פרוטוקול לרכוש את Tenocyte ניוונית של בני אדם

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ביולוגיה של טנוציטים ניווניים אנושיים מכיוון שרק מחקרים מעטים תיארו בפירוט בידוד טנוציטים ניווניים אנושיים ותרבית. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שאנו יכולים להשיג טנוציטים ניווניים אנושיים ללא פגיעה נוספת בחולה מכיוון שהרקמה הניוונית נרכשת במהלך ניתוח אפיקונדיליטיס סטנדרטי. ידגימו את ההליך ד"ר סו-הונג האן, מינג'ונג בק והיונג קיונג קים מהרמה השלישית שלי.

כדי לרכוש דגימת רקמת גידים ניוונית, השתמש באזמל כירורגי מספר 15 כדי לבצע חתך עור של שלושה עד חמישה סנטימטרים רק קדמי מדיאלי לאפיקונדיל הרוחבי, ופרוקסימלי לרמת המפרק כדי לחשוף את המרפק הצדדי ולאתר חזותית את ה-extensor carpi radialis longus בממשק ה-extensor aponeurosis. השתמש באזמל כדי לבצע חתך פיצול בעומק של שניים עד שלושה מילימטרים בין ה-extensor carpi radialis longus לבין ה-extensor aponeurosis בממשק. לאחר נסיגה קדמית של ה-extensor carpi radialis longus, אתר את הרקמה הניוונית הפתולוגית לפי צבעה האפרפר העמום האופייני ורקמה בצקתית ופריכה בדרך כלל, והשתמש באזמל ובמיני להבים כדי לכרות בזהירות, אך בחדות, את כל הרקמה הניוונית.

לאחר שנקצרה כל הרקמה, סגרו את הפצע בחומר תפר שאינו נספג על פי הפרוטוקולים הסטנדרטיים והסירו בזהירות את כל הרקמה שמסביב מחתיכת דגימת רקמה של סנטימטר מעוקב אחד, והניחו את רקמת הגיד הנקייה לתוך 10 מיליליטר PBS ברגע שהיא נחתכה. לאחר מכן יש לתקן כמחצית מהרקמה שנקטפה בפורמלין ניטרלי של 10% במכסה אדים כימי למשך 12 שעות. כדי להקים תרבית טנוציטים, העבירו את המחצית השנייה של דגימות הבקרה והרקמות המנוונות שנקטפו לתוך צלחות תרבית רקמה בודדות המכילות PBS טרי וטחנו את הרקמות למטר מעוקב אחד או חתיכות קטנות יותר, עכלו את שברי הרקמה ב-30 מיליליטר DMEM בתוספת 30 מיליגרם למיליליטר קולגנאז שניים לקבוצת רקמות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

בתום העיכול, סנן את תמיסות התאים דרך מסנני תאים בודדים של 100 מיקרון והשבת את הקולגנאז עם מיליליטר אחד של FBS לכל צינור. אסוף את הטנוציטים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדורים בשלוש פעמים 10 עד חמישית תאים לכל 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% ריכוז תמיסה אנטי-פטרייתית. לאחר מכן, זרעו את התאים לתוך צלחת תרבית אחת של 100 סנטימטר לכל מצב, ותרבו את הטנוציטים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שבוע אחד, והחליפו את מדיום התרבית כל שלושה ימים עד שמגיעים למפגש של 80%.

לניתוח אימונוציטוכימי, העבירו פעמיים פי 10 לתאים החמישיים ב-200 מיקרוליטר של מדיום טרי לכל באר של מגלשת תא אחת של שמונה בארות לכל קבוצת ניסוי וגדלו את התאים למפגש למשך 24 שעות. למחרת יש לשטוף את התאים עם PBS, ואחריו קיבוע עם 500 מיקרוליטר של 4% פורמלדהיד לבאר, וחדירות עם 0.5% טריטון X 100 ב- PBS למשך 10 דקות. כדי לחסום כל קשירה לא ספציפית, דגרו על התאים עם 1% אלבומין בסרום בקר, ו-0.05% Tween 20 ב-PBS, בהתאם לניסוי, ולאחר מכן דגירה עם הנוגדנים הראשוניים המעניינים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה מוגנים מאור.

למחרת בבוקר, סמנו את התאים עם הנוגדנים המשניים המתאימים למשך שעה בטמפרטורת החדר מוגנים מפני אור, והרכיבו את הדגימות עם 0.5 מיקרוליטר של מדיום הרכבה פלואורסצנטי מתאים לכל תא. לאחר מכן צלמו את הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת מטרה של פי 400. לניתוח פתולוגי של הרקמה, יש להטמיע את דגימות רקמת הבקרה והגידים המנוונות בארבעה עד חמישה מיליליטר פרפין ולרכוש ארבעה עד חמישה חלקי מיקרון מכל גוש פרפין.

עבור המטוקסילין באאוזין, או צביעת H&E, הפחיתו את הדגימות עם שלוש טבילות של חמש דקות בקסילן ולאחר מכן הידרציה עם טבילות אתנול מדורגות ושטיפת מי ברז של שתי דקות. לאחר מכן, סמנו את הדגימות בהמטוקסילין למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטיפה נוספת של שתי דקות במים. טבלו את הדגימות השטופות בחומצה הידרוכלורית 1% ואתנול 70% למשך שלוש שניות, ולאחר מכן שטיפה במים של שלוש דקות.

נטרלו את החומצה עם טבילה של 10 שניות ב-0.5% אמוניה, ולאחר מכן שטיפת מים נוספת של שלוש דקות. סמנו את הדגימות המנוטרלות עם האאוזין למשך חמש דקות, וייבשו את הדגימות המוכתמות ב-H&E בטבילות אתנול מדורגות. לאחר שלוש טבילות קסילן, הרכיבו את הדגימות עם אמצעי הרכבה מתאים ושקופית כיסוי.

כדי לבצע ניתוח אימונוהיסטוכימי של דגימות הרקמה, השתמש בערכת הזיהוי המעודנת של פולימר הקשר בהתאם להוראות היצרן עם השינויים הקלים הבאים. לאחר דה-פרפיניזציה עם קסילן כפי שהודגם, טבלו את הדגימות בתמיסת אחזור אפיטופ קשר למשך 30 דקות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס לאחזור אנטיגן, ולאחר מכן דגירה של חמש דקות במי חמצן כדי להרוות כל פרוקסידאז אנדוגני. לאחר מכן, סמן את החלקים למשך רבע שעה בטמפרטורת החדר עם הנוגדנים העיקריים המעניינים.

בתום הדגירה, סמן את הדגימות במערכת הנוגדנים המשנית המתאימה ללא ביוטין ללא ביוטין פרוקסידאז למשך 50 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הרכיבו את החלקים עם החלקת כיסוי באמצעי ההרכבה המתאים וצלמו את הדגימות במיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 400. ניתוחי H&E מגלים כי רקמה שנאספה מהאפיקונדיליטיס הצדדי המנוון מדגימה צרורות קולגן לא מאורגנים עם אובדן קוטביות ומבני סיבים מקבילים עדינים, ישרים וארוזים חזק.

ואכן, צרורות הקולגן חיוביים לצביעה כחולה אלציאנית בקטעי הרקמה המנוונים, מה שמעיד על נוכחות מוגברת של פרוטאוגליקן וגליקוזאמינוגליקן בתוך הרקמה הפגועה. ניתוח אימונוהיסטוכימי של הגידים המנוונים מצביע גם על תגובה חיובית גרגירית ציטופלזמית לגורם גדילה אנדותל כלי דם שאינה נצפית בדגימות רקמת גיד בקרה בריאה. ניתן לאשר את שני סוגי תאי דגימת הרקמה המתורבתים כטנוציטים על ידי אימונופלואורכימיה, כאשר רוב התאים המתורבתים מבטאים סמני טנוציטים מייצגים כגון חלבוני המוהוק והטנומודולין ומפגינים מראה מוארך.

יש לציין כי הטנוציטים הניווניים מפגינים גם קצב התפשטות גבוה יותר בתרבית בהשוואה לטנוציטים שנקטפו מבקרות בריאות, כמו גם ביטוי גבוה יותר של גנים מרובים הידועים כקשורים להתפתחות גידים. לסיכום, פרוטוקול מתוקף זה המשתמש בטנוציטים ניווניים סולל את הדרך למחקרים עתידיים בביולוגיה של גידים ולבדיקת התערבויות חדשות.