שיטה כמותית ומהירה השינוי Post-translational וגרסא מופעלת מיפוי של פפטידים כדי הגנום

המטרה הכוללת של פרוטוקול תוכנה זה היא להדגים את השימוש ב-PoGo למיפוי פפטידים עם שינויים נלווים לאחר תרגום ומידע כמותי מניסויי ספקטרומטריית מסה כדי להתייחס לגנומים ולאפשר אינטגרציה והדמיה עם נתוני גנומיקה אורתוגונלית. כלי זה יכול לסייע בהוספת מידע גנומי לרשימות הפפטידים שנוצרו על ידי חיפושי פרוטאומיקה של ספקטרומטריית מסה, כך שניתן יהיה להקל על האינטגרציה עם נתוני ריצוף RNA. היתרון העיקרי של כלי זה הוא שהוא פשוט לשימוש, מהיר ותומך במידע נוסף כגון שינויים לאחר תרגום, כימות ושונות חומצות אמינו.

כדי להתחיל, הורד והתקן את התוכנה המודגמת בסרטון זה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר ההתקנה, נווט אל תיקיית ההפעלה של PoGo GUI והפעל את התוכנית על ידי לחיצה כפולה על סמל PoGo GUI. השתמש בלחצן הבחירה שליד קובץ ההפעלה של PoGo.

לאחר מכן נווט בתיקיית ההפעלה לתיקיית המשנה הרלוונטית של מערכת ההפעלה ובחר את קובץ ה-PoGo הניתן להפעלה. אשר את בחירתו על ידי לחיצה על כפתור הפתיחה. לאחר מכן, בחר את קובץ קלט ההפניה עבור רצפי חלבונים על ידי לחיצה על בחירה.

נווט אל תיקיית הנתונים ובחר את קובץ יום התרגום המהיר. אשר את בחירתו על-ידי לחיצה על פתח. בחר את קובץ ביאור התמליל באמצעות לחצן הבחירה.

לאחר מכן נווט לתיקיית הנתונים, בחר את קובץ GTF ההערה ולחץ על פתח. הוסף את קובץ זיהוי הפפטידים באמצעות לחצן ההוספה שליד קבצי פפטיד. כאן, בחר את הקובץ בפורמט הנתמך MZ Tab, MZ Ident ML או MZ ID, או בפורמט ארבע עמודות מופרד.

בנוסף, בטל את הסימון בתיבות הסימון שליד BED NGTF בבחירת פורמט הפלט. השאר רק את PTM BED ו-GCT מסומנים. לאחר מכן בחר את המינים המתאימים לנתונים מהבחירה הנפתחת והתחל למפות על ידי לחיצה על התחל.

ראשית, טען את קובץ הפלט של PoGo המסתיים במיטה _ptm לתוך מציג הגנומיקה האינטגרטיבית. חזור על הפעולה כדי לטעון גם את הקובץ המסתיים ב- _noptm.bed.

קובץ זה מכיל את כל הפפטידים שנמצאו ללא כל שינוי. סדר מחדש רצועות על-ידי גרירה ושחרור שלהן למיקום הרצוי ברשימה. כל קובץ יוצג כרצועות נפרדות כאשר שם הקובץ מזהה את הרצועה.

כל רצועה מוצגת בתחילה בצורה מכווצת. כדי להרחיב אותם, לחץ לחיצה ימנית על שם הרצועה ובחר מורחב לתצוגה מלאה של הפפטידים כולל הרצפים. כעת טען את הקובץ המסתיים ב-gct.

קובץ זה מכיל את מידע כימות הפפטיד. בניגוד לקבצים שנטענו בעבר, כל דגימה עם הערות תיטען כרצועה נפרדת. ארגן מחדש את הדוגמאות כרצונך באמצעות פעולות גרירה ושחרור.

נווט בתוך הגנום על ידי בחירת כרומוזום בתפריט הנפתח על ידי לחיצה ממושכת על קטע של כרומוזום כדי להגדיל או על ידי הקלדת הקואורדינטות הגנומיות. ניתן לבצע מיפוי PoGo באמצעות ממשק המשתמש הגרפי או באמצעות ממשק שורת הפקודה. בחלק זה של הפרוטוקול, ממשק שורת הפקודה משמש להדגשת יכולת ההחלפה.

על מנת למפות את הפפטידים הגרסאות שהושגו בשלבים הקודמים בפרוטוקול הטקסט לגנום הייחוס, פתח שורת פקודה ונווט לתיקיית ההפעלה של PoGo. לאחר מכן הקלד את הפקודה המוצגת כאן. אשר את הביצוע על ידי לחיצה על מקש Enter והמתן עד לסיום הביצוע לפני שתתקדם הלאה.

דמיין את הפפטידים ממופים ללא אי התאמה ועם חוסר התאמה במציג הגנומיקה האינטגרטיבית. בתוכנת ממשק המשתמש הגרפי PoGo, הוסף את קבצי זיהוי הפפטידים באמצעות כפתור ההוספה שליד קבצי פפטיד ובחר קבצים בודדים או מרובים וכן גרור ושחרר לשדה הריק מתחת לקבצי פפטיד. לאחר מכן בטל את הסימון בתיבות הסימון שליד PTM BED, GTF ו-GCT בקטע פורמט הפלט והשאר רק את BED מסומן.

בנוסף, בחר באפשרות מיזוג קבצי קלט מרובים לפלט יחיד. זה יביא לקובץ פלט יחיד המשלב את כל הפפטידים של קבצי הקלט. השארת אפשרות זו לא מסומנת תגרום לביצוע רציף של התוכנית עבור כל קובץ קלט בנפרד.

לאחר מכן, בחר את המינים המתאימים לנתונים מהתפריט הנפתח התואם את קבצי NGTF ליום המהיר. לאחר הבחירה, התחל את המיפוי על ידי לחיצה על כפתור ההתחלה. על מנת ליצור רכזת מעקב מפפטידים ממופים, פתח חלון מסוף והקלד את הפקודה הבאה בשורת הפקודה.

אשר את הביצוע על ידי לחיצה על מקש Enter. הביצוע ייקח זמן קצר בלבד. לאחר שתסיים, העבר את רכזת המעקב שנוצרה עם כל תוכנו לשרת FTP נגיש לאינטרנט או GitHub.

בדפדפן אינטרנט, נווט אל דפדפן UCSC Genome ובחר My Data Track Hubs. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה הרכזות שלי. העתק את כתובת ה- URL לרכזת המעקב לשדה הטקסט ולאחר מכן טען את רכזת המעקב על-ידי לחיצה על הוסף רכזת.

לבסוף, בחר את דפדפן הגנום כדי להיכנס לתצוגת הדפדפן. מרכז המעקב המותאם אישית יוצג בראש הרשימה. אם מספר קבצי BED בנו את הבסיס לרכזת המסלול, כל אחד מהקבצים יוצג כרצועה נפרדת בתוך הרכזת.

PoGo ושני כלי מיפוי פרוטאוגנומיקה אחרים מושווים כאן עבור השימוש הכולל בזיכרון וזמן הריצה האנליטי שלהם. PoGo עולה משמעותית על הכלים האחרים הן במהירות והן בזיכרון והוא מסוגל למפות שינויים לאחר תרגום ומידע כמותי הקשור לפפטידים על הגנום. PoGo משתמשת באפשרות הצביעה כדי לספק סיוע חזותי קל ביחס לייחודיות של מיפוי פפטידים בתוך הגנום.

מיפויים באדום מצביעים על ייחודיות לתעתיק יחיד בעוד שהבלוק מדגיש מיפוי לגן בודד. מיפויים אפורים מראים פפטידים המשותפים בין מספר גנים. אפשרות PTM BED של PoGo מגדירה מחדש את קוד הצבע כך שיתאים לסוגים שונים של שינויים לאחר תרגום המציינים את מיקום השינוי עם גוש עבה בשאריות חומצות האמינו ששונו.

בנתוני הפרוטאום המוצגים כאן המייצגים את זה של סרטן המעי הגס, זוהו רק שני פפטידים כאשר כל אחד מהם מראה זרחון יחיד. המידע בקובץ הפלט GCT מספק ערכים כמותיים עבור אזורים גנומיים המכוסים על ידי פפטידים. פפטידים המשתרעים על פני צמתים מחולקים לחלקיהם מבלי להתחבר.

למידע מקיף יותר על שחבור, קובץ הפלט GTF נדרש בנוסף. לאחר הורדת רצפי חלבון הייחוס וההערות, ניתן למפות אלפי פפטידים על קואורדינטות גנומיות תוך פחות מחמש דקות כאשר לא מאפשרים אי התאמות ברצף. בעת ניסיון למפות פפטידים על גנום ייחוס באמצעות PoGo, חשוב לזכור להשתמש ברצפים מתורגמים של תעתיקי קידוד חלבון והערות תעתיק נלוות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש ב-PoGo וב-PoGo GUI כדי למפות פפטידים מניסויי ספקטרומטריית מסה של פרוטאומיקה עם מידע נלווה על גנומים המוזכרים ולדמיין אותם.