Name: צמח-חיידק האינטראקציה: תעתיק בתגובה של Bacillus Mycoides תפוחי אדמה שחורה Exudates (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: חקור את תגובת התעתיק של Bacillus mycoides לחומרי הפרשת שורשי תפוחי אדמה. שיטה זו מאפשרת זיהוי גנים בקטריאליים חשובים באינטראקציות צמח-חיידק וניתנת להתאמה למחקרים נוספים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים יעקב הרבה על הערות מועילות והצעות שלו. אנו מודים גם אן דה יונג לעזרתו בניתוח ביואינפורמטיקה. Yanglei יי ו- Zhibo Li נתמכים על ידי מועצת מלגות סין (CSC). אנו מודים Back2Roots תכנית בתחרות-TTW Perspectief (TKI-AF-15510) לתמיכה הפיננסית שלהם OPK.

1. הנבטת תפוחי אדמה בתנאים מעוקר
<ol><li>יש לשטוף את פני השטח של תפוחי אדמה עם מים סטריליים. לטבול את תפוחי האדמה ב-70% אתנול, ולאחר מכן ב 3% נתרן תת-כלורי, למשך 5 דקות. לשטוף את זה שוב עם מים סטריליים כדי להסיר כל נתרן הנותרים תת-כלורי.</li>
	<li>להכין את החומרים הדרושים הנבטת וגדל פקעות תפוחי אדמה; לחטא את הסירים פלסטיק, engraftment סלים, ורמיקוליט, ומים על ידי autoclaving אותם ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הערה: ודא כל החומרים המשמשים autoclavable. אחרת, השתמש בשיטות אחרות לחיטוי.</li>
	<li>מכניסים את תפוחי האדמה לעקר השטח הסל engraftment, המקום הזה סיר בלוק המכיל ורמיקוליט רטוב.</li>
	<li>לשמור את הסיר בתוך תא האקלים ב 24 מעלות צלזיוס במשך שלושה שבועות. להגדיר אותו על מחזורים של 16 שעות של אור (120 µmol ז-2s-1) ו- 8 שעות החושך. כדי להימנע מציג מיקרוביאלי, להשתמש בתיבת סיבי זכוכית גדול כדי לכסות את הסיר.</li>
</ol>2. איסוף תפוחי אדמה שחורה Exudates
<ol><li>כאשר נצרי נבט, העברת הסל עם תפוחי אדמה שלם לתוך גביע סטיריליים מלא 150 מ ל מים יונים בלוק, עם תפוחי אדמה פקעות ממוקמים מעל פני המים ואת השורשים שקוע במים (ראה איור 1). לשמור שתיל בתא האקלים, להשתמש באותן הגדרות כמו קודם [24 ° C; מחזורי h 16 אור (120 µmol ז-2s-1), 8 שעות החושך].</li>
	<li>ביום השני על, איסוף של מים המכילים את exudates, למלא את. הספל עם מים יונים סטרילי. לבצע הדגימה כל יום עד יום השביעי לאחר העברת שתיל.</li>
	<li>לאחסן כל מדגם בנפרד ב 4 º C. עבור כל דגימה, להפיץ µL 100-לוריא-Bertani (ליברות; 1% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 0.5% NaCl) צלחת אגר כדי לבדוק אם מציג מיקרוביאלי. למחוק את הדגימות מזוהמים.</li>
	<li>לשלב את הדגימות שנאספו של שתיל אחד, לרכז אותם על ידי ליופיליזציה אותם ב-40 ° C עד נפח סופי של 150 מ.</li>
</ol>3. גידול חיידקים
<ol><li>פסים זן mycoides דרב מ-80 מעלות צלזיוס גליצרול מניה על גבי צלחת אגר ליברות, דגירה את הצלחת ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>לחסן בינוני נוזלי ליברות עם מושבה בודדת מהצלחת ולהגדיל את התרבות ב חממה חזק ב rpm 200 בן לילה ב 30 º C.</li>
</ol>4. טיפול ודגימה של חיידקים
<ol><li>כדי להשוות בין עקומת גידול של חיידקים שטופלו exudates שורש לפקד שלילי, מכינים סדרת מבחנות המכילות 50 מ של המדיום הנוזלי ליברות. להוסיף 0.5 מ"ל של התרבות חיידקי לילה כל צלוחיות, ולהוסיף או 0%, 5%, 10%, 15% (v/v) שורש תפליט או במים סטריליים יונים המדיום, בהתאמה.</li>
	<li>להשתמש תרבות עם מים יונים במקום exudates שורש פקד. מודדים את צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) כל h 1 לאחר מכן. יוצרות עקומת גדילה ידי הערכים600 OD נגד הזמן. הערה: ראינו כי 10% exudates הבסיס לא השפיע על צמיחת mycoides דרב (ראה איור 2); יחס זה שימש לניסויים RNA-seq.</li>
	<li>לדלל תרבות mycoides דרב לילה עם 90 מיליליטר מראש ומחוממת LB בינוניים עד ה OD הראשונית600 של ~ 0.05 בבקבוקון 300 מ ל. להוסיף 10 מ של exudates הבסיס לתרבות, דגירה זה ב 30 ° C עבור 1 h.</li>
	<li>להשתמש טיפול במים סטריליים יונים 10 מ"ל פקד. איסוף תאים מתרבות על ידי צנטריפוגה ב g x 9,000 למשך 2 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, מיד להקפיא בגדר של חנקן נוזלי ואז לאחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
</ol>5. RNA בידוד
הערה: לפני שמתחילים את הבידוד, להכין עבודה, שעליו מונחים, ארונות תקשורת, פיפטות על-ידי ניקוי אותם עם פתרון טיהור RNase (ראה טבלה של חומרים). ללבוש כפפות בכל עת, ודא כי כל צינורות, עצות ופתרונות הם נטולי RNase. תמיד לשמור את הדוגמאות על קרח במידת האפשר.
<ol><li>להוסיף מים הנדסה גנטית (100 µL של DEPC לכל פתרון 100 מ ל) מ- 0.1% (v/v) diethyl pyrocarbonate (DEPC), מערבבים אותו היטב, ולשמור אותו בטמפרטורת החדר למשך הלילה. אוטוקלב התערובת כדי להשבית את DEPC לאחר טיפול לילה. שימוש זה שטופלו DEPC מים הנדסה גנטית כדי להכין המאגר טה [10 מ מ טריס-HCl (pH = 8); 1 מ"מ EDTA] ו 10% הפתרון מרחביות (w/v).</li>
	<li>להפשיר את כדורי תא על הקרח, להשעות את כל µL 400 מאגר TE (DEPC). להעביר את המתלים לתוך צינורות פקקי בורג 2 מ"ל.</li>
	<li>Premix µL 300 באלכוהול כלורופורם-isoamyl (24:1 v/v) ו- 300 µL של פנול (חומצה פנול, כיתה ה-RNA), ולאפשר את התערובת לעמוד במשך 5 דקות. קח µL 500 השלב העליון אורגני כדי להוסיף התאים resuspended. לאחר מכן להוסיף 50 µL למען חברה דמוקרטית 10% וכ -0.5 גר' חרוזי זכוכית (0.5 מיקרומטר) לתוך הצינור.</li>
	<li>לסגור את הפקק בחוזקה ולמקם את הצינורית מהמגן חרוז-מיל (ראה טבלה של חומרים). ביצוע של s 3 × 45 הדופק המגון עם מרווח 1 דקות על קרח.</li>
	<li>Centrifuge את הדגימות 10 דקות ב 11,000 x g (4 ° C), ולהעביר את השלב העליון צינור חדש.</li>
	<li>להוסיף 500 µL באלכוהול כלורופורם-isoamyl (24:1) השלב העליון מ שלב 5.5, centrifuge את התערובת למשך 5 דקות ב x 11,000 g (4 ° C). הערה: השלבים הבאים ששונו של הוראת היצרן מסחרי זכוכית סיבים מבוסס מסנן ה-RNA בידוד קיט (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>µL 500 השלב העליון להעביר צינור טריים, להוסיף 2 כרכים (1 מ"ל) של מאגר פירוק/איגוד ולערבב אותו על-ידי pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>לשלב את הצינורות מסנן ואוסף (מתוך ערכת בידוד ה-RNA), pipette את התערובת מהשלב 5.7 הצינור מסנן. Centrifuge צינורות 15 s ב- 8,000-g ולהשליך הזרימה דרך.</li>
	<li>להכין 1.5 mL microcentrifuge צינורות עם µL 100 DNase מאגר, 10 µL של DNase ואני µL 5 של מעכב RNase (ראה טבלה של חומרים). הוסף את התמהיל פתרון מוכן מסנן של הצינור מסנן, דגירה זה למשך 20-30 דקות ב- 15-25 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בצע את השלבים כביסה לפי הוראות היצרן. השתמש µL 50 של מאגר • תנאי כדי elute את הרנ א.</li>
	<li>להציל את הרנ א eluted ב-80 מעלות צלזיוס, לשים סרט פרפין פלסטיק מסביבו. במקביל, להעביר כמה microliters של המדגם צינור microcentrifuge 1.5 mL לבצע בדיקת איכות '.</li>
</ol>6. בדיקת האיכות RNA ורצף
<ol><li>בררו את הרנ א ספקטרופוטומטרים microvolume. הערה: ספיגת יחס-260/280 צריך להיות מעל 1.8, יחסי-260/230 צריך להיות מעל 1.8 לפחות, רצוי מעל 2.0.</li>
	<li>הפעל הרנ א מטוהרים בכלי נגינה אלקטרופורזה אוטומטית באמצעות הניתוח RNA להמליץ קיט (ראה טבלה של חומרים); המספר שלמות RNA (RIN) חייב להיות לפחות מעל 7 כדי להמשיך.</li>
	<li>שימוש בסכום כולל של µg 3 של RNA לדגימה ליצירת ספריות עם הכנה ספריה RNA-Seq קיט (ראה טבלה של חומרים) בעקבות ההמלצות של היצרן. הערה: ההכנות הספרייה היו וסודרו על פלטפורמה רצף תפוקה גבוהה, קריאות לזווג-end נוצרו.</li>
</ol>7. נתוני ניתוח באמצעות צינור מבוסס-אינטרנט של T-REx
<ol><li>ביצוע איכות סינון באמצעות FASTX-ערכת הכלים גירסה 0.0.13 (Phred איכות עשרות > 20). חתוך את קריאות RNA-Seq raw של הרצפים מתאם עם הכלי Trimmomatic. הערה: כל הבדיקות במורד הזרם התבססו על נתונים נקי עם איכות גבוהה.</li>
	<li>הורדת הנתונים הגנום של בקרת האוויר 6462 NCBI mycoides דרב (ההצטרפות NCBI מס: CP009692.1) ולהשתמש בו בתור גנום הפניה למיפוי את קריאות נקי באמצעות Bowtie2/2.2.3.</li>
	<li>שימוש v0.6.1 HTSeq לספור את המספרים קריאות למפות כל הגן, הקריאות לכל kilobase של התעתיק לפי קריאות ממופה מיליון (RPKM) של כל הגנים המבוססת על האורך של הרוזן ג'ין וקורא שמופו אל הגן הזה.</li>
	<li>לניתוח של הנתונים על-ידי הצבר. טי-רקס, היעזר בטבלה RPKM קלט, וכן שלושה קבצים תיאורי: (i) קובץ גורמים כדי לתאר את הניסוי גורמים, (ii) קובץ ניגודים להגדיר אילו גורמים יושוו על ביטוי גנים דיפרנציאלית , וכן (iii) קובץ בכיתה לתיאור קבוצות של גנים של עניין. הערה: קבצי תיאורית נמצאים בתבנית in.txt. דוגמאות ניתן למצוא באתר האינטרנט של טי-רקס (http://genome2d.molgenrug.nl/). הוראה מפורטת לניתוח נתונים באמצעות T-REx ניתן למצוא בפרסום הקודם על ידי דה יונג. et al. 14.</li>
</ol>

<ol><li>Haichar, F. eZ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+host+habitat+and+root+exudates+shape+soil+bacterial+community+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%3A+Multidisciplinary+Journal+of+Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure.</a> The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).</li>
<li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of root exudates.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li>
<li>Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4395/6/1/19">Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation.</a> Agronomy Journal. 6 (1), 19(2016).</li>
<li>Mark, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+bacterial+responses+to+root+exudates+identifies+genes+involved+in+microbe-plant+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).</li>
<li>Fan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiling+of+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+in+response+to+maize+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 116(2012).</li>
<li>Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003807170100102X">Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization.</a> Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).</li>
<li>Lambert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clover+root+exudate+produces+male-biased+sex+ratios+and+accelerates+male+metamorphic+timing+in+wood+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs.</a> Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).</li>
<li>Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.4141/CJSS08021">Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa).</a> Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).</li>
<li>Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0929139396001266">Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability.</a> Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).</li>
<li>Rovira, A. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02859887">Plant root exudates.</a> Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).</li>
<li>Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0885576503904437">Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).</li>
<li>Peng, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s41348-017-0110-z">Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides.</a> Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).</li>
<li>Ambrosini, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/aab.12245/abstract">Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser.</a> Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).</li>
<li>de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REx%3A+transcriptome+analysis+webserver+for+RNA-seq+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data.</a> BMC Genomics. 16 (1), 663(2015).</li>
<li>Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptomics+of+Bacillus+mycoides+strains+in+response+to+potato-root+exudates+reveals+different+genetic+adaptation+of+endophytic+and+soil+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1487(2017).</li>
<li>Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNASwift%3A+a+rapid%2C+versatile+RNA+extraction+method+free+from+phenol+and+chloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform.</a> Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).</li>
<li>Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-samtools%3A+Ruby+bindings+for+SAMtools%2C+a+library+for+accessing+BAM+files+containing+high-throughput+sequence+alignments%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+for+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments.</a> Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6(2012).</li>
<li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+the+Swiss-army+tool+for+genome+feature+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).</li>
<li>Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGS-trex%3A+next+generation+sequencing+transcriptome+profile+explorer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer.</a> BMC Bioinformatics. 14 (7), S10(2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

אינטראקציות צמח-חיידק יש כבר שיערו להיקבע על-ידי שיווי משקל משומנת בין חיידקים וצמחים. אינטראקציות כאלה הם מורכבים מאוד, קשה ללמוד במערכת טבעית, אשר כוללת מגוון מינים מיקרוביאלי, כגורם העלול קונסורציומים. מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוטה ללמוד את חיידקי בתגובה שורש exudates בתנאים מבוקרים היטב. הפרופיל transcriptome של rhizobacteria, בתגובה לחשיפה שורש exudates, מספק מידע מפורט על חיידקי ההסתגלות הגומחה rhizosphere. פרוטוקול אוסף זה שורש exudates אינו מצריך פרוצדורות מסובכות, ציוד מיוחד. אולם, כל הפרוצדורות צריך להתבצע בתנאים...

צמחים מאי תפליט עד 20% של פחמן קבוע בעת ההטמעה דרך השורשים של rhizosphere1, כלומר, אזור צר של אדמה בקרבת השורשים. בשל הזמינות מזין גבוה, rhizosphere הוא גידול מתאימים עבור מיקרואורגניזמים מגוונים, כולל צמחים-צמיחה קידום חיידקים. Exudates שורש להכיל מגוון של חומרים אורגניים נדיפים כמו יונים, חומצות אנאורגניות, חמצן ומים. עם זאת, הרוב המכריע של exudates הבסיס נוצר על ידי חומרים אורגניים, אשר ניתן לחלק תרכובות משקל מולקולרי נמוך, משקל מולקולרי גבוה תרכובות. תרכובות משקל מולקולרי נמוך כולל חומצות אמינו, חומצות אורגניות, סוכרים, תרכובות בעל תאים פנוליים, חומצות שומן, ושורה של מטבוליטים משניים. תרכובות משקל מולקולרי גבוה מורכב2,mucilage, חלבונים3. Rhizosphere מיקרואורגניזמים יכולים להשתמש בחלק תרכובות אלו כמקור אנרגיה לצמיחה ופיתוח. Exudates שורש תפקיד חשוב בעיצוב הקהילה rhizobacterial מאז המיוצר במפעל תרכובות של exudates יכולים להשפיע על ההתנהגות של חיידקים rhizosphere-הקשורים על ידי המשפיעים על הביטוי של גנים ספציפיים.
הבנת התגובה חיידקי השורש exudates היא צעד המפתח בפענוח מנגנוני אינטראקציה צמח-חיידק. כמו התגובה חיידקי אינטראקציות צמח-חיידק הוא התוצר של ביטוי גנים דיפרנציאלית, זה ניתן יהיה ללמוד על ידי ניתוח transcriptome. באמצעות שיטה זו, מחקרים קודמים זיהו מספר חשוב גנים המעורבים באינטראקציה צמח-חיידק. ב- Pseudomonas aeruginosa, גנים המעורבים חילוף החומרים, כימוטקסיס וסוג II הפרשת הוצגו להגיב exudates שורש סלק סוכר4. מאוורר ואח. 5 חקר את פרופיל transcriptomic של amyloliquefaciens נולד ב- FZB42 בתגובה exudates שורש תירס. התוצאות שלהם מראים כי של גנים חריפה הנגרמת על ידי exudates השורש, מספר קבוצות מעורבים מסלולים מטבוליים הנוגעים ניצול מזין, כימוטקסיס, תנועתיות ו- 30s ריבוזומלי סינתזה של פפטידים מיקרוביאלית ו- polyketides.
הדיוק של מחקרים אלה מסתמך על האוסף של השורש exudates. למרות מספר שיטות תיארו את האוסף של שורש exudates למטרות שונות, הם דורשים מכשירים מתוחכמים או לא יבוצעו ב תנאים מבוקרים היטב-6,-7,-8. יתר על כן, עיכוב rhizosphere מיקרואורגניזמים יכולים להשפיע על שורש תפליט הרכב על ידי המשפיעים על חדירות קרום התא צמח ופגיעה ברקמות שורש, במיוחד במקרה של קונסורציומים של מיקרואורגניזמים9. כאשר חוקרים התגובה מיקרוביאלי שורש exudates, חשוב להשתמש בתנאים מוגדרים היטב על מנת למנוע שינוי של תרכובות על-ידי מיקרואורגניזמים10. יתר על כן, ה-RNA באיכות גבוהה נדרש עבור ה-RNA-seq המבוסס על מחקרים transcriptome. עם זאת, בעת התמודדות עם זנים שאינם-מודל-בקטריאלי, פרוטוקולים סטנדרטיים או קיטים מסחריים יש בדרך כלל של יעילות נמוכה עקב גורמים לא ידועים או מאפייני צמיחה מיוחד.
הפרוטוקול המתואר כאן אומתה באמצעות mycoides דרב, אשר הוא חיידק גראם חיובי, יוצרי ספורה של שלקרוא Firmicute. . זה נמצא בכל מקום, rhizosphere של מיני צמחים שונים. גידול צמח מספר מאפיינים קידום דווחו על מין זה, לרבות אינדוקציה ההתנגדות שיטתית (ISR) סלק סוכר11, עיכוב של המתלים-off המחלה Pythium מלפפון12, כמו גם חנקן קיבוע חמניות rhizosphere13. עם זאת, המנגנון המולקולרי של ביחסיו עם צמח המארח לא טוב נלמדים.
המטרה של הניסויים המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere דרב mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. בקיצור, הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: ראשית, לאסוף תפוחי אדמה exudates שורש בתנאים סטריליים. לאחר מכן, לחלץ RNA באיכות גבוהה מתאים חיידקיים שטופלו exudates השורש. השלב הסופי הוא ניתוח נתונים תוך שימוש באינטרנט T-REx צינור14. פרוטוקול זה שימש לזיהוי גנים mycoides דרב הצג את משמרת ברמות הביטוי בעת מגע עם שורש-exudates, ובכך עלול לשחק תפקיד חשוב ב אינטראקציות צמח-חיידק.

<table><tbody><tr><td>נתרן היפוכלוריט</td><td>סיגמא</td><td>&nbsp; CAS: 7681-52-9&nbsp;</td><td>10-15%&nbsp; כלור פעיל</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) מרק</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubater</td><td>ניו ברונסוויק Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Genesys 20</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית חנקן</td><td></td><td></td><td></td>נוזלי</tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G8893</td><td>0.5 &micro; </td></tr><tr><td>צינור m 2.0 מ"ל עם מכסה</td><td></td><td></td> בורג <td>ללא RNase</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל ו-2.0 מ"ל צינור</td><td></td><td></td> אפנדורף <td>ללא RNase</td></tr><tr><td>הומוגנייזר טחנת חרוזים</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Mini_beadbeater Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט (DEPC)</td> <td>סיגמה</td><td>CAS: 1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>סיגמא</td><td>CAS: 151-21-3&nbsp;</td><td>תמיסה של 10% שהוכנה עם מי MQ שטופלו על ידי DEPC</td></tr><tr><td>בופר</td><td></td><td></td> TE <td>10 מ"מ Tris-HCl; 1 מ"מ EDTA, pH = 8</td></tr><tr><td>פנול</td><td>סיגמא</td><td></td> אלכוהול כלורופורם-איזואמיל <td>בדרגת RNA</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>הכן 24:1 של כלורופורם: אלכוהול איזואמיל, אחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>ערכת בידוד RNA טהורה גבוהה</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>RNase Decure Solution</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNase-Zap</td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורזה אוטומטי</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Bioanalyzer</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח</td><td>Thermo Fisher Scientific</td>ערכת ניתוח איכות <td>RNA Nanodrop ND-1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ערכת ננו RNA 6000 Agilent&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>RiboLock</td><td></td></tr><tr><td>ספריית RNA כיוונית ערכת הכנה</td><td>NEB</td><td>Ultra</td><td>עבור Illumina</td></tr></tbody></table>

צמח-חיידק האינטראקציה: תעתיק בתגובה של bacillus mycoides תפוחי אדמה שחורה exudates

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

הבקטריה צמח-הקשורים לשחק תפקיד חשוב בקידום הצמיחה ולמניעת מחלות בצמחים. היישום של הצמח הצמיחה וקידום rhizobacteria (PGPR) כסוכני biofertilizers או משולבת הפך חלופה יעילה לשימוש בדשנים קונבנציונלי ו יכולים להגביר את הפרודוקטיביות חיתוך במחיר נמוך. אינטראקציות צמח-חיידק תלויים אותות מופרש הצמח הפונדקאי ואת תגובת לכאן בזמן שנסעתי על ידי חיידקים הקשורים שלהם. עם זאת, המנגנון המולקולרי של חיידקים מועילים כיצד להגיב שלהם הקשורים הצמחי אותות אינם מובנים במלואם. הערכת התגובה transcriptomic של חיידקים השורש exudates היא גישה רב-עוצמה כדי לקבוע את ביטוי גנים חיידקיים ורגולציה בתנאים rhizospheric. ידע כזה יש צורך להבין את המנגנונים שבבסיס מעורב אינטראקציות צמח-חיידק. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ללמוד את התגובה transcriptomic של mycoides נולד ב- EC18, זן מבודד את endosphere תפוחי אדמה, כדי exudates שורש תפוח אדמה. בעזרת הטכנולוגיה תפוקה גבוהה רצף האחרונות, פרוטוקול זה יכול להתבצע תוך מספר שבועות, התוצרת datasets מסיבית. ראשית, אנו אוספים את exudates שורש בתנאים סטריליים, לאחר מכן הם מתווספים mycoides דרב תרבויות. הרנ א מהתרביות האלה היא מבודדת באמצעות שיטה פנול/כלורופורם בשילוב עם ערכת מסחרי ונחשפו בקרת איכות על ידי כלי נגינה אוטומטיות אלקטרופורזה. לאחר רצף, ניתוח נתונים מתבצע באמצעות הצינור T-REx מבוססת-אינטרנט, קבוצה של גנים ביטוי באופן שונה מזוהה. שיטה זו היא כלי שימושי כדי להקל על תגליות חדשות על גנים חיידקיים מעורב אינטראקציות צמח-חיידק.

צמח-הקשורים מיקרואורגניזמים יכולים להשפיע באופן חיובי על צימוח ובריאות. עם זאת, המנגנון של אינטראקציות מורכבות בין צמחים שלהם אנחנו חיים איתם בסמביוזה חיידקים הם אינה מובנת במלואה. שורש exudates יש תפקיד חשוב בוויסות פעילות rhizobacterial של התנהגות, זה בדרך כלל הוא שמהווה הקולוניזציה מיקרוביאלית של שורשים יוזם עם האטרקציה של חיידקים כדי exudates השורש. מטרת עבודה זו היה לחקור את התגובה transcriptomic של rhizobacterial דרב mycoides כדי exudates שורש תפוח אדמה. כדי ליישם את זה, פק...

המטרה של פרוטוקול המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere Bacillus mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. שיטה זו מקלה על הזיהוי של גנים חיידקיים חשוב מעורב אינטראקציות צמח-חיידק, באופן עקרוני החלים endophytes וצמחים אחרים, עם התאמות קלות.

צמח-חיידק האינטראקציה: תעתיק בתגובה של Bacillus Mycoides תפוחי אדמה שחורה Exudates

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחומי האינטראקציה בין צמח למיקרוב. אתם יכולים, למשל, לזהות גנים חשובים מזני חיידקים שבודדו מהאנדוספרה או הריזוספרה במהלך האינטראקציה של החיידקים עם הצמח. זוהי שיטה רב-תכליתית שיכולה לשמש גם למחקרים על חיידקים אחרים עם צמחים.היתרון העיקרי של השיטה הזו הוא שבתקופה קצרה יחסית ניתן לזהות מספר גדול של גנים של חיידקים שחשובים במהלך אינטראקציות בין צמח למיקרוב. כדי להתחיל בהליך זה, יש לשטוף את פני תפוחי האדמה במים סטריליים. רחצו את תפוח האדמה ב-70% אתנול למשך חמש דקות ולאחר מכן ב-3% נתרן היפוכלוריט למשך חמש דקות נוספות.לאחר מכן, שטפו אותו שוב במים סטריליים כדי להסיר את שאריות הנתרן היפוכלוריט. לאחר מכן, הכינו את החומרים הדרושים להנבטה וגידול פקעות תפוחי אדמה. עקרו את סירי הפלסטיק, סלי החריטה, הוורמיקוליט והמים על ידי חיטוי שלהם ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.לאחר מכן, הכניסו את תפוח האדמה המעוקר לסל החריטה והניחו אותו בסיר חיטוי המכיל ורמיקוליט רטוב. השתמש בקופסת סיבי זכוכית גדולה כדי לכסות את הסיר כדי למנוע זיהומים מיקרוביאליים. שמור את הסיר בתא אקלים בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס למשך שלושה שבועות, והניח אותו על מחזורים של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך.כדי לאסוף את הפרשות שורש תפוחי האדמה, כאשר הקלעים נובטים, העבירו את הסל עם כל תפוח האדמה לכוס מעוקרת מלאה ב -150 מיליליטר מים נטולי יונים עם פקעות תפוחי אדמה המונחות ממש מעל פני המים והשורשים שקועים במים. שמור את השתיל בתא האקלים, והשתמש באותן הגדרות כמו קודם. מהיום השני ואילך, אספו את המים המכילים את ההפרשות, ומלאו את הכוס במים סטריליים נטולי יונים.לאחר מכן אחסן כל דגימה בנפרד בארבע מעלות צלזיוס. עבור כל דגימה, מורחים 100 מיקרוליטר על צלחת אגר לוריא-ברטאני כדי לבדוק אם יש זיהומים מיקרוביאליים. השלך את הדגימות המזוהמות.שלב את הדגימות שנאספו של שתיל אחד. לאחר מכן העבירו את הפרשות השורש המשולבות לצינורות של 50 מיליליטר. הקפיאו את הצינורות המכילים הפרשות שורש במינוס 80 מעלות צלזיוס.רכזו אותם בהקפאה וייבושם במינוס 40 מעלות צלזיוס לנפח סופי של 150 מיליליטר. כדי לגדל את החיידקים, פס זן B.mycoides ממלאי גליצרול מינוס 80 מעלות צלזיוס על צלחת אגר LB, ודגירה על הצלחת ב-30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן יש לחסן את המדיום הנוזלי LB במושבה אחת מהצלחת, ולגדל את התרבית באינקובטור רועד ב-200 סל"ד למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס.כדי לטפל ולדגום את החיידקים, יש לדלל תרבית B.mycoides למשך הלילה עם 90 מיליליטר של מדיום LB שחומם מראש ל-OD600 הראשוני של אפס נקודה אפס חמש בבקבוק של 300 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של הפרשות שורש לתרבות, והשתמש בטיפול במים סטריליים ונטולי יונים של 10 מיליליטר כבקרה. לאחר מכן דגרו אותם בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה.לאחר שעה, העבירו את התרבות לצינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר. אוספים את התאים מהתרבית על ידי צנטריפוגה ב 9, 000 פעמים G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והקפיאו מיד את הגלולה בחנקן נוזלי.לאחר מכן אחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי לבודד RNA, הפשירו את כדורי התא על קרח, ותלו כל אחד מהם ב-400 מיקרוליטר של מאגר TE. לאחר מכן העבירו את המתלים לשני צינורות מכסה הבורג של מיליליטר.הוסף אפס נקודה חמישה גרם חרוזי זכוכית לשפופרת. לאחר מכן סגרו היטב את הכובעים והניחו את הצינורות בהומוגנייזר של טחנת חרוזים. בצע הומוגניזציה של דופק של 45 שניות שלוש פעמים, עם מרווח של דקה על הקרח.לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות למשך 10 דקות ב-11,000 פעמים G, והעבירו את השלב העליון של כל דגימה לצינור חדש. הוסף 500 מיקרוליטר של כלורופורם: אלכוהול איזואמיל לשלב העליון, וצנטריפוגה את התערובת למשך חמש דקות ב 11, 000 פעמים G. לאחר מכן העבירו 500 מיקרוליטר מהשלב העליון לצינור טרי. הוסף מיליליטר אחד של מאגר קשירת הליזיס, וערבב אותו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.לאחר מכן, הכינו נקודה אחת של חמישה צינורות מיקרו-צנטריפוגה של מיליליטר עם 100 מיקרוליטר של מאגר DNase, 10 מיקרוליטר של DNase I וחמישה מיקרוליטר של מעכב RNase. מוסיפים את תערובת התמיסה המוכנה על המסנן של צינורות המסנן, ומדגרים אותם למשך 20 עד 30 דקות בחום של 15 עד 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בצע את שלבי הכביסה על פי הוראות היצרן, והוסף 50 מיקרוליטר של מאגר חמקמק לצינור.לאחר צנטריפוגה, יש להוציא את ה-RNA. העבירו כמה מיקרוליטרים מהדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה של נקודה וחמישה מיליליטר כדי לבצע בדיקת איכות. לבסוף, מכסים את ה-RNA החמקמק בסרט פרפין מפלסטיק ושומרים אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.לאחר האיסוף, הפרשות השורש נוספו לתרבית B.mycoides ביחס של 10%, וה-RNA הכולל של החיידקים בודד. לאחר מכן ה-RNA עבר בדיקת איכות על ידי מכשיר אלקטרופורזה אוטומטי. גרפים אלה מייצגים את ה-RNA המבודד מ-B.mycoides שטופלו בהפרשות השורש, וגרפים אלה מייצגים את ה-RNA שבודד מקבוצת הביקורת.כל הדגימות קיבלו ערך RIN מעל תשע, עם שתי רצועות ברורות המתאימות ליחידות המשנה של RNA 16S ו-23S, מה שמדגים כי RNA איכותי הושג על ידי פרוטוקול זה. לאחר הכנת הספרייה, הושגו קריאות קצה זוגיות עם פלטפורמת ריצוף בתפוקה גבוהה. קריאות ה-RNA-seq הגולמיות נחתכו מרצפי המתאמים, ומופו כנגד רצף גנום הייחוס.ניתוח בית התעתיק בוצע עם צינור T-REx, ותרשים עוצמת היחס של כל הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי מוצג כאן. לאחר זיהוי הגן החשוב הפוטנציאלי, ניתן לבצע שיטות אחרות in vivo כמו היתוך GFP מקדם, cue-pews-air והכלאה פלואורסצנטית באתרה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו זמן ביטוי שמור של גנים מסוימים במהלך האינטראקציה עם הצמח המארח.

plant-microbe-interaction-transcriptional-response-bacillus-mycoides

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Yi, Y., et al. אינטראקציה בין צמח למיקרוב: תגובת שעתוק של Bacillus Mycoides להפרשות שורש תפוחי אדמה. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את ההכנה והטיפול בתרביות Bacillus mycoides כדי לחקור אינטראקציות בין צמח לחיידקים. הוא מתאר את השלבים מפסים של תרבית מלאי ודגירה שלה במדיום נוזלי ועד לחשיפת החיידקים להפרשות שורש צמחים תחת תסיסה. התהליך מגיע לשיאו בקציר והקפאת בזק של תאי החיידקים לניתוח עוקב של שינויים בביטוי הגנים הנגרמים על ידי ההפרשות.

טיפול בחיידקים עם הפרשות שורש צמחים לחיקוי אינטראקציות בין צמח לחיידקים במבחנה

אגרואינפיציה ו- PVX agroinfection הם מבחנים תפקודיים שגרתיים לביטוי חוץ רחמי חולף של גנים בצמחים. שיטות אלה הן מבחנים יעילים באסטרטגיות אפקטאורומיות (התנגדות מהירה ותגלית גנים ארסית) וחיוניות למחקר מודרני בפתולוגיה של צמחים מולקולריים. הם עונים על הביקוש לניתוח תפקודי חזק בעל תפוקה גבוהה בצמחים.

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

מערכת cocultivation הידרופוני שתואר תומך צמחים שלם עם מסכי רשת מתכת cocultivates אותם עם חיידקים. רקמות הצמח, חיידקים, ומולקולות מופרדים אז ניתן לקצור בנפרד עבור ניתוחים במורד הזרם, בו זמנית מאפשר תגובות מולקולריות של שני המארחים צמח אינטראקציה חיידקים או microbiomes להיחקר.

הידרופוני Co- טיפוח מערכת לניתוח סימולטני ושיטתי של הצמח / מיקרובי אינטראקציות מולקולרית איתות

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים להפוך את תפוחי האדמה צמחים. הטרנספורמציה Agrobacterium tumefaciens מוביל צמח מהונדס מלאה בעוד Agrobacterium rhizogenes מייצרת הטרנסגניים שורשים שעירים יורה פראי סוג זה יכול להיות עצמי שעבר בירושה. אנחנו מכן לזהות יזם פעילות על-ידי גאס צביעת שורשים טרנספורמציה.

Agrobacterium tumefaciens , Agrobacterium rhizogenes-מתווכת טרנספורמציה של תפוחי אדמה, יזם פעילות של גן Suberin על ידי גאס Staining

השיטה המוצגת יוצרת הרביוור טבעי הנזק רקמת הצמח באמצעות היישום של מנדוקה הזחלים סקסטה להתנתק עלים של תפוחי אדמה. רקמת הצמח הוא הבעה ביטוי של שישה שעתוק גורם הומויומני מעורב בתגובות מוקדמות לחרקים העשב.

מנותקת עלה assays לפשט גנים ביטוי לימודי תפוחי אדמה במהלך התפשטות על ידי לעיסת חרק manduca סקסטה

אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור וירוס תפוחי אדמה X (PVX)מבוסס microRNA השתקת מערכת (VbMS) כדי לאפיין פונקציונלית microRNAs אנדוגני (miRNAs) בתפוח אדמה. מולקולות חיקוי מטרה (TM) של miRNA של עניין משולבות בווקטור PVX ומתבטאות באופן חולף בתפוח אדמה כדי להשתיק את משפחת ה- miRNA או miRNA היעד.

וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.

פרוטוקול זה מציג סיכום מפורט של אסטרטגיות לחיסון שורשי צמחים עם מיקרובים הנישאים באדמה. דוגמאות לפטריות Verticillium longisporum ו-Verticillium dahliae, מתוארות שלוש מערכות שונות של זיהום שורשים. יישומים פוטנציאליים וניתוחים אפשריים במורד הזרם מודגשים, ויתרונות או חסרונות נדונים עבור כל מערכת.

אסטרטגיות חיסון להדבקת שורשי צמחים במיקרואורגניזמים הנישאים בקרקע

בשל האטימות של האדמה, לא ניתן לדמיין בקלות אינטראקציות בין המיקרובים המרכיבים אותה עם רזולוציה תאית. כאן מוצגים שני כלים מיקרופלואידיים, המציעים הזדמנויות חדשות לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות. המכשירים הם רב-תכליתיים ופשוטים לשימוש, ומאפשרים שליטה מרחבית-טמפורלית גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית.

כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

אנו מציגים פרוטוקול למערכת ניסויית סמי-הידרופונית מבוססת זכוכית התומכת בגידול של מגוון צמחים מובחנים פילוגנטית עם או בלי מיקרואורגניזמים. המערכת תואמת למצעי גידול שונים ומאפשרת דגימת הפרשה שורשית לא הרסנית לניתוח במורד הזרם.

מערכת צנצנות זכוכית רב-תכליתית ליצירת פרופיל הפרשה סמי-הידרופוני של שורשים

הפרוטוקול מתאר זיהום של שורשי Solanum tuberosum בנמטודות טפיליות של צמחים בתנאי חממה in vivo ושורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה במבחנה לניתוח היסטוכימי של מבנה השורשים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית.

זיהום in vivo ו-In vitro של שורשי תפוחי אדמה בנמטודות טפיליות צמחיות להערכת שינויים מבניים מושרים

חקור את תגובת התעתיק של Bacillus mycoides לחומרי הפרשת שורשי תפוחי אדמה. שיטה זו מאפשרת זיהוי גנים בקטריאליים חשובים באינטראקציות צמח-חיידק וניתנת להתאמה למחקרים נוספים.

צמח-חיידק האינטראקציה: תעתיק בתגובה של Bacillus Mycoides תפוחי אדמה שחורה Exudates

גלה סרטונים נוספים