Name: בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: למדו כיצד לכמת כוחות בליטה בתאים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. השיטה כוללת הכנת רשתות מצופות פולימר, הדבקת תאים ודימות הסרט התואם. המחקר מספק תובנות לגבי מנגנוני הידבקות תאית ומכניקה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים אנה Labernadie, גיום Charrière, פטריק Delobelle על תרומתה הראשונית לעבודה זו, מתיו סנצ'ז, פרנסואז Viala על עזרתם עם צילום וידאו ועריכה. עבודה זו היא נתמכה על ידי l'Agence נאסיונאל דה לה Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Médicale רשרש (עקרות DEQ2016 0334894), INSERM תוכנית סרטן, סרטן Fondation טולוז, הגבול האנושי המדע תוכנית (RGP0035/2016).

1. הכנת רשתות מצופים Formvar
<ol><li>מיקרוסקופ אלקטרונים רשתות עם אצטון טהור ונקי ומניחים אותם על נייר סינון. לאחר מכן נקיים שקופית מיקרוסקופ עם אתנול טהור, לנגב עם נייר עדשה, להסיר את האבק עם מפוח.</li>
	<li>מקום של שקופיות זכוכית ניקיתי אתנול אנכית המשפך של מכשיר הליהוק סרט המכיל פתרון של Formvar בחלק התחתון. לכסות את החלק העליון של המשפך.</li>
	<li>משאבת 100 מ של Formvar פתרון (0.5% באתילן dichloride) עם הנורה atomizer ב עד רמת מגיע שני שלישים של השקופית.</li>
	<li>לשמור את השקופית הפתרון עבור 1 דקות.</li>
	<li>. פתח את הברז של המכשיר כדי לנקז את הפתרון Formvar ב זרם קבוע קצב זרימה של 10 עד 15 מ ל/s תניב סרט Formvar של 30-80 ננומטר. העובי של הסרט נקבעת על ידי הריכוז של הפתרון Formvar על ידי קצב ניקוז. הערה: קצב ניקוז יכול להיות נשלט על-ידי איוור את הלחץ באמצעות שסתום האוויר החוצה על-ידי לאט פתיחת המסתם. מהר יותר הניקוז, עבה הסרט. בפועל, כי זה קשה לחזות את עובי הסרט לפי קצב זרימה Formvar, אנו להכין מספר אצוות של סרטים Formvar ולשלוט עובי שלהם על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (ראה שלב 2).</li>
	<li>הסר את השקופית מן החדר, לייבש אותו בעדינות על נייר סינון כדי להסיר את כל Formvar נוזלי.</li>
	<li>גוזרים מלבן 20 מ"מ x 50 מ"מ מהסרט Formvar עם סכין גילוח.</li>
	<li>מילוי גביע עם מים מזוקקים נקיים, לאט מזנקת השקופית אנכית אל המים לעוף. הסרט: הסרט אמור לצוף על פני המים.</li>
	<li>מקום יבש ניקיתי אצטון רשתות על הסרט, מבריק פונות למעלה.</li>
	<li>המקום של coverslip זכוכית עגול (Ø 12 מ מ) על כמה מן הרשתות. Coverslip זה ישמש כדי למדוד את עובי הסרט (ראה שלב 2).</li>
	<li>מכסים שקופית מיקרוסקופ עם מדבקה לבנה, גודלה משתנה כך שיתאים. טובלים את השקופית אנכית על הגבול של הסרט Formvar צף עד כל הסרט לאנאפוליס השקופית. להסיר את המים העודפים השקופית עם נייר סינון ולתת לזה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה.</li>
</ol>2. מדידת עובי הסרט
<ol><li>חותכים את Formvar סביב coverslip עם פינצטה כדי לנתק את זה מתוך השקופית.</li>
	<li>סמן את המיקום של הרשת תחת coverslip עם עט.</li>
	<li>חותכים את Formvar מרחבי הרשת מסומן כדי לנתק אותו מן coverslip. לכן יהיה חור בגליון Formvar הנותרים, שיאפשר למדוד את עובי הסרט. לכסות את coverslip עם PBS והנח אותו על משטח זכוכית על המיקרוסקופ.</li>
	<li>הר של זיז ניטריד סיליקון על הבלוק זכוכית מיקרוסקופ כוח אטומי, מוודא שהפס הזהב אינו מכוסה על-ידי הקצה של האביב. הערה: הרגישות ואת קבוע הקפיץ הזיז צריך לקבל קודם לכן היה מכויל ב- PBS.</li>
	<li>לטעון את גוש זכוכית על גבי המודול AFM ולאחר מכן הצב את המודול לתוך המיקרוסקופ.</li>
	<li>מניחים את coverslip מצופים Formvar על תא תצפית, לכסות את זה עם µL 500 ל- PBS.</li>
	<li>סרוק את הגבול של החור בגליון Formvar באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי ב מצב הקשר ונקודת ערכת כוח 0.5 nN.</li>
	<li>פני השטח coverslip זכוכית כהפניה למדידות גובה ושימוש להעריך את עובי Formvar כמו הגובה של חתך הרוחב (לבצע מדידות לפחות 10 לכל Formvar אצווה).</li>
</ol>3. זריעת תאי על רשתות
<ol><li>ברדס סטרילי, לשים רצועה (12 מ"מ x 3 מ"מ) של דבק דו צדדי coverslip.</li>
	<li>לגזור רשת מצופה Formvar עם פינצטה ושים אותו הפוך על רצועת דבק (רק השפה של הרשת צריך לצרף את הקלטת). הסרט Formvar צריך להתמודד עם coverslip.</li>
	<li>לשים התקן זה תרבות היטב.</li>
	<li>המקום droplet 10 µL של RPMI ללא FCS המכיל 104 מקרופאגים תריז ומונוציטים האנושי16. הערה: הקפד לא לגעת הרשת עם הטיפ פיפטה כדי למנוע פגיעה הציפוי Formvar.</li>
	<li>תקופת דגירה של 30 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) לתת תאים ולהתבטא.</li>
	<li>למלא את הבאר עם 2 מ של RPMI המכיל 10% FCS.</li>
	<li>דגירה את המכשיר עבור 2 h-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לתת תאים לדבוק לפני התצפית AFM.</li>
</ol>4. טופוגרפיה מדידות של העיוותים הנוצרות על-ידי Podosome
<ol><li>תוקע שתי רצועות של דבק צדדית הוכפל על רצפת הזכוכית צלחת פטרי. הערה: המרחק בין שתי רצועות צריך להיות קטן יותר הקוטר רשת.</li>
	<li>ניתוק בקפידה את רשת מצופה מקרופאגים מהקלטת דבק.</li>
	<li>הפוך את הרשת על מנת לקבל את התאים מול הזכוכית ולהישאר ברשת בין שתי רצועות דבק.</li>
	<li>תיקון הרשת עם שתי רצועות חדש דבק צדדית הוכפל: הרשת ובכך להיות דחוקה בין שתי רצועות דביקות, עזיבת האזור המרכזי של הרשת להנגיש הטיפ AFM. הערה: ודא כי הרשת טוב קבוע, לא המעוות; אחרת הזיז AFM לא יוכל להתקרב השטח Formvar.</li>
	<li>למלא את צלחת פטרי עם 2 מיליליטר מחומם מראש-37 ° C תרבות בינוני (RPMI עם 10% FCS) בתוספת 10 מ מ HEPES (pH 7.4).</li>
	<li>במקום המנה תרבות על תנור מנה 37 º C.</li>
	<li>להתקין את התנור מאכל על הבמה AFM.</li>
	<li>. תן למערכת ייצוב ב 37 º C.</li>
	<li>במצב קשר עם כוח 0.5 nN, להפוך תמונה הגלובלית הראשונה לאתר podosomes, ולאחר מכן סרוק את הטופוגרפיה Formvar-3 הרץ עם פיקסל nm-גדול כ-20. הערה: להימנע סריקה בקרבת קצות הרשת.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Forces+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Forces in Cell Biology.</a> Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).</li>
<li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343(2014).</li>
<li>Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+Together%3A+Spatial+Synchrony+in+the+Force+and+Actin+Dynamics+of+Podosome+First+Neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors.</a> ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).</li>
<li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Migration+of+Macrophages+Requires+Hck+for+Podosome+Organization+and+Extracellular+Matrix+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis.</a> Blood. 115, 1444-1452 (2010).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Leukocytes+and+Macrophages+of+Various+Phenotypes+Have+Distinct+Abilities+to+Form+Podosomes+and+to+Migrate+in+3d+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments.</a> European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).</li>
<li>Guiet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Mesenchymal+Migration+Requires+Podosome+Stabilization+by+Filamin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).</li>
<li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Macrophage+3d+Migration%3A+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Review%22%5BJournal%5D)">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+Phosphorylation+of+Wiskott-Aldrich+Syndrome+Protein+%28Wasp%29+by+Hck+Regulates+Macrophage+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).</li>
<li>Van Goethem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Podosomes+Go+3d%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Podosomes Go 3d.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).</li>
<li>Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Architecture+Dictates+Three-Dimensional+Migration+Modes+of+Human+Macrophages%3A+Differential+Involvement+of+Proteases+and+Podosome-Like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures.</a> Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).</li>
<li>Verollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiv-1+Reprograms+the+Migration+of+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages.</a> Blood. 125, 1611-1622 (2015).</li>
<li>Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podosome+Force+Generation+Machinery%3A+A+Local+Balance+between+Protrusion+at+the+Core+and+Traction+at+the+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring.</a> ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).</li>
<li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory%2FEffector+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li>
<li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li>
<li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li>
<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
</ol>

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

תכונות החומר
הבחירה של החומר עבור ממברנה deformable, במקרה שלנו Formvar, צריך למלא כמה דרישות. החומר חייב להיות שקוף האור הנראה ולהציג קרינה פלואורסצנטית אוטומטי מוגבלת כדי לאפשר תצפיות בשדה בהירים ואת פלורסצנטיות מיקרוסקופ. המראה המחוספס של הסרט דק חייב להיות מתחת 10 ננומטר כדי להימנע הטופוגרפי השפעה על התא אדהזיה וכדי לאפשר תצפית ברורה של בליטות המושרה תא על-ידי הדמיה AFM. בסופו של דבר, הנוקשות של הקרום, אשר תלויה מודולוס של הצעירים, עובי החומר, צריך להיות גבוה מספיק כדי לגר...

תאים בעלי חיים אינטראקציה פיזית עם המטריקס, התאים האחרים המהווים את הסביבה שלהם1. פעולה זו נדרשת כדי להעביר, להפנים גופות, לרכוש מידע חיצוני או להבדיל. בתהליכי כזה, התא צריך להקרין כוחות מכני ומשפיע, כמו מחקרים רבים הראו בשנים האחרונות, היכולת של תא כדי ליצור כוחות, לחקור את הסביבה שלה התנהגות ביולוגית, בימוי למשל התפשטות או בידול2,3. בתורו, המדידה של כוחות הסלולר היא מכשיר מרכזי לימוד ויסות כוח הדור ולהבין את המשמעות שלה תא התנהגות ורקמות גורל4,5.
בשנים האחרונות עדים על התפתחות טכניקות רבות כדי למדוד את הכוחות תא יכול להפעיל על הסביבה שלה6. רוב אלה סייעו חושפים שהמתיחה כוחות כי תאים להפעיל כפי שהם מושכים על הגששים ניידים או מצע deformable. עם זאת, הכוחות מכניים מעורבים בליטה לסביבת חוץ-תאית סובלים מחסור של טכניקות מדידה והם עד היום לא טוב מאופיין.
כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מציגים שיטה למדידת כוחות המופעל orthogonally אל המצע. זה מורכב ב ציפוי חיים תאים בגיליון אלסטי דק אשר ניתן לעוות בכיוון אורתוגונלית, דבר המאפשר למדוד דפורמציה המצע על ידי התאים ולהסיק את הכוחות המעורבים. המצע הטופוגרפיה נמדד עם רזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, הערכת כוחות של דפורמציה מסתמך על הידע של הגיאומטריה של מבנים הסלולר protrusive7,8, 9.
כאן, אנו מתארים את הכיוונון ויישומה למדידת הכוחות שנוצר על ידי podosomes, מבנים אדהזיה protrusive הנוצרת על-ידי מקרופאגים להעברת mesenchymal שלהם סביבות תלת-ממדי10,11, 12,13,14,15,16,17. אנו מאמינים כי טכניקה זו תקדם את ההבנה של יצירת כח ורגולציה שלה בתהליכי הסלולר רבים המערבים בליטה.

<table><tbody><tr><td>רשתות ניקל 200 רשת</td> אלקטרונים <td>מיקרוסקופיה מדעי</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>מדבקות לבנות 26 x 70 מ"מ</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר יציקת סרט עם שסתום ביציאה שלו</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>פורמבר 0.5% תמיסה באתילן דיכלוריד</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>12 מ"מ כיסויים</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כוח אטומי</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק דגימה מבוקרת טמפרטורה&nbsp;</td>שלוחת סיליקון ניטריד <td>של JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>עם קבוע קפיץ נומינלי של 0.01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>סרט דבק דו צדדי</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי 35 מ"מ עם תחתית זכוכית</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

בהקשרים ביולוגיים רבים, תאים בעלי חיים צריך אינטראקציה פיזית עם הסביבה שלהם על ידי פיתוח כוחות מכני. בין אלה, כוחות המתיחה היה מאופיין היטב, אך יש חוסר של טכניקות המאפשר מדידת כוחות בליטה שהופעל על ידי תאים orthogonally המצע שלהם. תיכננו התקנה ניסיוני. למדידת כוחות בליטה שהופעל על ידי תאים חסיד על המצע שלהם. תאי ציפוי על גליון Formvar תואם לעוות את המצע, הטופוגרפיה וכתוצאה מכך ממופה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) את המשקל ננומטר. כוח ערכים המחולצים ואז ניתוח של הפרופיל דפורמציה בהתבסס על הגיאומטריה של המבנים התאיים protrusive. לפיכך, ניתן למדוד את הכוחות שהופעל על ידי היחידות בולט בודדים של תא חי לאורך זמן. טכניקה זו תאפשר המחקר של יצירת כח ורגולציה שלה בתהליכי הסלולר רבים המערבים בליטה. כאן, אנו מתארים את היישום שלה כדי למדוד את הכוחות protrusive שנוצר על ידי podosomes הנוצרת על-ידי מקרופאגים אנושי.

הפרוטוקול הנ ל מתאר כיצד להכין את הגדרת הניסוי לכמת חדירת כוחות שהוחלו על-ידי macrophage podosomes על מצע Formvar. זו מושגת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, מודגם באיור1.
בעת ניתוח תמונת הטופוגרפי של גבשושיות וזיזים מתחת podosomes שימוש בתוכנת עיבוד נתונים JPK, פולינום מדרגה שלישית מתאים צריך להיות מופחתים מכל שורה הסריקה באופן עצמאי. הגובה המרבי של podosome-induced בליטות יכול להיות מוערך על ידי הוספת ...

כאן, אנחנו מפרטים את הטכניקות ניסיוני המשמשים להערכת כוחות בליטה podosomes להחיל על סרט תואם, משלב הכנת הסרט לניתוח אוטומטי של תמונות הטופוגרפי.

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת כוחות בליטה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. זה מושג על ידי הכנת הרשתות המצופות בנוסחה ומדידת עובי הסרט הזה. השלב השלישי של תהליך זה מורכב מהושבת תאים על הרשתות והשארתם להיצמד.השלב האחרון של ההליך הוא הדמיית סרט הפורמה מתחת לתאים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. כאשר נצמדים למצע, מיקרופאג'ים יוצרים מבני הידבקות תת-מיקרומטריים הנקראים פודוזומים. בסופו של דבר, העיוות של הסרט המשמש פודוזומים יכומת ויומרה לכוחות באמצעות מודל מכני תוצרת בית.הנח אור זכוכית נקי אתנול לתוך מכשיר יציקת סרט המשפך וכסה את החלק העליון של המשפך. הזז את תמיסת הפומבר למעלה לתוך המשפך עד שהמפלס יגיע לשני שליש מהשקופית. השאירו אותו למשך דקה אחת ואז סננו את תמיסת הפורמוואר בזרם קבוע.שימו לב שעובי הסרט תלוי הן בקצב הזרם והן בריכוז תמיסת הפורמבר. טפחו על האור הזה, יבשו בחושך וחתכו מלבנים בעזרת סכין גילוח חד. טבלו את המגלשה בכוס המלאה במים מזוקקים כך שסרט הפומבר יצוף על פני המים.הניחו בזהירות רשתות נקיות של אצטון על הסרטים, מבריקים עם הפנים כלפי מעלה עם החלקת כיסוי בקוטר 12 מילימטר על גבי חלקם. הם ישמשו לניסוי הערכת העובי. בסופו של דבר טבלו שקופית מכוסה מדבקה כדי לשחזר את כל הסרט והרשתות.מתאר את החלקה המכוסה בזכוכית בעזרת פינצטה כדי לחתוך את הפורמוואר ולנתק אותו מהשקופית. הרכיבו את מיקום הרשת מתחת להחלקה המכוסה ואז מתארים את הרשת בפינצטה כדי למשוך אותה. החור בסרט הפומבר שנוצר כך יצולם כדי למדוד את עוביו.התקן סיליקון חנקתי בבלוק הזכוכית AFM וודא שהפס הזהוב אינו מתחת לקצה הקפיץ. התקן את גוש הזכוכית על מודול AFM ולאחר מכן הנח את האחרון על המיקרוסקופtage. הנח את תלוש הכיסוי המצופה פומבר על תא התצפית עם PBS למעלה.סרוק את הגבול בין פומבר לזכוכית במצב מגע ועם נקודת ניוטון של 0.5 ננו. בתוכנת עיבוד הנתונים, השתמש במשטח הזכוכית כהתייחסות לגובה, ומדוד את עובי הפומבר בחתך הרוחב. מתחת למכסה המנוע הסטרילי, בחר פתק כיסוי בגודל 12 מילימטר והדביק עליו רצועה של סרט הצד.מתאר את הרשת המצופה בפינצטה והנח אותה מבריקה עם הפנים כלפי מעלה כך שרק הצדדים שלה יתחברו לדבק. זאת כדי למנוע קריעת פומבר בעת הסרת הרשת מהקלטת. הנח את רצועת הכיסוי בצלחת סטרילית של שש בארות וצנרת בטיפה של 10 מילימטר של מדיום תרבית ללא סרום.הוא אמור להכיל כ -10 אלף תאים ובמקרה זה, מדובר במיקרופגים המובחנים ממונוציטים אנושיים. הקפד לא לגעת ברשת עם קצה הפייפר בתהליך, כדי לא לפגוע בציפוי הפומבר. יש לדגור במשך חצי שעה כדי לתת לתאים להידבק, ואז למלא את הבאר במדיום בתוספת סרום, ולדגור שוב במשך שעתיים, לפני תצפית AFM.הניחו שתי רצועות מקבילות של סרט דו צדדי על צלחת פטרי תחתית זכוכית, וודאו שהרוחב ביניהן מעט קטן יותר, בהשוואה לקוטר הרשת שלכם. לאחר מכן נתק את הרשת שנזרעה בעבר בתאים והנח אותה על גבי שתי רצועות הסרט כשהתאים פונים כלפי מטה. תקן את הרשת על ידי הנחת שתי רצועות נוספות על גבי הרצועות הקודמות.ממלאים את המנה במדיום תרבית שחומם מראש בתוספת hepe's. מניחים את המנה לתנור הכלים שהוגדר בעבר על 37 מעלות צלזיוס. התקן את הסט על AFM tagה.כאשר טמפרטורת המערכת יציבה על 37 מעלות צלזיוס, המשך לסריקה של משטח ה-fomvar, אותו יש לבצע במצב מגע, עם נקודת הגדרה של 0.95 ננו ניוטון וחזותי את העיוותים הקשורים לפרוטוזואה בחלון תצוגת נתוני הסטיה. להלן התוצאות המייצגות ושלבי העיבוד להפקת תצורות עם AFM למדידות הגרפיות. כפי שניתן לראות בתמונה זו, מתגלות בליטות על פני השטח של הפומבר.על מנת להמיר מידע צילומי זה לערכי כוח יש צורך תחילה בגישה להפרש הגבוה המקומי. כדי לעשות זאת יש להפחית התאמה פולינומית מדרגה שלישית לקו הסריקה שלה באופן עצמאי. לאחר מכן השימוש באלגוריתם הדמיה ייעודי תוצרת בית מאפשר להעריך ערכי כוח בליטה ממפת גובה AFM והמודל המכני של בליטה מתווכת פרוטוזואה.הודות לנוהל זה, אנו מסוגלים לחקור את המנגנונים המעורבים ביצירת כוח בליטה אצל פרוטוזואנים. תודה על הצפייה, ובהצלחה על הניסויים שלך.

protrusion-force-microscopy-method-to-quantify-forces-developed-cell

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדמיה מיקרוסקופית של תאים אנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מאפשר אפיון של שינויים דינמיים מבנים cytoskeletal. שלא כמו טכניקות להשתמש דגימות קבוע, שיטה זו מספקת הערכה מפורטת של השינויים הזמני cytoskeleton אקטין בתאי אותו לפני, במהלך ואחרי גירויים פיזיים, תרופתי, או דלקתיים שונים.

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין

מסמך זה מדגים פרוטוקול כדי לאפיין את התכונות מכאניות של תאי חיים באמצעות microindentation באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה micropipette ישירות להחיל כוח מבוקר את הגרעין בתא החי. Assay הזה מאפשר חקירת תכונות מכניות הגרעין בתא חי, חסיד.

בדיקה ישירה כוח למדידת מכני אינטגרציה בין הגרעין של שלד התא

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מבוסס מכניקה כדי לשבש את צומת הפער קונשין 43 ולמדוד את ההשפעה הבאה זה יש על ביומכניקה של אנדותל באמצעות התבוננות של מעקב ומדגיש התרבות.

Perturbing אנדותל ביומכניקה דרך קונשין 43 מבנית שיבוש

פרוטוקול זה מספק הוראות להטמעת ליתופי מולטיפוטון כדי להמציא מערכים תלת-ממדיים של סמנים fiducial פלורסנט מוטבע פולי (אתילן גליקול) מבוססי הידרוג לשימוש כמו ללא התייחסות, כוח המתיחה מיקרוסקופ פלטפורמות. באמצעות הוראות אלה, מדידה של זן חומר תלת-ממד וחישוב של תיחות הסלולר הוא פשוט כדי לקדם תפוקה גבוהה כוח המתיחה מדידות.

ייצור ויישום של פלטפורמת מיקרוסקופית כוח המתיחה ללא התייחסות

כאן אנו מציגים פרוטוקול המשמש לביצוע ניסויי מיקרוסקופ כוח גרירה על תאי B. אנו מתארים את הכנת ג'לים פוליקרילאמיד רכים ואת הפונקציונליזציה שלהם, כמו גם רכישת נתונים במיקרוסקופ וסיכום של ניתוח נתונים.

מיקרוסקופ כוח מתיחה ללמוד B לימפוציטים הפעלת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את התכונות המכניות התאיות של תאי זברה עובריים מבודדים בכליאה תלת מימדית עם מדידת כוח ישירה על ידי מלכודת אופטית.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

ערכת הכלים האינטגרטיבית לניתוח אותות סלולריים (iTACS) הופכת את התהליך של מדידה בו זמנית של מגוון רחב של אותות כימיים ומכאניים בתאים דבקים. iTACS נועדה להקל על פיתוח מונחה קהילה ולאפשר לחוקרים להשתמש בכל תכונות הפלטפורמה ללא קשר לרקע החינוכי שלהם.

ערכת כלים אינטגרטיבית לניתוח אותות תאיים: כוחות, תנועה, מורפולוגיה ופלואורסצנטיות

פרוטוקול זה נועד למדוד את הפרמטרים הדינמיים (בליטות, נסיגה, קפלים) של בליטות בקצה של תאים מתפשטים.

מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

כדי להתקדם, קונוסים צמיחה חייבים להפעיל כוחות משיכה נגד הסביבה החיצונית. דור כוחות המתיחה תלוי בדינמיקת אקטין ובצימוד מצמד. המחקר הנוכחי מתאר שיטות לניתוח דינמיקת אקטין, צימוד מצמד וכוחות משיכה להתקדמות חרוט הצמיחה.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

למדו כיצד לכמת כוחות בליטה בתאים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. השיטה כוללת הכנת רשתות מצופות פולימר, הדבקת תאים ודימות הסרט התואם. המחקר מספק תובנות לגבי מנגנוני הידבקות תאית ומכניקה תאית.

בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

גלה סרטונים נוספים