חוקרים נביטה Teliospore באמצעות ניתוח Microrespiration ו- Microdissection

המטרה הכוללת של ההליכים המוצגים כאן היא לזהות שלבים של נביטת נבגים כך שניתן יהיה להעריך את רמות תעתיק הגנים. ניתוח שינויים אלה יספק ידע נוסף על שלב קריטי בפיזור המחלה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי מעברים במהלך נביטת טליוספור הקשורים לשינויים ברמות תעתיק הגנים ובכך משקפים שינויים בבקרת ביטוי הגנים.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מזהה מעברים ברמת הנשימה שאינם תואמים למתגים מורפולוגיים נראים ומאפשרת בידוד פיזי של טליוספורים בשלבי נביטה מובחנים. לטכניקה זו יש השלכות על בקרת התפשטות הפתוגן, מכיוון שהיא מאפשרת לנו לזהות מעברים מרכזיים בנביטת נבגים, שאם ישתנו, יכולים לחסום את התפשטות המחלה. התחל הליך זה עם זיהום קלחי תירס, קצירת טליוספורים, כמו גם בדיקת כדאיות ונביטה של טליוספור, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כדי לגרום לנביטה, שקלו תחילה כמות שווה של טליוספורים עבור כל ניסוי נשימה. בארון בטיחות ביולוגית, הוסף את הטליוספורים לתא נשימה חיטוי. מלאו את החדר במרק דקסטרוז תפוחי אדמה, בתוספת סטרפטומיצין סולפט וקנאמיצין סולפט.

פיפטה למעלה ולמטה ליצירת מתלה טליוספור. הנח את מכסה התא בתא כדי ליצור אטימה אטומה לאוויר. כדי להשיג את מדידת ה-OCR, הנח תחילה את החדר במדף התא בתוך אמבט מים.

לאחר מכן, הנח את בדיקת החמצן בתוך פתח החדר. עקוב אחר נקודות הנתונים המופיעות בזמן אמת בתוכנית קצב מעקב החיישן. הניחו לבדיקה להתייצב כשלוש דקות לאחר הנחת הגשושית בתא.

לחץ/י על ״מדידה״ כדי למדוד את רמות החמצן ברציפות במשך שש שעות, כאשר המדידות מתועדות במרווחים של שתי שניות. הפסק את המדידה וחזור על שלבים אלה עבור כל דגימה שיש לנתח לפני ייצוא הנתונים ל- Microsoft Excel וביצוע ניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכניסו כ -10 מיליגרם של umatus teliospores לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

השעו את הטליוספורים ב-500 מיקרוליטר של PDB בתוספת סטרפטומיצין סולפט. פיפטה בעדינות לערבב עד שאין גושי טליוספורים במדיום. העבירו את תרחיף הטליוספור לבקבוק ארלין מאייר בנפח 250 מיליליטר אוטומטי, המכיל PDB, בתוספת סטרפטומיצין סולפט.

דגרו את הבקבוק למשך הלילה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, רועדים ב-90 סל"ד. הכינו צלחת פטרי על ידי פיפטינג של ארבע עד חמש טיפות של חמישה מיקרוליטר מים מזוקקים על פני החלק העליון של צלחת הפטרי. לאחר מכן, פיפטה שלוש טיפות של שני מיקרוליטר של תמיסת ייצוב RNA על צלחת הפטרי שישמשו לאיסוף דגימות.

כמו כן פיפטה 30 טיפות של חמישה מיקרוליטר של טליוספורים נובטים על צלחת הפטרי. מוסיפים 15 מיליליטר שמן מינרלי לצלחת הפטרי. ודא שכל הטיפות מכוסות בשמן לפני שתמשיך.

לאחר מכן, הכינו מיקרו-נימי בקוטר פנימי של 15 מיקרון, אוגן של מילימטר אחד, אורך של 55 מיליליטר וזווית קצה של 20 מעלות. הנח אותו במחזיק המיקרו-נימי, וטבל אותו בשמן המינרלי, שם פעולה נימית תאפשר לשמן המינרלי להיכנס למיקרו-נימי. שחרר את הלחץ במיקרו-נימי לפני הבאתו לטיפה המים.

שאפו להכנת המיקרו-נימי במים. בעזרת פקדי המיקרומניפולטור, העבירו את המיקרו-נימי המוכן לאחת מטיפות הנביטה, וחדרו לטיפה. הורד את המיקרו-נימי, והביא את הפה של המיקרו-נימי לטליוספור נובט בשלב הנביטה המעניין.

שאפו לאט על מנת ללכוד את הטליוספור הנובט. הפסק לשאוף ברגע שהטליוספור נכנס למיקרו-נימי. חזור על הפעולה עד שיש כחמישה טליוספורים במיקרו-נימי.

הרם את המיקרו-נימי עם המיקרומניפולטור והביא אותו לטיפות האיסוף של תמיסת ייצוב RNA. חודרים לטיפה, ומזריקים את הטליוספורים לתוך הטיפה. חזור על שלבים אלה עד שנלכדו כ-1,000 טליוספורים.

כדי לשחזר את טיפת האיסוף, יש לזרוק את טיפת האיסוף ולהעביר אותה למכסה של צינור המיקרו-סנטרפוגה החופשי של ה-DNA של ה-RNA בנפח 2.0 מיליליטר. בזהירות את השמן המינרלי עם הפיפטה, מבלי להפריע לטיפות האיסוף. כעת ניתן להשתמש בטליוספורים עבור יישומים במורד הזרם כגון בידוד RNA.

תרשים זה ממחיש תוצאה אופיינית מהערכת שינויים ברמת החמצן בתרחיפים של טליוספורים המושרים לנבוט. יחסית לטליוספורים לא מושרים, ההפרדה המציינת את תחילת הנשימה מתרחשת לאחר כ-30 דקות. בהתחשב בכך שלוקח בערך 15 דקות להגדיר ולהעביר את הדגימה לבדיקת החמצן, הזמן הזה הוא למעשה 45 דקות.

מוצגים כאן חמשת השלבים של נביטת הטליוספור. בשלב הראשון, טליוספורים מושרים לנבוט אך אינם מראים סימן מורפולוגי של נביטה. שלב שני של טליוספורים מראים תפטיר שהופיע, באורך קטן מקוטר הטליוספור.

בשלב השלישי אורך התפטיר גדול מקוטר הטליוספור. שלב רביעי מאופיין בתפטיר עם בסיסיוספורים מחוברים. ובשלב החמישי, יש ניצנים של Basidiospores.

כאן, מוצגים הטליוספורים הנובטים באופן אסינכרוני, והמיקרו-נימי ממוקם ליד טליוספור שלב 3. לאחר מכן נשאב הטליוספור שלב 3 לתוך המיקרו-נימי ומועבר לטיפה של תמיסת איסוף. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקת מיקרו-דיסקציה זו כדי לבודד 1,000 טליוספורים ספציפיים לשלב תוך שש עד שבע שעות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לקחת הפסקות תכופות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד פיזית נבגים בשלבי נביטה שונים מבחינה מורפולוגית. ולזהות את העיתוי של התחלת הנשימה.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, בגלל הצורך לשמור על סטריליות. והצורך בסבלנות ובידוד סוגי תאים על ידי מיקרו-דיסקציה. פיתוח טכניקה זו סולל את הדרך לפתולוגים של צמחי פטריות לחקור את ההיבטים המורפולוגיים והמולקולריים של נביטה בפטריות זימה וחלודה הרסניות המאיימות על ביטחון המזון העולמי.

למרות שטכניקה זו חלה עלינו הליגומטיסטים, היא יכולה לשמש גם בפתוגנים הרסניים אחרים של גידולים חקלאיים שגורמים להפסדים של מיליארדי דולרים מדי שנה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בידוד RNA על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו, מהו הפרופיל והתזמון של שינוי רמת התמליל?