetics.117.203455 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/418497a">Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro.</a> Nature. 418 (6897), 497(2002).</li>
<li>Faire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+dynamics+and+global+organization+in+the+intact+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary.</a> Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).</li>
<li>Byrne, C., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Assays+for+Gene+Induction+and+Barrier+Formation+in+the+Developing+Epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Epidermal+Cells%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis.</a> Epidermal Cells. , 127-136 (2005).</li>
<li>Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Development. 6, 10(2011).</li>
<li>Laronda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioprosthetic+ovary+created+using+3D+printed+microporous+scaffolds+restores+ovarian+function+in+sterilized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice.</a> Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

המחקר של רבייה יונקים דורש שימוש וכימות תאים מיוחדים נתונות לא שגרתי תרבית תאים. עם זאת, שמחוץ תרבות מערכות יעילים בשמירה השחלה ואת זקיק הכדאיות1,15. במהלך תרבות השחלה, הרקמה דורש שטח פנים גדול יותר עבור חילופי חומרים מזינים באמצעות דיפוזיה. לכן, העכבר 5 - בן יום השחלות אידיאליים בגודל ולגיבוש לתרבות איברים. פרוטוקול זה היה אופטימיזציה עבור השחלות נשמר במשך שבעה ימים בתרבות, אך אורך תרבות השחלה יכול להיות מותאם על פי שאלה מדעית ספציפית1...

ללימוד הרכב הסלולר ואת תכונות מורפולוגיות של השחלות יונקים, מדענים לעיתים קרובות לסמוך על ויוו ניסויים ואחריו immunohistological מכתים פרפין מוטבע השחלות. נוסף לאחרונה אף, השחלה כל איבר תרבות הוכיחה להיות חלופה יעילה ללמוד תפקוד השחלות1,2,3,4 , כי הטכניקה יכולה להיות בשילוב עם כאחראית ו כימות כלים. באופן מסורתי, ניתוח של מורפולוגיה השחלות תלוי בשחזור אדריכלות השחלות תלת מימדי ממקטעים טורי פרפין מוטבע, אבל, בנוסף להיותו מפרך, זמן רב, באופן סדרתי חלוקתה פרפין מוטבע רקמות לא ערובה שחזור נכונה של האיבר, סעיפים לעיתים קרובות אבדו או הורה בזיהוי שגיאות בתהליך.
בנוסף האתגרים הטכניים הקשורים עם חלוקתה טורי, ישנם גם וריאציות של השיטות בשימוש שגרתי לכמת זקיק מספרים לאדם שחלה5,6. ההשתנות מתודולוגי בשימוש כיום פוגע מטא אנליזה של השחלות מילואים לאורך הלימודים5,7. לדוגמה, זקיק מספרים מתוך מאמרי מחקר שונים יכול להשתנות על ידי 10-fold או יותר בין הגילאים התפתחותית דומה בתוך זן ספציפי6. אלה הבדלים גדולים כימות שדווחה זקיק יכול להוביל לבלבול, יש הפריע קרוס-לימוד השוואות. השפעול, גישות מסורתיות זקיק כימות ממקטעים טורי מבוצעות על ידי ספירת זקיקים של מספר סעיפים מוגדרים מראש (למשל, החלטה, העשירי, או מקטע אחר). השתנות בתוך זקיק ספירות באמצעות גישה זו מתעוררת לא רק בשל את תקופתיות ב אילו מקטעים נספרים אלא גם וריאציות עובי סעיף ב, ניסיון טכני ביצירת המקטעים טורי5,6. בנוסף ההשתנות שלו, חיסרון נוסף של רקמה מסורתית חלוקתה היא כי חלוקתה של השחלות קטן מבעלי חיים צעירים הוא מאתגר במיוחד, תלויים במידה רבה רקמות התמצאות8.
פרוטוקול שלהלן מתאר את טכניקת תרבות1 שחלה בשימוש שגרתי אך הוא משפר באופן משמעותי על כימות זקיק מסורתי על ידי החלפת חלוקתה פיזי ברקמות ניקוי ואת חלוקתה אופטי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית8 ,9. ניקוי באמצעות רקמות טבילה (ללא צורך זלוף טראנס או אלקטרופורזה) ב שתנן בסורביטול מבוססות פתרון (למשל, ScaleS(0)10) הוכיח תואם immunostaining ואת המותר עבור הפחתת ניקוי זמן מבלי להתפשר על עומק הדמיה. שיטות אחרות (למשל, ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12ו- ClearT212) הם גם יותר זמן רב או אל תאפשר מעמיק רזולוציה אופטית של המדגם. חלוקתה אופטי הוא יתרון, כי זה פחות עמל רב ומתחזק של האיבר ארכיטקטורה תלת מימדי7,8. יתרון נוסף של גישה זו היא הכנת הדגימות לא דורשת ריאגנטים יקר כדי לנקות את הרקמה והוא יכול להתבצע בקלות יחסית.
באופן ספציפי, הפרוטוקול המתואר מוטבה עבור העכבר בתרבית השחלות ביום כמחנכת חמש, אבל התנהל על השחלות החל כמחנכת יום 0 - 10. השיטה עושה שימוש במערכת התרבות שחלה בו הרקמה באופן טבעי מייחסת הקרום שעליו זה הוא תרבותי, הקלת איברים טיפול ומניפולציה. מערכת התרבות תיאר יכול לשמש כדי לשמור על השחלות explanted עד 10 ימים, כדי להעריך כמה תנאים ניסיוני עלולים להפריע oocyte הישרדות13. ההליך כימות המתואר מתבצע באמצעות התמונה מסחרי עיבוד החבילה פיג'י-ImageJ14 , יכול להתבצע על רוב המחשבים האישיים. יתר על כן, התמונות המשמשות על כימות יהיה זמין נרחב עבור הקהילה המדעית, ובכך מאפשר עבור העתיד מטא אנליזה.

<table><tbody><tr><td>מספריים מיקרו כריתה 4.5 ", ישר, נקודות חדות</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>מיקרו מספריים ניתוחים</td></tr>, <tr><td>מלקחיים בסגנון תכשיטנים 4-3/8 ", סגנון 5</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305X</td><td>מלקחיים בקצה עדין</td></tr><tr><td>מספריים מיקרו איריס 4 ", ישר, נקודות חדות</td><td>Integra Miltex</td><td>18-1618</td><td>מספריים מיקרו כריתת קשתית או מספריים קפיציים מיקרו מנתחים</td></tr><tr><td>1X מינימלי מדיה חיונית (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג סריום בקר עוברי</td><td></td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>בשימוש בשלב 1.3.1</td></tr><tr><td>35 מ"מ טיפול בתרבית רקמות</td><td></td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>נונק ומסחר; צלחת מנשא 24 באר לתרבית תאים מוסיפה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>141006</td><td>גודל נקבוביות: 8&mu; m</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>תמיסה 16% 1X</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Nutator Mixer GyroTwister&trade;</td><td>Labnet</td><td>S1000-A-B</td><td>שייקר תלת מימדי</td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>VWR</td><td>103219-578</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן בורוהידריד (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452904-25ML</td><td>השתמש בתמיסה, במקום ב צורת טבליות או אבקה&nbsp;</td></tr><tr><td>אלכוהול פוליוויניל (PVA)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8136-250G</td><td>טריטון מסיס במים קרים</td></tr><tr><td>ומסחר; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>פוליאתילן גליקול tert-octylphenyl</td></tr><tr><td>אתר מסנני מזרק</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>725-2520</td><td>25 מ"מ</td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרקים</td><td>BD</td><td>309695</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-p63 נוגדן (4A4)</td> <td>Biocare Medical</td><td>CM 163A</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-MVH נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab13840</td><td>דילול 1:600</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; עיזים נגד עכבר 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>דילול 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; עז נגד ארנב 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>דילול 1:1000</td></tr><tr><td>4,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)&nbsp;</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)סורביטול&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>240850-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G9012-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D2650-5X10 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>FIJI-ImageJ</td><td></td><td></td><td>תוכנה לעיבוד תמונה</td></tr><tr><td>פיפטות חד פעמיות להעברת פלסטיק</td><td>VWR</td><td>414044-034</td><td></td></tr></tbody></table>

immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

המחקר בתחום הביולוגיה הרבייה יונקים כרוך לעתים קרובות הערכת הבריאות הכללית של השחלות, האשכים. באופן ספציפי, אצל נקבות, כושר השחלות הוא לעיתים קרובות לאומדן להמחיש וכימות זקיקים ו- oocytes. מכיוון השחלה רקמות תלת מימדי אטום, הגישות המסורתיות דורשים בעמל רב חותך את הרקמה למקטעים טורי רבות כדי להמחיש תאים לאורך האיבר כולו. יתר על כן, מכיוון כימות בשיטה זו בדרך כלל כרוכה מניה רק ערכת משנה של המקטעים מופרדים על-ידי הקוטר המשוער של oocyte, זה נוטה דיוקים. כאן, פרוטוקול המתואר במקום מנצל כל האיבר רקמות סליקה ו- immunofluorescence מכתים של השחלות העכבר כדי להמחיש זקיקים ו- oocytes. לעומת גישות מסורתיות יותר, פרוטוקול זה יש יתרון להמחשת תאים בתוך השחלה מסיבות רבות: 1) השחלה נשאר שלם במהלך הכנת הדוגמא ועיבוד; 2) שחלות קטן, אשר קשה למקטע, תוכל להיבדק בקלות; 3) כמת סלולריים מושגת בקלות רבה יותר ובאופן מדויק; . ו-4) כל האיבר עם תמונה.

פרוטוקול זה כולל 6 שלבים עיקריים בעקבות ניתוח של השחלות, כמתואר באיור1. איור 2 , איור 3 , איור 4 להדגיש את התכונות הכי חדשניים של פרוטוקול זה, הכוללים אופטימיזציה של רקמות ניקוי השחלות, כימות oocyte כל רקמה באמצעות פיג'י-ImageJ. איור 2A מראה תמונות של מחציתה 5 ימים לאחר הלידה קבוע שחלה לפ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת זקיקי השחלה בתרבית של עכברים צעירים ללא חלוקתה טורי. שימוש immunofluorescence כל איבר ורקמה ניקוי, חלוקתה הפיזי מוחלף עם חלוקתה אופטי. שיטה זו של הכנת הדוגמא והדמיה שומר על תקינות האיברים ואסטמה ומקילה על כימות אוטומטיות של תאים ספציפיים.

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג תמונות של שחלות שלמות מתורבתות התואמות לכימות זקיקים אוטומטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הרבייה, כגון כיצד מצבים שונים מפריעים לכושר השחלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פחות עתירת עבודה ושומרת על הארכיטקטורה התלת מימדית של העוגב.למרות ששיטה זו עברה אופטימיזציה עבור שחלות עכברים מתורבתות ביום החמישי לאחר הלידה, ניתן ליישם אותה גם על גילאים ורקמות אחרות כגון בלוטות מין עובריות או אשכי עכברים צעירים. התחל עם משטח עבודה נקי. נגב עם עשרה אחוז אקונומיקה ואפשר לאקונומיקה להישאר על משטח אזור העבודה למשך חמש דקות לפחות.לאחר חמש דקות, הסר עודפי אקונומיקה עם מגבות נייר נקיות ואתנול 70 אחוז. נקו היטב את מיקרוסקופ החיתוך עם 70 אחוז אתנול והניחו מגבת נייר יבשה על הבמה. עטפו מלקחיים ומספריים נקיים במגבת נייר לחה ב-70 אחוז אתנול.לאחר מכן הכינו 50 מיליליטר של מצע תרבית שחלות בצינור חרוטי וחממו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהמדיום התחמם, הכינו צלחות ותוספות על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום תרבית שחלות לצלחות תרבית רקמות של 35 מילימטר. לאחר מכן הוסיפו כ-0.55 מיליליטר מדיום לבארות של צלחת תרבית רקמות בת 24 בארות והניחו תוספת לכל מדיום המכיל באר.ודא שהממברנות נוגעות במדיה. הנח את לוחות 35 המילימטר ואת צלחת הנשיאה של 24 הבארות לתוך 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזים פחמן דו חמצני וחמצן אטמוספרי. לאחר מכן הניחו פלטה חמה ליד טווח החיתוך והגדירו את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס.אם חממת תרבית הרקמות אינה קרובה לאזור הדיסקציה, הנח אחת מכלי תרבית הרקמה בגודל 35 מילימטר המכילה אמצעי תרבית שחלות על הפלטה החמה. לאחר מכן התחל את הדיסקציה על ידי ריסוס הנקבה הטרייה שהורדמה ב-70 אחוז אתנול והניח על גבי מגבת הנייר היבשה מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה. לאחר ביצוע חתך בחלל הבטן, הוצא את המעיים ואתר את השחלות.מחלצים את השחלות ומניחים אותן במדיום התרבות בצלחת 35 מילימטר. לאחר ניתוח השחלות, הגדל את ההגדלה של מיקרוסקופ הדיסקציה כדי לדמיין טוב יותר את השחלות וכל רקמה מחוברת. בעזרת מלקחיים נקיים עם קצה עדין, הסר את כל הרקמות שאינן שחלות כגון בורסה ורקמת שומן מבלי לפגוע בשחלות.לאחר מכן, הניחו כל זוג שחלות על תוספת תרבית תאים ספוגה מראש והתאימו את נפח המדיום כדי להבטיח שהוא מספיק כדי לשמור על לחות האיבר מבלי להטביע אותו לחלוטין. הנח איברים שהושתלו ב-37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוז פחמן דו חמצני וחממת חמצן אטמוספרית. בנקודת הזמן הרצויה לניסוי, הסר את אמצעי תרבית השחלות מהצלחת וקבע את השחלות המתורבתות על התוספת על ידי כיסוי הרקמה בתמיסת PFA טרייה של ארבעה אחוזים.אוטמים את שולי הצלחת בניילון פרפין כדי למנוע אידוי ומניחים את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטפו את הרקמה שלוש פעמים עם 70 אחוז אתנול. לאחר מכן יש לאחסן בבקבוקוני נצנוץ מלאים ב-70 אחוז אתנול בארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף.התחל לצבוע על ידי הסרת 70 אחוז אתנול מהבקבוקונים ושטיפת הרקמה הקבועה עם PBS בטמפרטורת החדר עם ניעור למשך ארבע שעות לפחות. לאחר הסרת ה-PBS, הוסף מספיק תמיסת חדירות כדי לטבול לחלוטין את השחלות. מניחים על שייקר אורביטלי ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות.החלף את תמיסת החדירות בתמיסת חסימה מספקת כדי להטביע לחלוטין את השחלות. לאחר מכן דגרו את הבקבוקונים האטומים בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות לפחות על שייקר מסלולי. לאחר החסימה, הניחו את התוספות בצלחת של 24 בארות והוסיפו כ-750 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית כדי להבטיח שהשחלות שקועות לחלוטין.לאחר מכן הניחו את הצלחת האטומה על שייקר המסלול ודגרו במשך ארבעה ימים בטמפרטורת החדר. לאחר ארבעה ימים, הסר את הנוגדן העיקרי והוסף כמות נדיבה של תמיסת כביסה. שוטפים את השחלות למשך הלילה.למחרת, החלף בתמיסת כביסה טרייה ודגר על שייקר המסלול למשך שעתיים או יותר. לאחר השטיפות, הוסף תמיסת נוגדנים משנית. הגן על הדגימות מפני אור ודגר על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר למשך יומיים.לאחר יומיים, הסר את תמיסת הנוגדנים המשנית מהדגימות והוסף תמיסת כביסה. התחל בהכנת תמיסת פינוי ScaleS0. מערבבים את התמיסה בהיפוך ודוגרים בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.הסר גז מתמיסת הפינוי ScaleS0. לאחר מכן הסר את תמיסת הכביסה מהשחלות המוכתמות במערכת החיסון. הוסף את פתרון הסליקה.מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומחזירים אותה לשייקר המסלול. חשוב ביותר להתאזר בסבלנות במהלך שלבי הצביעה והניקוי. לאחר שהרקמה הפכה שקופה, השתמש באזמל קצה דק כדי להסיר בזהירות את ממברנות ההכנסה המכילות את השחלות המתורבתות.הניחו את הדגימה על שקופית זכוכית וכסו בעדינות את הדגימה עם כיסוי. לאחר מכן המשך לדמות את הדגימות במיקרוסקופ המסוגל לחתוך אופטי. תמונה זו מציגה שחלה ביום החמישי לאחר הלידה שלא נוקה.כאן, השחלה מוצגת שעה לאחר הוספת תמיסת הפינוי. השחלה תתחיל להיות שקופה תוך דקות מרגע השקיעה בתמיסת הפינוי. חתך אופטי של שחלות מתורבתיות ללא ניקוי אפשרי, אך לתאים עמוק בתוך הרקמה יש אות שקשה להבדיל מהרקע, מה שמפריע לכימות נכון של הביציות.לעומת זאת, תמונה מייצגת זו מציגה דגימה נקייה שבה ניתן לכמת ביציות בכל האיבר. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהנוגדנים צריכים להתפזר דרך הרקמה; לפיכך, רקמות עבות יותר ידרשו זמן דגירה ארוך יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבת, להכתים ולדמות שחלות שלמות.הטקסט מתאר את השימוש בתוכנה חופשית, Fiji ImageJ, שניתן להשתמש בה לכימות זקיקים פשוט. אל תשכח שעבודה עם פרפורמלדהיד ונתרן אזיד עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון שימוש במכסי אדים וציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.

whole-mount-immunofluorescence-follicle-quantification-cultured-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר את התרבות העיקרית / שיתוף התרבות של רקמת השחלה עכבר, באמצעות השחלות מעכברים בילוד וזקיקים בשחלות בודדות מעכברים לפני גיל בגרות מיניים. טכניקות התרבות לתמוך בפיתוח באופן פיסיולוגי מאוד, המאפשר חקירה של ההשפעה של סוכנים חיצוניים בשחלה, ושל יחסי גומלין בין זקיקים בשחלות.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

בתרביות רקמה השחלות יכול לשמש דגמים של זקיק פיתוח, הביוץ זקיק בהכנת ולציין את מנגנוני הרגולציה של תהליכים דינאמיים השחלות.

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

כאן, אנו מתארים, להשוות, ולהשוות שתי טכניקות שונות לספירת זקיק מדויקת של רקמות השחלות עכבר קבוע.

ספירה מדויקת של זקיקים בשחלות עכברים למבוגרים

כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם להדמיית שחלות שלמות לניתוחים כמותיים ואיכותיים באמצעות שמירה חיסונית בהרכבה מלאה, מיקרוסקופיית מולטי-פוטון והדמיה וניתוח תלת-ממדיים. פרוטוקול זה מתאים לעיבוד בעל תפוקה גבוהה, אמין וניתן לחזרה, החל על טוקסיקולוגיה, אבחון קליני ובדיקות גנומיות של תפקוד השחלות.

אימונופלואורסצנציה של השחלה כולה, ניקוי ומיקרוסקופיה מרובת פוטון לניתוח תלת-ממדי כמותי של עתודת השחלות המתפתחות בעכבר

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השראת תוכנית המוגנית בפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות ביטוי יתר של קבוצה מינימלית של גורמי שעתוק. טכנולוגיה זו עשויה להיות מתורגמת למערכת האנושית כדי לספק פלטפורמות למחקר עתידי של המטופואיזה, מחלות המטולוגיות והשתלת תאי גזע המטופויאטיים.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

אנו מציגים שיטה בידוד והתרבות של צינור העכבר Wolffian (WD). אנחנו גם מדגימים נוהל מפורט immunostaining הר שלם של WDS תרבותי / טרי מבודד עם נוגדנים מתויג fluorescently. יחד, טכניקות אלו מאפשרים את חקר התפתחות WD, התפתלות, והבחנה.

תרבות איברים שלמים הר Immunofluorescence מכתים של עכבר Wolffian צינוריות

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

ב פרוטוקול זה, אנחנו מתארים טכניקות ניתוח ראוי תודרנית פרחים, siliques, כמה טכניקות ניקוי בסיסי, ונבחר מכתים נהלי כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כל הר immunofluorescence וניתוח מבוססת תמונה כמותית volumetric העובר העכבר בשלב מוקדם. אנו מציגים טכניקה זו כמו בגישה רב-עוצמה איכותית באופן כמותי להעריך מבנים לב במהלך הפיתוח, ואני מציע כי ייתכן נרחב יכולת הסתגלות למערכות איברים אחרים.

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

השחלה דרוזופילה הוא מערכת דגם מעולה ללימוד פיתוח גומחת תאי גזע. על פי שיטות ניקוד השחלות זחל ומבוגרים פורסמו, השחלה הגולמי והניתוחים דורשות טכניקות שונות זה לא פורסמו בפירוט. כאן אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לנתח, מכתים של הרכבה השחלות הגולמי.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

למדו שיטת אימונופלואורסצנציה וניקוי רקמות לכימות זקיקים בשחלות תרבותיות של עכברים צעירים. שיטה זו שומרת על מבנה תלת-ממדי ומאפשרת ניתוח אוטומטי יעיל.

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

גלה סרטונים נוספים