Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג תמונות של שחלות שלמות מתורבתות התואמות לכימות זקיקים אוטומטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הרבייה, כגון כיצד מצבים שונים מפריעים לכושר השחלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פחות עתירת עבודה ושומרת על הארכיטקטורה התלת מימדית של העוגב.

למרות ששיטה זו עברה אופטימיזציה עבור שחלות עכברים מתורבתות ביום החמישי לאחר הלידה, ניתן ליישם אותה גם על גילאים ורקמות אחרות כגון בלוטות מין עובריות או אשכי עכברים צעירים. התחל עם משטח עבודה נקי. נגב עם עשרה אחוז אקונומיקה ואפשר לאקונומיקה להישאר על משטח אזור העבודה למשך חמש דקות לפחות.

לאחר חמש דקות, הסר עודפי אקונומיקה עם מגבות נייר נקיות ואתנול 70 אחוז. נקו היטב את מיקרוסקופ החיתוך עם 70 אחוז אתנול והניחו מגבת נייר יבשה על הבמה. עטפו מלקחיים ומספריים נקיים במגבת נייר לחה ב-70 אחוז אתנול.

לאחר מכן הכינו 50 מיליליטר של מצע תרבית שחלות בצינור חרוטי וחממו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהמדיום התחמם, הכינו צלחות ותוספות על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום תרבית שחלות לצלחות תרבית רקמות של 35 מילימטר. לאחר מכן הוסיפו כ-0.55 מיליליטר מדיום לבארות של צלחת תרבית רקמות בת 24 בארות והניחו תוספת לכל מדיום המכיל באר.

ודא שהממברנות נוגעות במדיה. הנח את לוחות 35 המילימטר ואת צלחת הנשיאה של 24 הבארות לתוך 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזים פחמן דו חמצני וחמצן אטמוספרי. לאחר מכן הניחו פלטה חמה ליד טווח החיתוך והגדירו את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס.

אם חממת תרבית הרקמות אינה קרובה לאזור הדיסקציה, הנח אחת מכלי תרבית הרקמה בגודל 35 מילימטר המכילה אמצעי תרבית שחלות על הפלטה החמה. לאחר מכן התחל את הדיסקציה על ידי ריסוס הנקבה הטרייה שהורדמה ב-70 אחוז אתנול והניח על גבי מגבת הנייר היבשה מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה. לאחר ביצוע חתך בחלל הבטן, הוצא את המעיים ואתר את השחלות.

מחלצים את השחלות ומניחים אותן במדיום התרבות בצלחת 35 מילימטר. לאחר ניתוח השחלות, הגדל את ההגדלה של מיקרוסקופ הדיסקציה כדי לדמיין טוב יותר את השחלות וכל רקמה מחוברת. בעזרת מלקחיים נקיים עם קצה עדין, הסר את כל הרקמות שאינן שחלות כגון בורסה ורקמת שומן מבלי לפגוע בשחלות.

לאחר מכן, הניחו כל זוג שחלות על תוספת תרבית תאים ספוגה מראש והתאימו את נפח המדיום כדי להבטיח שהוא מספיק כדי לשמור על לחות האיבר מבלי להטביע אותו לחלוטין. הנח איברים שהושתלו ב-37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוז פחמן דו חמצני וחממת חמצן אטמוספרית. בנקודת הזמן הרצויה לניסוי, הסר את אמצעי תרבית השחלות מהצלחת וקבע את השחלות המתורבתות על התוספת על ידי כיסוי הרקמה בתמיסת PFA טרייה של ארבעה אחוזים.

אוטמים את שולי הצלחת בניילון פרפין כדי למנוע אידוי ומניחים את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטפו את הרקמה שלוש פעמים עם 70 אחוז אתנול. לאחר מכן יש לאחסן בבקבוקוני נצנוץ מלאים ב-70 אחוז אתנול בארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף.

התחל לצבוע על ידי הסרת 70 אחוז אתנול מהבקבוקונים ושטיפת הרקמה הקבועה עם PBS בטמפרטורת החדר עם ניעור למשך ארבע שעות לפחות. לאחר הסרת ה-PBS, הוסף מספיק תמיסת חדירות כדי לטבול לחלוטין את השחלות. מניחים על שייקר אורביטלי ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות.

החלף את תמיסת החדירות בתמיסת חסימה מספקת כדי להטביע לחלוטין את השחלות. לאחר מכן דגרו את הבקבוקונים האטומים בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות לפחות על שייקר מסלולי. לאחר החסימה, הניחו את התוספות בצלחת של 24 בארות והוסיפו כ-750 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית כדי להבטיח שהשחלות שקועות לחלוטין.

לאחר מכן הניחו את הצלחת האטומה על שייקר המסלול ודגרו במשך ארבעה ימים בטמפרטורת החדר. לאחר ארבעה ימים, הסר את הנוגדן העיקרי והוסף כמות נדיבה של תמיסת כביסה. שוטפים את השחלות למשך הלילה.

למחרת, החלף בתמיסת כביסה טרייה ודגר על שייקר המסלול למשך שעתיים או יותר. לאחר השטיפות, הוסף תמיסת נוגדנים משנית. הגן על הדגימות מפני אור ודגר על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר למשך יומיים.

לאחר יומיים, הסר את תמיסת הנוגדנים המשנית מהדגימות והוסף תמיסת כביסה. התחל בהכנת תמיסת פינוי ScaleS0. מערבבים את התמיסה בהיפוך ודוגרים בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

הסר גז מתמיסת הפינוי ScaleS0. לאחר מכן הסר את תמיסת הכביסה מהשחלות המוכתמות במערכת החיסון. הוסף את פתרון הסליקה.

מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומחזירים אותה לשייקר המסלול. חשוב ביותר להתאזר בסבלנות במהלך שלבי הצביעה והניקוי. לאחר שהרקמה הפכה שקופה, השתמש באזמל קצה דק כדי להסיר בזהירות את ממברנות ההכנסה המכילות את השחלות המתורבתות.

הניחו את הדגימה על שקופית זכוכית וכסו בעדינות את הדגימה עם כיסוי. לאחר מכן המשך לדמות את הדגימות במיקרוסקופ המסוגל לחתוך אופטי. תמונה זו מציגה שחלה ביום החמישי לאחר הלידה שלא נוקה.

כאן, השחלה מוצגת שעה לאחר הוספת תמיסת הפינוי. השחלה תתחיל להיות שקופה תוך דקות מרגע השקיעה בתמיסת הפינוי. חתך אופטי של שחלות מתורבתיות ללא ניקוי אפשרי, אך לתאים עמוק בתוך הרקמה יש אות שקשה להבדיל מהרקע, מה שמפריע לכימות נכון של הביציות.

לעומת זאת, תמונה מייצגת זו מציגה דגימה נקייה שבה ניתן לכמת ביציות בכל האיבר. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהנוגדנים צריכים להתפזר דרך הרקמה; לפיכך, רקמות עבות יותר ידרשו זמן דגירה ארוך יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבת, להכתים ולדמות שחלות שלמות.

הטקסט מתאר את השימוש בתוכנה חופשית, Fiji ImageJ, שניתן להשתמש בה לכימות זקיקים פשוט. אל תשכח שעבודה עם פרפורמלדהיד ונתרן אזיד עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון שימוש במכסי אדים וציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.