בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת כוחות בליטה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. זה מושג על ידי הכנת הרשתות המצופות בנוסחה ומדידת עובי הסרט הזה. השלב השלישי של תהליך זה מורכב מהושבת תאים על הרשתות והשארתם להיצמד.

השלב האחרון של ההליך הוא הדמיית סרט הפורמה מתחת לתאים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. כאשר נצמדים למצע, מיקרופאג'ים יוצרים מבני הידבקות תת-מיקרומטריים הנקראים פודוזומים. בסופו של דבר, העיוות של הסרט המשמש פודוזומים יכומת ויומרה לכוחות באמצעות מודל מכני תוצרת בית.

הנח אור זכוכית נקי אתנול לתוך מכשיר יציקת סרט המשפך וכסה את החלק העליון של המשפך. הזז את תמיסת הפומבר למעלה לתוך המשפך עד שהמפלס יגיע לשני שליש מהשקופית. השאירו אותו למשך דקה אחת ואז סננו את תמיסת הפורמוואר בזרם קבוע.

שימו לב שעובי הסרט תלוי הן בקצב הזרם והן בריכוז תמיסת הפורמבר. טפחו על האור הזה, יבשו בחושך וחתכו מלבנים בעזרת סכין גילוח חד. טבלו את המגלשה בכוס המלאה במים מזוקקים כך שסרט הפומבר יצוף על פני המים.

הניחו בזהירות רשתות נקיות של אצטון על הסרטים, מבריקים עם הפנים כלפי מעלה עם החלקת כיסוי בקוטר 12 מילימטר על גבי חלקם. הם ישמשו לניסוי הערכת העובי. בסופו של דבר טבלו שקופית מכוסה מדבקה כדי לשחזר את כל הסרט והרשתות.

מתאר את החלקה המכוסה בזכוכית בעזרת פינצטה כדי לחתוך את הפורמוואר ולנתק אותו מהשקופית. הרכיבו את מיקום הרשת מתחת להחלקה המכוסה ואז מתארים את הרשת בפינצטה כדי למשוך אותה. החור בסרט הפומבר שנוצר כך יצולם כדי למדוד את עוביו.

התקן סיליקון חנקתי בבלוק הזכוכית AFM וודא שהפס הזהוב אינו מתחת לקצה הקפיץ. התקן את גוש הזכוכית על מודול AFM ולאחר מכן הנח את האחרון על המיקרוסקופtage. הנח את תלוש הכיסוי המצופה פומבר על תא התצפית עם PBS למעלה.

סרוק את הגבול בין פומבר לזכוכית במצב מגע ועם נקודת ניוטון של 0.5 ננו. בתוכנת עיבוד הנתונים, השתמש במשטח הזכוכית כהתייחסות לגובה, ומדוד את עובי הפומבר בחתך הרוחב. מתחת למכסה המנוע הסטרילי, בחר פתק כיסוי בגודל 12 מילימטר והדביק עליו רצועה של סרט הצד

מתאר את הרשת המצופה בפינצטה והנח אותה מבריקה עם הפנים כלפי מעלה כך שרק הצדדים שלה יתחברו לדבק. זאת כדי למנוע קריעת פומבר בעת הסרת הרשת מהקלטת. הנח את רצועת הכיסוי בצלחת סטרילית של שש בארות וצנרת בטיפה של 10 מילימטר של מדיום תרבית ללא סרום.

הוא אמור להכיל כ -10 אלף תאים ובמקרה זה, מדובר במיקרופגים המובחנים ממונוציטים אנושיים. הקפד לא לגעת ברשת עם קצה הפייפר בתהליך, כדי לא לפגוע בציפוי הפומבר. יש לדגור במשך חצי שעה כדי לתת לתאים להידבק, ואז למלא את הבאר במדיום בתוספת סרום, ולדגור שוב במשך שעתיים, לפני תצפית AFM.

הניחו שתי רצועות מקבילות של סרט דו צדדי על צלחת פטרי תחתית זכוכית, וודאו שהרוחב ביניהן מעט קטן יותר, בהשוואה לקוטר הרשת שלכם. לאחר מכן נתק את הרשת שנזרעה בעבר בתאים והנח אותה על גבי שתי רצועות הסרט כשהתאים פונים כלפי מטה. תקן את הרשת על ידי הנחת שתי רצועות נוספות על גבי הרצועות הקודמות.

ממלאים את המנה במדיום תרבית שחומם מראש בתוספת hepe's. מניחים את המנה לתנור הכלים שהוגדר בעבר על 37 מעלות צלזיוס. התקן את הסט על AFM tagה.

כאשר טמפרטורת המערכת יציבה על 37 מעלות צלזיוס, המשך לסריקה של משטח ה-fomvar, אותו יש לבצע במצב מגע, עם נקודת הגדרה של 0.95 ננו ניוטון וחזותי את העיוותים הקשורים לפרוטוזואה בחלון תצוגת נתוני הסטיה. להלן התוצאות המייצגות ושלבי העיבוד להפקת תצורות עם AFM למדידות הגרפיות. כפי שניתן לראות בתמונה זו, מתגלות בליטות על פני השטח של הפומבר.

על מנת להמיר מידע צילומי זה לערכי כוח יש צורך תחילה בגישה להפרש הגבוה המקומי. כדי לעשות זאת יש להפחית התאמה פולינומית מדרגה שלישית לקו הסריקה שלה באופן עצמאי. לאחר מכן השימוש באלגוריתם הדמיה ייעודי תוצרת בית מאפשר להעריך ערכי כוח בליטה ממפת גובה AFM והמודל המכני של בליטה מתווכת פרוטוזואה.

הודות לנוהל זה, אנו מסוגלים לחקור את המנגנונים המעורבים ביצירת כוח בליטה אצל פרוטוזואנים. תודה על הצפייה, ובהצלחה על הניסויים שלך.