מודל ב חוץ גופית כדי לחקור את ההשפעה של טיפול פוטודינמי 5-Aminolevulinic חומצה-מתווכת על Staphylococcus aureus Biofilm
16 באפריל 2018
כתב יד זה מתאר פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעה מיקרוביאלית של 5-aminolevulinic חומצה בתיווך טיפול פוטודינמי (ALA-PDT) על ממבנה biofilm Staphylococcus aureus . פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לפתח מודל במבחנה ללמוד לטיפול biofilms חיידקי עם PDT בעתיד.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להעריך את ההשפעה האנטי-מיקרוביאלית של חומצה חמשת אמינולוולינית או טיפול פוטודינמי בתיווך ALA על ביופילם סטפילוקוקוס זהוב. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביופילם החיידקי כיצד תיקון תאים פוטודינמי עשוי לשמש כטיפול חלופי לשליטה בזיהומי ביופילם. היתרון של הליך זה הוא שיש לו פוטנציאל לשמש עבור חיידקים אחרים עם התאמה מינימלית.
כדי ליצור ביופילם בצלחת של 96 בארות, תחילה יש לחסן אחד מינוס 80 מעלות צלזיוס ThOD Staphylococcus aureus USA שלוש מאות בשלושה ביופילם היוצרים תרביות זן קליניות בצינורות תחתונים עגולים בודדים של 14 מיליליטר המכילים חמישה מיליליטר של מרק סויה טריפטון, או TSB, מדיום, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך הלילה. כאשר התרביות הגיעו לשלב נייח צנטריפוגה את תאי החיידקים ותשעה מחדש את הכדורים וה-PBS לפעמיים פי 10 ליחידת יצירת המושבה התשיעית לריכוז מיליליטר. לדלל את תרחיפי החיידקים הללו ביחס של אחד ל-200 ומדיום TSB בתוספת אפס נקודה חמישה אחוז גלוקוז וזרע 200 מיקרוליטר של תאי חיידקים לבאר לשלוש בארות לכל זן לכל קבוצת ניסוי בתרבית תאי פוליסטירן שטופלה ב-96 בארות מיקרופלייט למשך 24 שעות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, עם חמצן, בלי לרעוד.
למחרת, שטפו בעדינות את הבארות שלוש פעמים עם PBS מבלי להפריע לביופילמים. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של ALA טרי שהוכנו לבארות הניסוי המתאימות, והניחו את הצלחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעה מוגנת מפני אור. לאחר מכן הקרינו את הצלחת עם דיודה פולטת אור בעוצמת אור של 100 מיליוואט לסנטימטר מרובע למשך שעה.
כדי לספור את מספר החיידקים הקיימים לקבוצה בסוף הטיפול בפוטותרפיה, יש לשטוף בעדינות כל באר שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר תאים שאינם נדבקים. לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה כדי לגרד את החיידקים הדבקים מתחתית כל באר. משוך את התאים מכל קבוצה לצינור אפנדורף אחד לכל מצב ניסוי וגלול את התאים על ידי צנטריפוגה.
השעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של 0.25 אחוז אנזים פנקראטין ו-PBS למשך 90 דקות דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן צנטריפוגה נוספת. השעו מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר PBS ובצעו דילול סדרתי אחד עד 10 מכל קבוצה, והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של דגימה מדוללת סדרתית על צלחות אגר סויה טריפטון בודדות. לאחר מכן דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות וספרו את מספר מושבות החיידקים לקבוצה.
להעריך את הביופילמים על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי ליצור ולהקרין את הביופילמים כפי שהודגם. שטפו את הביופילמים המוקרנים ב-PBS וצבעו את התאים החיים והמתים במיליליטר אחד של צבע חדיר לקרום תא פרוקריוטי גרעיני פלואורסצנטי וכרומוזום ומיליליטר אחד של מיקרו-מולרי פרופידיום יודיד, בהתאמה. לאחר 20 דקות הסר את הכתם העודף וצלם את הביופילמים על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי תחת עדשת אובייקט טבילה בשמן 63 פעמים 1.4 NA.
חיוניות חיידקי הביופילם יורדת לאחר טיפול כפול בפוטותרפיה ALA בהשוואה לחיידקי ביופילם בודד או לא מטופל וכל ארבעת הזנים שנבדקו. הדמיה של הביופילמים על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי מאשרת ממצא זה, כאשר רוב התאים החיוביים לעמידת פרופידיום יודיד נצפו בקבוצת הטיפול הכפול בפוטותרפיה ALA. בזמן הניסיון בהליך זה, חשוב לזכור כי יש לבצע את כל המניפולציה של החיידקים המטופלים ב-ALA בחושך, ויש לטפל בחומר הביופילם בעדינות כדי למנוע הפרעה לביופילם שנוצר.
ניתן ליישם מסר זה כדי לחקור את ההשפעה האנטי-מיקרוביאלית של טיפול פוטודינמי על ביופילם חיידקי במבחנה על ידי חוקרים בתחום הזיהום החיידקי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לבדיקת ההשפעה האנטי-מיקרובית של טיפול פוטודינמי המתווך על ידי חומצה 5-אמינולבולינית (ALA-PDT) על ביופילם של Staphylococcus aureus. שיטה זו יכולה לספק מענה לשאלות מפתח בתחום הביופילם החיידקי בנוגע לטיפולים חלופיים לשליטה בזיהומים הנובעים מביופילם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- טיפול פוטודינמי
- מחקר ביופילם
רקע
- Staphylococcus aureus הוא פתוגן נפוץ הקשור לזיהומים של ביופילם.
- תרפיה פוטודינמית (PDT) היא טיפול המשתמש בתרכובות המופעלות על ידי אור כדי להשמיד חיידקים.
- חומצה 5-אמינולבלנית (ALA) היא חומר מוצא בסינתזה של פוטו-סנסטיזטורים המשמשים ב-PDT.
- מחקר זה נועד לפתח מודל in vitro לבדיקת ALA-PDT על ביופילם חיידקי.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעה האנטי-מיקרוביאלית של PDT בתיווך ALA על ביופילמים של Staphylococcus aureus.
- לבחינת הפוטנציאל של PDT כטיפול חלופי לזיהומים בביופילמים.
- לביסוס פרוטוקול שניתן להתאימו למערכי חיידקים אחרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הסממה של Staphylococcus aureus במצע Tryptone Soya Broth (TSB) ליצירת ביופילמים.
- דגירה של תרביתיים בטמפרטורה של 37 °C עד להגעה לשלב הסטציונרי.
- סנטריפוגציה והשעייה מחדש של תאי החיידקים ב-PBS.
- זריעה של תאי החיידקים במיקרו-פלייט בעל 96 בארות לטיפול ב-PDT.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מייצר בהצלחה ביופילמים המתאימים לבדיקת ALA-PDT.
- ALA-PDT הראה השפעות אנטימיקרוביאליות פוטנציאליות נגד ביופילמים של Staphylococcus aureus.
- ניתן להתאים את השיטה לזנים חיידקיים אחרים עם התאמות מינימליות.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי למטב את תנאי הטיפול.
מסקנות
- ALA-PDT היא גישה מבטיחה לטיפול בביופילמים חיידקיים.
- מחקר זה מספק בסיס למחקרים עתידיים בתרפיה פוטודינמית.
- הבנת המנגנונים של PDT עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפול משופרות עבור זיהומים הקשורים לביופילמים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
מודל in vitro זה מאפשר הערכה מכניסטית של טיפול פוטודינמי (PDT) עבור זיהומים הקשורים לביופילם, המהווים אתגר גובר בפיתוח תרופות אנטימיקרוביאליות. באמצעות כימות יחידות יוצרות מושבות (CFU) וויזואליזציה של חיוניות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, הבדיקה מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, במטרה להפחית סיכונים של מועמדים ל-PDT בשלבים מוקדמים של הגילוי. הפלטפורמה תומכת בתיקוף מטרות ובזיהוי מובילים (leads) לאסטרטגיות אנטי-ביופילם, הרלוונטיות במיוחד עבור Staphylococcus aureus ופתוגנים אחרים היוצרים ביופילם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזה טיפולית לגבי יעילות ALA-PDT נגד ביופילמים של S. aureus באמצעות הפחתת CFU וצביעת חיוניות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרה פונקציונלית על ידי קישור הפעלת הפוטו-סנסיטיזטור למנגנוני הגדלה של חיידקים במודל ביופילם מבוקר.
- ערך ניבוי: תומך בהחלטות go/no-go פרה-קליניות על ידי הדגמת השפעות אנטימיקרוביאליות תלויות-מינון ותלויות-זמן תחת תנאים סטנדרטיים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: יוצר ביופילמים בשלים וניתנים לשחזור של S. aureus בפורמט של 96 בארות, המתאים לסריקה של תרכובות PDT בסריקה רב-דגימית (high-throughput).
- פלט כמותי: מספק ספירת CFU ונתוני מיקרוסקופיה קונפוקלית כמדדים אורתוגונליים להערכת יעילות התרכובת וחדירה לביופילם.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ניתנת להתאמה לזני חיידקים אחרים ולממצמי תאורה (photosensitizers) עם התאמות מינימליות לפרוטוקול, מה שמאפשר יישומים רחבים לסריקה של חומרים אנטי-אינפקטיביים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה זיהומי ביופילם של S. aureus בעלי רלוונטיות קלינית, ומגשר בין ממצאים in vitro לתיקוף פרה-קליני של חומרים אנטי-אינפקציוניים מבוססי PDT.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהיר את מנגנון ה-PDT באמצעות צביעת חי/מת, ובכך מפחית עמימות במסלולי השמדת הביופילם.
- המשכיות תרגומית: תומך בהחלטות לגבי קידום הפיתוח על ידי אספקת נתוני עיכוב ביופילם הניתנים לשחזור במספר זנים ובחזרות ניסיוניות מרובות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow Integration)
הבדיקה נכללת ברצף הגילוי האנטי-בקטריאלי, החל מתיקוף המטרה, דרך אופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization) ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות, ובמיוחד עבור שיטות טיפול המכוונות לביופילם.
- ביולוגיה של הגילוי: בוחן השערות מכניסטיות לגבי פירוק ביופילם ואיבוד חיוניות חיידקית המושרים על ידי PDT במודל רלוונטי פיזיולוגית.
- סריקה: מאפשר הערכה סטנדרטית של פוטו-סנסטיזטורים ופרמטרים של מנת אור עבור פעילות אנטי-ביופילם.
- אנליטיקה: מספק מדדי הפחתת CFU ומדדי חיוניות מבוססי פלואורסצנציה להשוואת תנאי טיפול והנחיית קשרים בין מבנה לפעילות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין עיכוב ביופילם in vitro למודלים של יעילות פרה-קלינית באמצעות נקודות סיום כמותיות וניתנות לשחזור.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת PDT מודולרית לביופילם, שניתן להשמיג אותה על פני מספר יעדי פתוגנים וכימוטיפים של פוטו-סנסטיזטורים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באינטראקציות בין PDT לביופילם באמצעות ויזואליזציה ישירה וכימות של הרג חיידקים.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה סטנדרטית, מוגנת מאור, עם שלבי דגירה, הקרנה וקריאה מוגדרים להבטחת הדירות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות go/no-go לגבי מועמדים ל-PDT על ידי אספקת נתוני יעילות מוקדמים במודל ביופילם רלוונטי קלינית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תוכניות PDT מותאם סיכון על ידי זיהוי תרכובים בעלי חדירה מוכחת לביופילם ופעילות אנטימיקרוביאלית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות מיקרוביולוגיות, תרביות ביופילם ופרוטוקולים לבטיחות פוטוביולוגית.
- תלוי בציוד לחשיפה מבוקרת לאור (למשל, מד קרינת LED) ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית או קורא לוחות לקריאת CFU והדמיה.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת ALA, תזמון האינקובציה ואספקת האור בין הקבוצות הניסיוניות להבטחת הדירות (reproducibility).
- התאמה לזנים חיידקיים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי היווצרות הביופילם ויעילות ספיגת הפוטו-סנסיטייזר.
- מגבלה מעשית: הרגישות של הביופילם עשויה להשתנות בהתאם לשלב הצמיחה ולהרכב המטריקס, דבר המחייב בקרות קפדניות למחקרים השוואתיים.
