מודל ב חוץ גופית כדי לחקור את ההשפעה של טיפול פוטודינמי 5-Aminolevulinic חומצה-מתווכת על Staphylococcus aureus Biofilm

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להעריך את ההשפעה האנטי-מיקרוביאלית של חומצה חמשת אמינולוולינית או טיפול פוטודינמי בתיווך ALA על ביופילם סטפילוקוקוס זהוב. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביופילם החיידקי כיצד תיקון תאים פוטודינמי עשוי לשמש כטיפול חלופי לשליטה בזיהומי ביופילם. היתרון של הליך זה הוא שיש לו פוטנציאל לשמש עבור חיידקים אחרים עם התאמה מינימלית.

כדי ליצור ביופילם בצלחת של 96 בארות, תחילה יש לחסן אחד מינוס 80 מעלות צלזיוס ThOD Staphylococcus aureus USA שלוש מאות בשלושה ביופילם היוצרים תרביות זן קליניות בצינורות תחתונים עגולים בודדים של 14 מיליליטר המכילים חמישה מיליליטר של מרק סויה טריפטון, או TSB, מדיום, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך הלילה. כאשר התרביות הגיעו לשלב נייח צנטריפוגה את תאי החיידקים ותשעה מחדש את הכדורים וה-PBS לפעמיים פי 10 ליחידת יצירת המושבה התשיעית לריכוז מיליליטר. לדלל את תרחיפי החיידקים הללו ביחס של אחד ל-200 ומדיום TSB בתוספת אפס נקודה חמישה אחוז גלוקוז וזרע 200 מיקרוליטר של תאי חיידקים לבאר לשלוש בארות לכל זן לכל קבוצת ניסוי בתרבית תאי פוליסטירן שטופלה ב-96 בארות מיקרופלייט למשך 24 שעות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, עם חמצן, בלי לרעוד.

למחרת, שטפו בעדינות את הבארות שלוש פעמים עם PBS מבלי להפריע לביופילמים. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של ALA טרי שהוכנו לבארות הניסוי המתאימות, והניחו את הצלחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעה מוגנת מפני אור. לאחר מכן הקרינו את הצלחת עם דיודה פולטת אור בעוצמת אור של 100 מיליוואט לסנטימטר מרובע למשך שעה.

כדי לספור את מספר החיידקים הקיימים לקבוצה בסוף הטיפול בפוטותרפיה, יש לשטוף בעדינות כל באר שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר תאים שאינם נדבקים. לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה כדי לגרד את החיידקים הדבקים מתחתית כל באר. משוך את התאים מכל קבוצה לצינור אפנדורף אחד לכל מצב ניסוי וגלול את התאים על ידי צנטריפוגה.

השעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של 0.25 אחוז אנזים פנקראטין ו-PBS למשך 90 דקות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן צנטריפוגה נוספת. השעו מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר PBS ובצעו דילול סדרתי אחד עד 10 מכל קבוצה, והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של דגימה מדוללת סדרתית על צלחות אגר סויה טריפטון בודדות. לאחר מכן דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות וספרו את מספר מושבות החיידקים לקבוצה.

להעריך את הביופילמים על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי ליצור ולהקרין את הביופילמים כפי שהודגם. שטפו את הביופילמים המוקרנים ב-PBS וצבעו את התאים החיים והמתים במיליליטר אחד של צבע חדיר לקרום תא פרוקריוטי גרעיני פלואורסצנטי וכרומוזום ומיליליטר אחד של מיקרו-מולרי פרופידיום יודיד, בהתאמה. לאחר 20 דקות הסר את הכתם העודף וצלם את הביופילמים על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי תחת עדשת אובייקט טבילה בשמן 63 פעמים 1.4 NA.

חיוניות חיידקי הביופילם יורדת לאחר טיפול כפול בפוטותרפיה ALA בהשוואה לחיידקי ביופילם בודד או לא מטופל וכל ארבעת הזנים שנבדקו. הדמיה של הביופילמים על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי מאשרת ממצא זה, כאשר רוב התאים החיוביים לעמידת פרופידיום יודיד נצפו בקבוצת הטיפול הכפול בפוטותרפיה ALA. בזמן הניסיון בהליך זה, חשוב לזכור כי יש לבצע את כל המניפולציה של החיידקים המטופלים ב-ALA בחושך, ויש לטפל בחומר הביופילם בעדינות כדי למנוע הפרעה לביופילם שנוצר.

ניתן ליישם מסר זה כדי לחקור את ההשפעה האנטי-מיקרוביאלית של טיפול פוטודינמי על ביופילם חיידקי במבחנה על ידי חוקרים בתחום הזיהום החיידקי.