Name: פרוטוקול לרכוש את Tenocyte ניוונית של בני אדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: למד פרוטוקול לבידוד טנוציטים ניווניים אנושיים במהלך ניתוח אפיקונדיליטיס. השיטה מאפשרת איסוף רקמה ללא פגיעה נוספת במטופל ומספקת משאב יקר ערך למחקר טנדינופתיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק של קוריאה בריאות טכנולוגיית R & D פרויקט דרך קוריאה בריאות תעשיית פיתוח המכון (KHIDI), אשר מומן על ידי משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (להעניק את המספר: HI16C1559).

הפרוטוקול נערך בהתאם הצהרת הלסינקי, הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת הבדיקה המוסדית במרכז הרפואי Bundang צ'ה.
1. ניוונית גיד הקציר רקמות מן המטופל
<ol><li>לאבחן epicondylitis לרוחב על-ידי לקיחת היסטוריה רפואית באמצעות ממצאי בדיקה גופנית: רגישות מעל המקור tendinous קרוב העלי הרוחבית; כאב עורר התנגד סיומת של מפרק כף היד.</li>
	<li>השתמש לקריטריוני ההכללה הבאה: מעל גיל 18; היסטוריה של epicondylitis לרוחב במשך לפחות שישה חודשים; עקשניים לטיפול פעיל לפרקים; לפחות שלושה חודשים חלפו מאז הזרקה של סטרואידים, פלזמה עשיר טסיות או בוטולינום טוקסין</li>
	<li>אל תכלול את הדברים הבאים: נשים בהריון; למטופלים עם היסטוריה של מחלות בעמוד השדרה הצווארי, המרפק דלקת פרקים, מחלת והראומטולוגיים, ניתוח סביב המרפק, תסמונת מלכוד עצב; חולים מסרב תרום רקמות.</li>
	<li>
טכניקה כירורגית הערה: ראה איור 124.<ol>
<li>לאחר הרדמה כללית על-ידי איזופלוריין צנרור אנדוטרכאליות, לשים את היד על השולחן, עורקים. הסוכן betadine להחיל על כל הזרוע, מאסו עם גיליון כירורגי אספטי.</li>
		<li>לחשוף את המרפק לרוחב דרך חתך 3-5 ס מ עם מס 15 באזמל כירורגי להב רק anteromedial העלי הרוחבית, מקורב לרמה של המפרק.</li>
		<li>מבחינה חזותית לזהות את פושט carpi radialis הארוך (ECRL) ואת ממשק aponeurosis פושט ולעשות חתך פיצול 2 – 3 מ מ לעומק בין aponeurosis ECRL, פושט עם להב באזמל כירורגי מס 15-הממשק שזוהה.</li>
		<li>לחלץ את ECRL anteriorly, אשר תביא פושט פיפטות carpi radialis הארוך הקצר (ECRB) מקורו מתחת לתצוגה ישירה.</li>
		<li>חזותית לזהות את רקמות ניוונית פיפטות מאת צבעו אפרפר משעמם האופיינית ורקמות בדרך כלל בצקי ומתפורר.</li>
		<li>לאחר זיהוי, בזהירות נכרות כל רקמות ניוונית בחדות באמצעות אזמל כירורגי מס 15 ומיני-להבים.</li>
		<li>להטביע את הרקמה resected (כ- 1 ס מ3) לתוך פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) מיד ולהסיר כל הרקמה שמסביב חוץ רקמות גיד בזהירות לתוך בערך 10 מ"ל של PBS ככל האפשר.</li>
		<li>במקרים עם גרמי המולדים בעצם המוח-העלי הרוחבית, הסר המולדים בעצם המוח באמצעות rongeur של, להחליק את זה עם rasp. לעשות חורים לקדוח מרובים (בקוטר 1.6 מ מ, כ 6-8 חורים) ב המפרקתי הנמוך anterolateral כדי לשפר את אספקת הדם. פעולה זו היא אופציונלית.</li>
		<li>לסגור את הפצע שכבה אחרי שכבה באמצעות חומר תפרים נספגים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tenocyte בקרה בריאים
	<ol>
<li>להשיג tenocytes בריא של הגיד הנותרים של הגיד שריר הירך-אוטומטי או אוטומטי-צלחית במהלך שחזור צולבת קדמית, ולהשתמש בו בתור לפקד על הניסוי הבא25. הערה: מספר דגימות המשמשות במחקר זה היו שלושה בכל קבוצה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. היסטולוגיה
<ol><li>חנות כמחצית הרקמה שנקטפו בפורמלין נייטרלי במאגר 10% הוד fume כימי או שווה ערך.</li>
	<li>להטביע את הרקמה בבלוק פרפין (4 – 5 מ"ל), סעיף זה בסעיפים 4-5 מיקרומטר coronally.</li>
	<li>
כתם מקטעים של גיד ניוונית עם Hematoxylin ו Eosin כתם (H & E), הכתם Alcian כחולה ב- pH של 2.5 ובקרה. לבצע H & E מכתים במכונה אוטומטית כתם כדלקמן.
	<ol>
<li>Deparaffinize באמצעות קסילן (3 פעמים, 5 דקות, בהתאמה).</li>
		<li>מימה של כהלים מדורגת למים (100% אלכוהול, 4 דקות 100% אלכוהול, 3 דקות; 95% אלכוהול, 2 דקות; 70% אלכוהול, 1 דקות; מים, 2 דקות).</li>
		<li>כתם ב Hematoxylin עבור 5 דק לשטוף היטב במים למשך 2 דקות.</li>
		<li>להבדיל ב 1% אלכוהול חומצה (1% HCl ב-70% אלכוהול) עבור 3 ס' לשטוף היטב במים למשך 3 דקות.</li>
		<li>לנטרל HCl בטבילת של אמוניה 0.5% 10 s, ולאחריה שטיפה במים 3 דקות.</li>
		<li>כתם ב Eosion במשך 5 דקות.</li>
		<li>מייבשים דרך כהלים (80% אלכוהול, 30 s; 95% אלכוהול, 1 דקות; 100% אלכוהול 1 דקות, 100% אלכוהול 2 דקות).</li>
		<li>ברור של קסילן (3 פעמים, 2 דקות, 2 דקות ו- 3 דקות, בהתאמה).</li>
		<li>הר עם מגלשת כיסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לבצע immunohistochemitry (IHC) באמצעות ערכת בונד פולימר לחדד זיהוי על-פי הוראות היצרן עם שינויים מזעריים.
	<ol>
<li>לאחר deparaffinization באמצעות קסילן, לבצע הליך אחזור אנטיגן באמצעות בונד Epitope אחזור פתרון במשך 30 דקות ב- 100 מעלות צלזיוס. הפתרון אחזור Epitope בונד מכיל מאגר ציטראט המבוסס על חומרים פעילי שטח (1 ליטר, pH 5.9 – 6.1).</li>
		<li>להרוות אנדוגני peroxidases על ידי המקננת הרקמה עם מימן על-חמצני במשך 5 דקות.</li>
		<li>דגירה הסעיפים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (21-22 מעלות צלזיוס) עם ראשי נוגדנים נגד כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) (1:200), tenomodulin (1:200) או מוהוק (1:200).</li>
		<li>לבצע נוגדנים משניים תיוג עם חזרת נטולת ביוטין פולימריים peroxidase-מקשר נוגדן תרכיב מערכת.<ol>
<li>שימוש משני ארנב אנטי עכבר IgG בנסיוב בבעלי חיים 10% (v/v) בתמיסה 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one saline/0.09% באגירה טריס למקם העכבר נוגדנים.</li>
			<li>השתמש פולימר אנטי-ארנב פולי-HRP-אג ' (< µg 25/mL) המכיל 10% (v/v) בסרום בעלי חיים בבאגירה טריס saline/0.09% כדי להתאים לשפה ארנב נוגדנים.</li>
			<li>השתמש 3, 3'-Diaminobenzidine מימה tetrahydrochloride בפתרון מייצב להמחיש המתחם דרך התמיסה חום.</li>
			<li>Counterstain עם < hematoxylin 0.1% (כחול) כדי להמחיש את גרעין התא.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>לצפות בשקופיות מוכתם H & E, Alcian כחול כתמי ולאחר IHC VEGF, tenomodulin של מוהוק במיקרוסקופ אור ולקבל תמונות מיקרוסקופיות נציג של כל שקופית תחת מתח גבוה אחד שדה (400 X).</li>
</ol>3. Tenocyte תרבות
<ol><li>
הכנת הרקמה
	<ol>
<li>הכינו את הדגימה גיד על-ידי הסרת כל הרקמה שמסביב ביסודיות עם מיקרו-מספריים וחדים.</li>
		<li>לשטוף עם PBS, מינצ לחתיכות קטנות (על 1 מ מ3 או פחות).</li>
		<li>מעכלים רקמת עבור 1 h ב- 30 מ ששינה הנשר של Dulbecco בינוני (DMEM) בתוספת 30 מ"ג/מ"ל Collagenase II ב 37 º C.</li>
		<li>עוברים תאים דרך מסננת תא 100 מיקרומטר.</li>
		<li>לבטל את Collagenase השני על-ידי הוספת 1 מ"ל של נסיוב שור עוברית (FBS).</li>
		<li>צנטריפוגה ב g x 196 במשך 5 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תרבית תאים
	<ol>
<li>זרע 3 x 105 תאים לתוך תבשיל 100 מ מ, תרבות עם DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% פתרון אנטיביוטיקה-Antimycotic-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% במשך שבוע.</li>
		<li>לשנות את המדיום תרבות כל שלושה ימים עד 80% הנהרות מתרחשת. תרבות בקרה בריאים והן דגימות תאים ניוונית עד המעבר ארבע ולהשתמש לניסוי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Immunocytochemistry (ICC)
<ol><li>להעביר 200 µL של תאים בתרבית (2 x 105 תאים) הבארות שמונה של שקופית קאמרית ולגדול התאים למפגש עם התוספת של מדיה חדשה עבור יום אחד.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם PBS ותקן עם 500 µL של 4% פורמלדהיד לכל טוב.</li>
	<li>דגירה של השקופיות עם 0.5% X-100 Triton ב- PBS 10 דקות עבור permeabilization של הממברנות.</li>
	<li>לחסום ב- PBS עם אלבומין פרה 1% ל- 0.05% TWEEN-20 המוהוק, tenomodulin, בהתאמה.</li>
	<li>דגירה בחושך עם העכבר מוהוק נגד נוגדנים חד שבטיים (דילול מטריים), נוגדן anti-tenomodulin עזים (דילול מטריים) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>דגירה הנוגדנים משני (אלכסה 555-נגד עז (1:200) עבור tenomodulin; אלקסה 488-אנטי עכבר (1:200) עבור מוהוק) בחושך לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הר עם 0.5 µL מדיום הרכבה זריחה.</li>
	<li>לנתח באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (400 X).</li>
</ol>5. התפשטות Assay
<ol><li>
למדוד תא viabilities באמצעות tetrazolium מסיסים במים (wst, מרץ)-1.
	<ol>
<li>זרע תאים בריאים והן ניוונית לוחות טוב 96-צפיפות של 2 x 103 תאים לכל טוב של 24, 72 ו- 120 h.</li>
		<li>לאחר דגירה, להוסיף 10 µL של הפתרון WST-1 10% מכל קידוח.</li>
		<li>דגירה על עומדי 3 h ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.</li>
		<li>מודדים את צפיפות אופטית-450 nm באמצעות קורא microplate. את הקרינה לפחות שלוש פעמים בכל הנקודות הזמן עבור כל דגימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מדד הסלולר DNA סכום באמצעות וזמינותו BrdU.
	<ol>
<li>זרע שניהם בריאים, ניוון תאים לתוך 96 טוב צלחות על צפיפות של תאים3 עונה 2 פרק 10 לכל טוב של 24, 72 ו- 120 h.</li>
		<li>לאחר דגירה, להוסיף 10 µL של 10% BrdU פתרון טוב לכל.</li>
		<li>דגירה על עומדי 3 h ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.</li>
		<li>להוסיף 100 µL טוב של הפתרון תיקון/Denaturing (60-70% אתנול, 0.1-0.5% נתרן הידרוקסידי) ולשמור את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
		<li>הוסף µL 100/טוב מוכן 1 x זיהוי נוגדנים פתרון ולשמור הצלחת בטמפרטורת החדר 1 h.</li>
		<li>הסרת פתרון, לשטוף צלחת שלוש פעמים עם 1 x מאגר לשטוף.</li>
		<li>להוסיף µL 100/טוב מוכן 1 x מצומדת HRP נוגדנים משניים פתרון ולהשאיר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
		<li>הסר את לוחית פתרון ושטוף שלוש פעמים עם 1 x מאגר לשטוף.</li>
		<li>להוסיף 100 µL של 50% שוייץ המצע.</li>
		<li>תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להוסיף 100 µL של להפסיק פתרון.</li>
		<li>מודדים את צפיפות אופטית-450 nm באמצעות קורא microplate. הערה: לקחת קריאות לפחות שלוש פעמים על כל נקודות זמן עבור כל דגימה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ניתוח סטטיסטי
<ol><li>לאסוף ולנתח את הנתונים באמצעות SPSS.</li>
	<li>מתארים את הנתונים על-ידי זאת אומרת ± לשגיאה הסטנדרטית של ממוצע.</li>
	<li>השתמש מאן ויטני U במבחן.</li>
	<li>לקחת בחשבון הבדלים משמעותיים סטטיסטית בעת ערך p הוא פחות מ- 0.05 (p < 0.05).</li>
</ol>

<ol><li>Ackermann, P. W., Renstrom, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23016086">Tendinopathy in sport.</a> Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).</li>
<li>Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+and+epidemiology+of+tendinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Types and epidemiology of tendinopathy.</a> Clinical Sports Medicine. 22 (4), 675-692 (2003).</li>
<li>Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+sensory+neuropeptides+in+tendon+is+associated+with+failed+healing+and+activity-related+tendon+pain+in+collagenase-induced+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury.</a> American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).</li>
<li>Han, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+corticosteroid+on+the+expressions+of+neuropeptide+and+cytokine+mRNA+and+on+tenocyte+viability+in+lateral+epicondylitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis.</a> Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40(2012).</li>
<li>Uchio, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neuropeptides+and+cytokines+at+the+extensor+carpi+radialis+brevis+muscle+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Shoulder+and+Elbow+Surgery%22%5BJournal%5D)">Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin.</a> Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).</li>
<li>Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+human+wrist+extensor+muscle+sarcomere+length+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes.</a> Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).</li>
<li>Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+histopathology+of+chronic+refractory+lateral+epicondylitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis.</a> American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).</li>
<li>Sharma, P., Maffulli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+injury+and+tendinopathy%3A+healing+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+American+volume%22%5BJournal%5D)">Tendon injury and tendinopathy: healing and repair.</a> Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).</li>
<li>Lui, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+technology+for+tendon+regeneration%3A+current+status%2C+challenges%2C+and+future+research+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Cloning%22%5BJournal%5D)">Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions.</a> Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).</li>
<li>Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-I+improves+cellular+and+molecular+aspects+of+healing+in+a+collagenase-induced+model+of+flexor+tendinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Research%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis.</a> Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).</li>
<li>Schnabel, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+and+insulin-like+growth+factor-I+gene-enhanced+mesenchymal+stem+cells+improve+structural+aspects+of+healing+in+equine+flexor+digitorum+superficialis+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons.</a> Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).</li>
<li>Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon-derived+progenitor+cells+improve+healing+of+collagenase-induced+flexor+tendinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Research%22%5BJournal%5D)">Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis.</a> Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).</li>
<li>Titan, A., Andarawis-Puri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendinopathy%3A+Investigating+the+Intersection+of+Clinical+and+Animal+Research+to+Identify+Progress+and+Hurdles+in+the+Field%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+Review%22%5BJournal%5D)">Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field.</a> Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).</li>
<li>Dirks, R. C., Warden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+the+study+of+tendinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Musculoskeletal+Neuronal+Interaction%22%5BJournal%5D)">Models for the study of tendinopathy.</a> Journal of Musculoskeletal Neuronal Interaction. 11 (2), 141-149 (2011).</li>
<li>de Mos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+platelet-rich+plasma+enhance+tendon+repair%3F+A+cell+culture+study%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study.</a> American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).</li>
<li>Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+bupivacaine+on+cultured+tenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Effect of bupivacaine on cultured tenocytes.</a> Orthopedics. 32 (1), 26(2009).</li>
<li>Wong, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dexamethasone+on+cultured+human+tenocytes+and+its+reversibility+by+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+American+Volume%22%5BJournal%5D)">Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor.</a> Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).</li>
<li>Tempfer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+crystalline+glucocorticoid+triamcinolone+acetonide+on+cultered+human+supraspinatus+tendon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells.</a> Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).</li>
<li>Menon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+in+extracellular+matrix+remodeling+and+collagen+turnover+related+pathways+in+cultured+human+tenocytes+after+ciprofloxacin+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Muscles+Ligaments+Tendons+J%22%5BJournal%5D)">New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration.</a> Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).</li>
<li>Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P+is+a+mechanoresponsive%2C+autocrine+regulator+of+human+tenocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (11), 27209(2011).</li>
<li>Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P+reduces+TNF-alpha-induced+apoptosis+in+human+tenocytes+through+NK-1+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Britich+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation.</a> Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).</li>
<li>Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell+proliferation+and+associated+expression+of+PDGFRbeta+causing+hypercellularity+in+patellar+tendinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis.</a> Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).</li>
<li>Hoppe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenocytes+of+chronic+rotator+cuff+tendon+tears+can+be+stimulated+by+platelet-released+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Shoulder+and+Elbow+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors.</a> Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).</li>
<li>Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nirschl+surgical+technique+for+concomitant+lateral+and+medial+elbow+tendinosis%3A+a+retrospective+review+of+53+elbows+with+a+mean+follow-up+of+11.7+years%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years.</a> American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).</li>
<li>Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+tenocyte+morphology+is+more+prevalent+than+collagen+disruption+in+asymptomatic+athletes%27+patellar+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Research%22%5BJournal%5D)">Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons.</a> Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).</li>
<li>Yuan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+an+Animal+Model+of+Tendinopathy+by+Inducing+Chondrogenic+Differentiation+with+Kartogenin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin.</a> PLoS One. 11 (2), 0148557(2016).</li>
<li>Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+validated+animal+models+for+tendinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Medical+Scientific+Sports%22%5BJournal%5D)">What are the validated animal models for tendinopathy.</a> Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).</li>
<li>Wilhelm, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19700079">Lateral epicondylitis review and current concepts.</a> Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מספר מחקרים קודמים דיווחו על איך ליצור מודלים בעלי חיים tendinopathic כרונית, באמצעות הליכים שונים כגון collagenase או הזרקת kartogenin, הליכון ריצה26,עוד27. למרות מחקרים רבים הראו מבטיחים אפקטים טיפולית המבוססת על מודלים בבעלי חיים אלה, ניסויים באמצעות את tenocyte ניוונית האנושי יהיה מכריע בתחום tendinopathy כדי לשחזר את היעילות של הטיפול. במאמר זה, הקמנו פרוטוקול בהצלחה הקציר של התרבות האנושית tenocytes ניוונית באופן עקבי. שניהם שנקטפו רקמות גיד והראו tenocyte ...

Tendinopathy היא כרונית מצב של ניוון שרירים ושלד שמתפתח בחלקים שונים של הגוף. לאחרונה, מספר המקרים של tendinopathy גדל באופן משמעותי בעולם המפותח בשל גידול ההשתתפות ספורט ופנאי תוחלת החיים מוגברת1,2. הגורם tendinopathy נחשבת multifactorial, גורמים אלה כוללים איסכמיה, פציעות רדיקלים חופשיים של חמצן, חוסר איזון בין מצר את כלי הדם, מרחיב כלי דם innervations, מיקרו פנימי-דמעות, ושינויים נוירו-תקנה3 ,4,5,6,7,8. רוב הטיפולים עבור tendinopathy רק להקל על הסימפטומים שלה. יתר על כן, טיפולים ללא התחדשות רקמות דורשים זמן רב לשיקום ולהשיג לתגובה מוגבלת של הגידים פצוע, שהטילו אתגר קליני עבור רופאים9.
היכולת של אפשרויות הטיפול הנוכחי יחד עם חוסר היכולת של הגיד ניווניות self-heal יש חוקרים עופרת להתעניין לחקור אסטרטגיות טיפול אלטרנטיבי. לאחרונה, מחקרים חדשים דיווחו על תוצאות מבטיחות רבות לשיפור יעילות הריפוי של הגידים tendinopathy באמצעות גורמי גדילה, תאי הגזע מבוסס טיפול וג'ין טיפול10,11,12.
באמצעות ביקורת ספרות, מצאנו כי המחקרים מעורב ניתן לחלק לשתי קטגוריות מבוסס על חומרים ניתוח שלהם: חיה דגמים כמו חולדה, עכבר או ארנב; לדוגמניות אנושיות. לגבי המודל בעלי חיים, כיום ישנם שתי שיטות פופולרי כדי להפיק tendinopathy: אינדוקציה כימי של פציעה או מכונות העמסת המודל. עם זאת, כל דגם בעלי חיים היה מוגבל מתרבה tendinopathy האנושית מורכבת פתולוגיה13,14.
רוב המסמכים באמצעות דגימות האנושי נותחו בהיסטולוגיה או ביצע את במבחנה הניסוי המבוסס על tenocyte אנושי בריא ולא ניוון tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. רק על כמה מסמכים דיווחו כי הם השתמשו tenocyte ניוונית של האדם, אך הם לא מתארים בפרוטרוט את פרוטוקול המשמש כדי לקבל את tenocyte ניוונית מ האנושי22,23. בהקשר זה יצוין כי תוצאות מוצלחות מן המודל בעלי חיים או את הרקמות/tenocyte בריא מאי לא בהכרח לנבא את היעילות האנושית או מינון אפקטיבי כי ניוון בגיד הוא תהליך מסובך והוא בפתוגנזה עדיין לא לגמרי מובן.
באופן קולקטיבי, זה הכרחי לתאר את הפרוטוקול הסטנדרטי להשגת את tenocyte ניוונית של רקמה אנושית מבלי לגרום תופעות לוואי על התורם. מאמר זה מתאר פרוטוקול על איך לרכוש את tenocyte ניוונית אנושי. כדי לאמת את הפרוטוקול, נותחו בהיסטולוגיה הרקמות שנקטפו. לאחר מכן, לתא בתרבית אושר כמו tenocyte ניוונית באמצעות immunocytochemistry (ICC), של כמותיים בזמן אמת-תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) ואת וזמינותו של הכדאיות.

<table><tbody><tr><td>אזמל</td><td>Kisanbio</td><td>KS-Q0306-15</td><td>מס' 15</td></tr><tr><td>מיני להב</td><td>בונה</td><td>374769</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"מ חומצה אסקורבית-2-פוספט</td><td>תמיסה</td> אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית Sigma-Aldrich <td>A5960</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>4% פורמלדהיד</td><td>Bio-solution</td><td>BP031</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X100-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Rdtech</td><td>C0082</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P9416-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>MKX (C-5)</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-515878</td><td></td></tr><tr><td>טנומודולין (N-14)</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-49325</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה פלואורסצנטית בינונית</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Dojindo Molecular Technologies</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>BrdU ערכת בדיקת התפשטות</td><td>תאים טכנולוגיית איתות תאים</td><td>#6813</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master</td><td>Mix Applied Biosystems</td><td></td> 4369016-GAPDH <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> Hs02786624_g1-COL3A1 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> Hs00943809_m1-ACTA2 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> Hs00426835_g1-TAC1 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>Hs00243225_m1</tr><tr><td>TACR1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00185530_m1</td><td></td></tr><tr><td>PTGS2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00153133_m1</td><td></td></tr><tr><td>ACTB</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs99999903_m1</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאים (100 ומיקרו; m)&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבות 100 מ"מ</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>8188207</td><td></td></tr><tr><td>8 בארות שקופיות תא</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>96 היטב ברור שטוח תחתון פוליסטירן מטופל TC מיקרופלטות</td><td>קורנינג</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>ניקון אקליפס 50i מיקרוסקופ&nbsp;</td><td>קורא מיקרו-פלטות מקסימלי של Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VERSA&nbsp;</td>התקנים <td></td><td></td><td>מולקולריים</td></tr><tr><td>CFX96 מערכת זיהוי PCR בזמן אמת</td> תמיסת <td>פורמלין ביו-ראד</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>חוצץ ניטרלי, 10%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>פרפינים</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801340</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>JUNSEI CHEMICAL</td><td>90303-2185</td><td></td></tr><tr><td>המטוקסילין</td><td>DAKO</td><td>CS70030-2</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>DAKO</td><td>CS70130-2</td><td></td></tr><tr><td>כחול אלציאני</td><td>DAKO</td><td>AR16011-2</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>JUNSEI CHEMICAL</td><td>25165-0430</td><td></td></tr><tr><td>פרוקסידאזות אנדוגניות&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>S200380-2</td><td></td></tr><tr><td>קנדה בלזם</td><td>JUNSEI CHEMICAL</td><td>23255-1210</td><td></td></tr><tr><td>להב מיקרוטום</td><td>FEATHER</td><td>A35</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td>SUPERIOR</td><td>1000612</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>101050</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VEGF סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-7269</td><td></td></tr><tr><td>SPSS תוכנה</td><td>IBM</td><td></td><td>Ver. 18.0</td></tr><tr><td>צנטריפוגה רב תכליתית</td><td>LABOGENE</td><td>1248R</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול לרכוש את tenocyte ניוונית של בני אדם

A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans

Tendinopathy, מצב כואב שמתפתח בתגובה ניוון בגיד, נמצאת בעלייה בעולם המפותח בשל הגדלת פעילות גופנית, תוחלת חיים ארוכה יותר. למרות השכיחות הגוברת שלה, המשמש כבסיס בפתוגנזה עדיין נשאר לא ברור, הטיפול הוא בדרך כלל סימפטומטי. לאחרונה, אפשרויות טיפוליות רבות, לרבות גורמי גדילה, תאי גזע, ריפוי גנטי, נחקרו בתקווה לשיפור את הפוטנציה הריפוי של הגיד ניוונית. עם זאת, הרוב המכריע של מחקרים אלו נערכו רק על מודלים בעלי חיים או tenocytes אדם בריא. למרות מחקרים באמצעות tenocytes פתולוגית, לפי מיטב ידיעתנו אין כרגע שום פרוטוקול המתאר כיצד ניתן להשיג את האדם tenocytes ניוונית. מטרת מחקר זה היא לתאר את פרוטוקול תקני לרכישת tenocytes ניוונית אנושי. בתחילה, הרקמה גיד היה נקצרו מחולה עם epicondylitis לרוחב במהלך הניתוח. אז נלקחו דגימות ביופסיה פושט carpi radialis הקצר הגיד המתאימים לשינויים מבניים ציין בזמנו של הניתוח. כל הגידים שנקטפו נראה משעמם, אפור, לעזאזל, בצקי, אשר הפך את אותם ויזואלית שונה מזו הבריאים. Tenocytes היו תרבותי ומשמשים לניסויים. בינתיים, מחצית הרקמות שנקטפו נותחו בהיסטולוגיה, זה הוצג כי הם חלקו את אותן תכונות מפתח של tendinopathy (angiofibroblastic דיספלזיה או היפרפלזיה). ניתוח משני מאת immunocytochemistry אישר כי התאים בתרבית היו tenocytes עם רוב התאים שיש כתמי חיובי המוהוק, tenomodulin חלבונים. האיכויות של הטבע ניוונית של tenocytes ואז נקבעו על-ידי השוואת התאים הפקד בריא שימוש assay התפשטות או לרביעיית-PCR. Tenocyte ניוונית מוצג שיעור גבוה יותר של התפשטות דפוסים דומים של ביטוי גנים של tendinopathy שתאמו את הדוחות הקודמים. בסך הכל, פרוטוקול חדש זה עשוי לספק כלי שימושי עבור מחקרים עתידיים של tendinopathy.

ניתוחים היסטולוגית חשף כי הרקמה שנקטפו מן epicondylitis לרוחב היו המאפיינים גיד tendinopathic. סעיף H &amp; E של גיד ניוונית tendinopathy חשף צרור קולגן לא מאורגן עם הפסד של קוטביות ומבנים בסדר ישר, חריפה ארוזה סיבים מקבילים. רמיזות של ניוון כגון cellularity גבוה יותר, גרעינים מוגדלת בלי צורת פלך טיפוסי היסטולוגית סימנים היו נפוצים בדגימות. בנוסף, צרורות הקולגן של הגיד מנוונת היו אאוזין חלשה יחסית מוכתמת H &amp; E, אבל באופן חיובי היו מוכתמת כחול Alcian המציינת את החומר proteoglycans ו- g...

השתמש במבחנה של tenocytes ניוונית חיוני כאשר החוקר את היעילות של טיפול חדשניים על tendinopathy. עם זאת, רוב המחקרים להשתמש רק את המודל החייתי או של tenocyte בריא. אנו מציעים הפרוטוקול. הבא כדי לבודד tenocytes ניוונית אנושי במהלך הניתוח.

פרוטוקול לרכוש את Tenocyte ניוונית של בני אדם

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ביולוגיה של טנוציטים ניווניים אנושיים מכיוון שרק מחקרים מעטים תיארו בפירוט בידוד טנוציטים ניווניים אנושיים ותרבית. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שאנו יכולים להשיג טנוציטים ניווניים אנושיים ללא פגיעה נוספת בחולה מכיוון שהרקמה הניוונית נרכשת במהלך ניתוח אפיקונדיליטיס סטנדרטי. ידגימו את ההליך ד"ר סו-הונג האן, מינג'ונג בק והיונג קיונג קים מהרמה השלישית שלי.כדי לרכוש דגימת רקמת גידים ניוונית, השתמש באזמל כירורגי מספר 15 כדי לבצע חתך עור של שלושה עד חמישה סנטימטרים רק קדמי מדיאלי לאפיקונדיל הרוחבי, ופרוקסימלי לרמת המפרק כדי לחשוף את המרפק הצדדי ולאתר חזותית את ה-extensor carpi radialis longus בממשק ה-extensor aponeurosis. השתמש באזמל כדי לבצע חתך פיצול בעומק של שניים עד שלושה מילימטרים בין ה-extensor carpi radialis longus לבין ה-extensor aponeurosis בממשק. לאחר נסיגה קדמית של ה-extensor carpi radialis longus, אתר את הרקמה הניוונית הפתולוגית לפי צבעה האפרפר העמום האופייני ורקמה בצקתית ופריכה בדרך כלל, והשתמש באזמל ובמיני להבים כדי לכרות בזהירות, אך בחדות, את כל הרקמה הניוונית.לאחר שנקצרה כל הרקמה, סגרו את הפצע בחומר תפר שאינו נספג על פי הפרוטוקולים הסטנדרטיים והסירו בזהירות את כל הרקמה שמסביב מחתיכת דגימת רקמה של סנטימטר מעוקב אחד, והניחו את רקמת הגיד הנקייה לתוך 10 מיליליטר PBS ברגע שהיא נחתכה. לאחר מכן יש לתקן כמחצית מהרקמה שנקטפה בפורמלין ניטרלי של 10% במכסה אדים כימי למשך 12 שעות. כדי להקים תרבית טנוציטים, העבירו את המחצית השנייה של דגימות הבקרה והרקמות המנוונות שנקטפו לתוך צלחות תרבית רקמה בודדות המכילות PBS טרי וטחנו את הרקמות למטר מעוקב אחד או חתיכות קטנות יותר, עכלו את שברי הרקמה ב-30 מיליליטר DMEM בתוספת 30 מיליגרם למיליליטר קולגנאז שניים לקבוצת רקמות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.בתום העיכול, סנן את תמיסות התאים דרך מסנני תאים בודדים של 100 מיקרון והשבת את הקולגנאז עם מיליליטר אחד של FBS לכל צינור. אסוף את הטנוציטים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדורים בשלוש פעמים 10 עד חמישית תאים לכל 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% ריכוז תמיסה אנטי-פטרייתית. לאחר מכן, זרעו את התאים לתוך צלחת תרבית אחת של 100 סנטימטר לכל מצב, ותרבו את הטנוציטים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שבוע אחד, והחליפו את מדיום התרבית כל שלושה ימים עד שמגיעים למפגש של 80%.לניתוח אימונוציטוכימי, העבירו פעמיים פי 10 לתאים החמישיים ב-200 מיקרוליטר של מדיום טרי לכל באר של מגלשת תא אחת של שמונה בארות לכל קבוצת ניסוי וגדלו את התאים למפגש למשך 24 שעות. למחרת יש לשטוף את התאים עם PBS, ואחריו קיבוע עם 500 מיקרוליטר של 4% פורמלדהיד לבאר, וחדירות עם 0.5% טריטון X 100 ב- PBS למשך 10 דקות. כדי לחסום כל קשירה לא ספציפית, דגרו על התאים עם 1% אלבומין בסרום בקר, ו-0.05% Tween 20 ב-PBS, בהתאם לניסוי, ולאחר מכן דגירה עם הנוגדנים הראשוניים המעניינים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה מוגנים מאור.למחרת בבוקר, סמנו את התאים עם הנוגדנים המשניים המתאימים למשך שעה בטמפרטורת החדר מוגנים מפני אור, והרכיבו את הדגימות עם 0.5 מיקרוליטר של מדיום הרכבה פלואורסצנטי מתאים לכל תא. לאחר מכן צלמו את הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת מטרה של פי 400. לניתוח פתולוגי של הרקמה, יש להטמיע את דגימות רקמת הבקרה והגידים המנוונות בארבעה עד חמישה מיליליטר פרפין ולרכוש ארבעה עד חמישה חלקי מיקרון מכל גוש פרפין.עבור המטוקסילין באאוזין, או צביעת H&E, הפחיתו את הדגימות עם שלוש טבילות של חמש דקות בקסילן ולאחר מכן הידרציה עם טבילות אתנול מדורגות ושטיפת מי ברז של שתי דקות. לאחר מכן, סמנו את הדגימות בהמטוקסילין למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטיפה נוספת של שתי דקות במים. טבלו את הדגימות השטופות בחומצה הידרוכלורית 1% ואתנול 70% למשך שלוש שניות, ולאחר מכן שטיפה במים של שלוש דקות.נטרלו את החומצה עם טבילה של 10 שניות ב-0.5% אמוניה, ולאחר מכן שטיפת מים נוספת של שלוש דקות. סמנו את הדגימות המנוטרלות עם האאוזין למשך חמש דקות, וייבשו את הדגימות המוכתמות ב-H&E בטבילות אתנול מדורגות. לאחר שלוש טבילות קסילן, הרכיבו את הדגימות עם אמצעי הרכבה מתאים ושקופית כיסוי.כדי לבצע ניתוח אימונוהיסטוכימי של דגימות הרקמה, השתמש בערכת הזיהוי המעודנת של פולימר הקשר בהתאם להוראות היצרן עם השינויים הקלים הבאים. לאחר דה-פרפיניזציה עם קסילן כפי שהודגם, טבלו את הדגימות בתמיסת אחזור אפיטופ קשר למשך 30 דקות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס לאחזור אנטיגן, ולאחר מכן דגירה של חמש דקות במי חמצן כדי להרוות כל פרוקסידאז אנדוגני. לאחר מכן, סמן את החלקים למשך רבע שעה בטמפרטורת החדר עם הנוגדנים העיקריים המעניינים.בתום הדגירה, סמן את הדגימות במערכת הנוגדנים המשנית המתאימה ללא ביוטין ללא ביוטין פרוקסידאז למשך 50 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הרכיבו את החלקים עם החלקת כיסוי באמצעי ההרכבה המתאים וצלמו את הדגימות במיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 400. ניתוחי H&E מגלים כי רקמה שנאספה מהאפיקונדיליטיס הצדדי המנוון מדגימה צרורות קולגן לא מאורגנים עם אובדן קוטביות ומבני סיבים מקבילים עדינים, ישרים וארוזים חזק.ואכן, צרורות הקולגן חיוביים לצביעה כחולה אלציאנית בקטעי הרקמה המנוונים, מה שמעיד על נוכחות מוגברת של פרוטאוגליקן וגליקוזאמינוגליקן בתוך הרקמה הפגועה. ניתוח אימונוהיסטוכימי של הגידים המנוונים מצביע גם על תגובה חיובית גרגירית ציטופלזמית לגורם גדילה אנדותל כלי דם שאינה נצפית בדגימות רקמת גיד בקרה בריאה. ניתן לאשר את שני סוגי תאי דגימת הרקמה המתורבתים כטנוציטים על ידי אימונופלואורכימיה, כאשר רוב התאים המתורבתים מבטאים סמני טנוציטים מייצגים כגון חלבוני המוהוק והטנומודולין ומפגינים מראה מוארך.יש לציין כי הטנוציטים הניווניים מפגינים גם קצב התפשטות גבוה יותר בתרבית בהשוואה לטנוציטים שנקטפו מבקרות בריאות, כמו גם ביטוי גבוה יותר של גנים מרובים הידועים כקשורים להתפתחות גידים. לסיכום, פרוטוקול מתוקף זה המשתמש בטנוציטים ניווניים סולל את הדרך למחקרים עתידיים בביולוגיה של גידים ולבדיקת התערבויות חדשות.

a-protocol-to-acquire-the-degenerative-tenocyte-from-humans

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמרה ישירה של פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסטים מתפקדים ויציבים לחלוטין על ידי ביטוי יתר של Tfap2c, Gata3, Eomes ו-Ets2.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

כתב היד הזה מפרט את ייצור של רקמות מיקרו- רקמות מהונדסות ברשתות עצביות: מבנים תלת-מימדיים בגודל מיקרון המורכבים משטחים אקסונליים ארוכי טווח המקיפים אוכלוסייה נוירונית מצטברת (s), המצופים בהידרוגול צינורי. אלה הפיגומים החיים יכולים לשמש ממסרים תפקודית לשחזר או לווסת מעגלים עצביים או כמו מיטות בדיקה ביופידלית מחקה נוירונטומי חומר אפור לבן.

אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

אנו מציגים כאן עבור הבידול בתאי גזע pluripotent המושרה אנושי לתוך כל נגזרת somite (myotome, sclerotome, פלסטיים ו syndetome) פרוטוקול בתנאים מוגדרים כימי, אשר יש יישומים בדוגמנות מחלות בעתיד, טיפולים מבוססי תא לכירורגיה אורטופדית.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

אנו מציגים טכניקות עבור בידוד, culturing, אפיון, וההבחנה תאים האדם העיקרי שריר השריר (hMPCs) המתקבל רקמת שריר השלד ביופסיה.  hmpcs התקבל ומאופיין באמצעות שיטות אלה ניתן להשתמש לאחר מכן לכתובת מחקר שאלות הקשורות מיוגנזה האדם התחדשות השלד שריר.

בידוד, תרבות, אפיון, והבידול של תאים האדם שריר ביופסיה של השלד שרירי השגרה נוהל

תלת-מימדי גירוי מכני מכאני מערכת ביוריאקטור הוא ביווריקטור אידיאלי עבור הבחנה מסוימת של הבידול בתאי גזע הנגזר גיד והיווצרות גיד ניאו.

החלת גירוי מכני תלת מימדי ביוריאקטור מערכת לגרום לבידול Tenogenic של תאי גזע הנגזר גיד

פרוטוקול זה מתאר את ההמרה של פיברובלסטים בעור לתוך myoblasts ואת הבידול שלהם myotubes. קווי התאים נגזרים מחולים עם הפרעות נוירומוסקולריות וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות.

תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להשתלה ולמעקב אחר תאים עצביים מסומנים באורגנואידים מוחיים אנושיים.

מודל אורגנואיד מוחי אנושי להשתלת תאים עצביים

מאמר זה מתאר הליך לייצור iTenocytes על ידי יצירת תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם ב-iPSC עם ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס באמצעות וקטור לנטי-ויראלי ומתיחה חד-צירית באמצעות ביוריאקטור דו-ממדי.

יצירת iTenocytes פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע באמצעות ביטוי יתר משולב של סקלרקסיס ומתח חד צירי דו-ממדי

כאן, אנו מציגים מערכת מודל אסמבלואיד המחקה את ההצלבה התאית של הגידים בין רקמת הליבה של הגיד נושא העומס לבין תא חיצוני המכיל אוכלוסיות תאים המופעלות על ידי מחלה ופציעה. כמקרה שימוש חשוב, אנו מדגימים כיצד ניתן לפרוס את המערכת כדי לחקור הפעלה רלוונטית למחלה של תאי אנדותל חיצוניים.

הנדסת מכלולי גידים לבדיקת הצלבה תאית במחלה ותיקון

כאן אנו מדגימים מודל אורגנואיד תלת שלבי (הרחבה דו-ממדית [2D], גירוי דו-ממדי, הבשלה תלת-ממדית [3D]) המציע כלי מבטיח למחקר בסיסי בגידים ושיטה פוטנציאלית ללא פיגומים להנדסת רקמות גידים.

הדגמה של תרבית יריעות תאים בהרכבה עצמית ויצירה ידנית של אורגנואיד תלת-ממדי דמוי גיד/רצועה באמצעות פיברובלסטים עוריים אנושיים

אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי לעיבוד כליות אנושיות שלמות כדי לבודד ולתרבית תאי אפיתל של צינורית פרוקסימלית ראשונית של הכליה ויישום תאים אלה בפלטפורמה תלת מימדית, מיקרופלואידית, מיקרופיזיולוגית כדי לסכם את הצינורית הפרוקסימלית הכלייתית.

בידוד תאי אפיתל פרוקסימליים ראשוניים אנושיים והשימוש בהם ביצירת מודל מיקרופיזיולוגי של הצינורית הפרוקסימלית הכלייתית

למד פרוטוקול לבידוד טנוציטים ניווניים אנושיים במהלך ניתוח אפיקונדיליטיס. השיטה מאפשרת איסוף רקמה ללא פגיעה נוספת במטופל ומספקת משאב יקר ערך למחקר טנדינופתיה.

פרוטוקול לרכוש את Tenocyte ניוונית של בני אדם

גלה סרטונים נוספים