זריקות של ליפופוליסכריד לתוך עכברים לחקות כניסה של מוצרים מיקרוביאלית נגזר לאחר פריצה מכשול המעי

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להציג מודל המחקה את כניסתם של מוצרים שמקורם בחיידקים לאחר פריצת מחסום המעי. מודל זה יכול לשמש לחקירת תגובות חיסוניות לאחר פלישת מיקרואורגניזמים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות המעי הדלקתיות, כגון דלקת בלתי מבוקרת, המאופיינת בחדירות אפיתל מעיים מוגברת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא לא רק משתמשת במשאבה מוגדרת, אלא היא גם גישה לא מסובכת שאינה דורשת ניתוח וניתן להשתמש בה בכל סביבת מעבדה. מי שידגים את ההליך יהיו אני, רייצ'ל מק'אניינגו, פוסט-דוקטורנטית, וברנה קאיה, דוקטורנטית. טפל בעכבר בעדינות אך בחוזקה, ורסן את החיה ביד אחת.

ודא שהעכבר מוחזק היטב ויכול לנשום כרגיל. הטה מעט את אף העכבר לכיוון הרצפה כדי לחשוף את הבטן להזרקה. אתר את קו האמצע של הבטן והזריק את נפח ה- LPS הנדרש בצד שמאל או ימין תחתון.

חשוב מאוד לוודא שהמחט נכנסת לחלל הצפק כדי למנוע הזרקות שגויות. המחט גם לא צריכה להיכנס עמוק מדי לחלל הצפק כדי למנוע פגיעה באיברים פנימיים. החזירו בעדינות את החיה לכלוב הביתי.

עקוב אחר העכברים להופעת וחומרת האנדוטוקסימיה בזמן ההזרקה וכל שעתיים לאחר מכן למשך שמונה שעות. רשום תצפיות בגיליון הציונים המצורף. הכן את צינורות האיסוף על ידי הוספת מיליליטר אחד של מגיב בידוד RNA חד-שלבי לשני צינורות מיליליטר מלאים מראש בכדורי קרמיקה של 1.4 מילימטר.

לאחר המתת חסד וחיזוק העכבר, השתמש במספריים כדי לחתוך את העור ואת שכבת השריר, ולחשוף את חלל הבטן עם האיברים הפנימיים. מנתחים בזהירות את הטחול, הכבד והמעי הגס. נקו את השומן מכל איבר, ואז הניחו ב-PBS על קרח.

לאחר מכן, השתמש במספריים או באזמל כדי לחתוך חתיכה באורך 0.5 סנטימטר מכל איבר. יבש לזמן קצר את הטישו על פיסת נייר, והנח אותו בצינור האיסוף, וודא שהוא שקוע לחלוטין במגיב בידוד RNA. לאחר מכן הומוגניזציה של הרקמה בהומוגנייזר ספסל במהירות גבוהה.

עבור רקמות רכות כמו טחול, כבד ומעי גס, השתמש במחזור אחד של הומוגניזציה במהירות גבוהה למשך 30 שניות. לאחר הומוגניזציה, דגרו את הדגימות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. טבלו בזהירות את הצינורות בחנקן נוזלי כדי להקפיא את ליזט הרקמה.

אחסן את הליזאט הקפוא בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לבידוד RNA. התחל בבידוד RNA על ידי הפשרת הרקמה הקפואה על קרח. לאחר ההפשרה, צנטריפוגה את הדגימה ב-1000 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את חלקיקי הרקמה הנותרים שעלולים להישאר.

לאחר צנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנטים לצינור חדש נטול נוקלאז של 1.5 מיליליטר, והוסיפו 200 מיקרוליטר של כלורופורם קר כקרח לכל מיליליטר אחד של מגיב בידוד RNA. יש לנער מיד את הגריס למשך 10 עד 15 שניות. לאחר דגירה של הדגימות במשך שתיים-שלוש דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה בטמפרטורה של 12,000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הדגימה תכיל כעת שלושה שלבים, שלב הכלורופורם האדום התחתון, האינטרפאזה והשלב המימי חסר הצבע העליון. אסוף את השלב המימי העליון המכיל RNA והעביר לצינור חדש נטול נוקלאז של 1.5 מיליליטר. כדי לזרז את ה-RNA, הוסף 0.5 מיליליטר איזופרופנול קר כקרח לכל מיליליטר אחד של מגיב בידוד RNA, וערבב בעדינות על ידי היפוך הצינור חמש עד שש פעמים.

לאחר דגירה של 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, הסר לחלוטין את הסופרנטנט המכיל את האיזופרופנול מבלי להפריע לגלולה. לאחר מכן שטפו את הכדורים עם מיליליטר אחד של אתנול 75% קר כקרח לכל מיליליטר אחד של ריאגנט בידוד RNA המשמש לליזה הראשונית, ומערבל את הדגימה לזמן קצר.

לאחר צנטריפוגה של הדגימה ב-7500 או 12,000 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, הסר לחלוטין את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. השאירו את הצינורות הפתוחים מתחת למכסה המנוע הכימי למשך שלוש עד חמש דקות כדי לייבש את כדור ה-RNA בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ממיסים את גלולת ה-RNA ב-20 עד 50 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז על ידי פיפטינג בזהירות למעלה ולמטה.

לאחר מכן דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות כדי לשפר עוד יותר את תמיסת ה-RNA. עכל DNA מזהם על ידי הוספת מים נטולי נוקלאז למקסימום של 10 מיקרוגרם RNA כך שהנפח הסופי יהיה 50 מיקרוליטר לאחר הוספת בופר ואנזים. לאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטר של מאגר 10X DNase 1 ומיקרוליטר אחד של DNase 1 רקומביננטי לכל דגימה וערבב בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות. לאחר הדגירה, מערבל את ה-DNase במגיב הפעלה, ואז הוסף חמישה מיקרוליטר לדגימה וערבב היטב. דוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, מערבבים מדי פעם ביד.

לאחר צנטריפוגה בעוצמה של 10,000 פעמים G למשך דקה וחצי, העבירו את הסופרנטנט המכיל את הרנ"א נטול הדנ"א לתוך שפופרת חדשה נטולת נוקלאז. לבסוף, מדוד את ריכוז ה-RNA ואיכותו על ידי ספקטרופוטומטר. לאחר הזרקת LPS, ציון המחלה, הכולל הערכות של המראה והפעילות של בעלי החיים, פקיחת עיניהם וקצב הנשימה שלהם ואיכותם, שורטט על ציר Y כנגד הזמן על ציר X.

QPCR לכימות ביטוי הציטוקינים גילה כי Il6 הגיע לשיא שעתיים לאחר הזרקת LPS בטחול ובמעי הגס, וארבע שעות לאחר ההזרקה בכבד. הביטוי של Il1 beta, Tnf alpha ו-Il10 הגיע לשיא ארבע שעות לאחר ההזרקה בכל הרקמות. תוך שמונה שעות, הביטוי של Il6, Il1 beta, Tnf alpha ו-Il10 חזר לרמות הבסיס.

בעת ניסיון ההליך, חשוב לזכור לקחת בחשבון את מינון ה-LPS, מצב ההיגיינה של העכברים, נקודת הזמן של סיום הניסוי והכי חשוב, הרקע הגנטי של זן העכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לחקות את הכניסה של תרכובות שמקורן בחיידקים למארח לאחר פריצת מחסום. המינון הנמוך והתת-קטלני של LPS המוזרק באופן שיטתי לעכברים גורם לוויסות מוגבר של ציטוקינים פרו-דלקתיים, אשר מכומתים על ידי ניתוח RGQ PCR.