ויזואליזציה של הפקדות β עמילואיד במוח האנושי עם Desorption לייזר בסיוע מטריקס/הדמיה ספקטרומטר מסה יינון
7 במרץ 2019
הדמיה מולקולרית עם מטריקס בסיוע לייזר מבוססת על desorption/יינון הדמיה ספקטרומטר מסה (MALDI-IMS) מאפשרת את המיפוי סימולטני של analytes מספר דגימות ביולוגיות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול זיהוי, ויזואליזציה של חלבון עמילואיד β על רקמות המוח של מחלת אלצהיימר ודוגמאות angiopathy עמילואיד במוח באמצעות MALDI-IMS.
התרומה העיקרית של המאמר שלנו היא כי חקרנו נוף מדויק עדין של פתולוגיה עמילואיד בטא של המוח מחלת האלצהיימר עם טכנולוגיית ההדמיה של ספקטרומטריית מסה הדמיה MALDI. השגנו התקדמות טכנולוגית על ידי יצירת פרוטוקול מיוחד עם חומצה פורמית טרום טיפול של שקופיות הרקמה. בעקבות MALDI-IMS, מפות פילוח נוצרים וחישובים מבוצעים כדי לגלות חלבוני סמן הרומן או פפטידים colocalized עם פלאק וסקולטורה תת-אנכרנואידית.
השג דגימות קליפת המוח האנושיות עבור IMS ממוחות שהוסרו, עובדו ויאוחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס תוך שמונה שעות לאחר המוות. קח את דגימת המוח מקליפת המוח העורפית של חולי AD ובקרות תואמות גיל. כדי לחתוך את חלקי הרקמה על קריוסטאט, במקום הראשון תחמוצת פח אינדיום מוליך או שקופיות זכוכית מיקרוסקופ מצופה ITO בתוך cryostat.
מחממים את דגימת המוח הנתיחה ממינוס 80 מעלות צלזיוס למינוס 22 מעלות צלזיוס בתוך ההקפאה. חבר להב חד פעמי חדש להקפאטט לכל ניסוי. נסה תמיד להשתמש בחלק נקי של הלהב.
שים את מוח הנתיחה הקפוא על הבמה יחד עם כמות קטנה של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית. עבור IMS ואימונוהיסטוכימיה, לחתוך חמישה עד שישה חלקים מכל דגימת רקמה. כאשר הלהב רק מתחיל לחתוך את הרקמה, לסובב את הגלגל ולהתמודד עם הבלוק עד שכל הרקמה נחשפת.
אם יש פס קטן או קרע על פני החלק, המתן בהקפאה עד שתאימה הטמפרטורה תתקן אותו באופן אוטומטי. לספור כמה שניות לפני פתיחת האנטי רול עם רקמה מתחת. מיד מניחים את פרוסת הרקמה בצד מצופה ITO של מגלשת הזכוכית.
להפשיר את פרוסת הרקמה על ידי הצבת אצבע מתחת לשקופית בצד שאינו מצופה ITO. הרקמה תידבק לשקופית. ודא כי הרקמה שטוחה ככל האפשר ללא קמטים.
כדי לשטוף את חלקי הרקמה, לטבול את הדגימות ב 40 עד 100 מיליליטר של 70% אתנול בצנצנת ויטראז'ים זכוכית במשך 30 שניות כדי להסיר שומנים אנדוגניים ומלחים אורגניים. שטפו את הדגימות באמצעות רצף הכביסה המפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לייבש את הדגימות בוואקום במשך 30 דקות.
עכשיו, לטפל בקטעי הרקמה עם אדי חומצה פורמית ליינון טוב יותר של חלבוני בטא עמילואיד מרקמה מוחית נתיחה שלאחר המוות. לשם כך, להכין את התנור ב 60 מעלות צלזיוס צלחת זכוכית דגירה עם חמישה מיליליטר של 100% חומצה פורמית. שמור על לחות האוויר בצלחת זכוכית הדגירה ברמת הרוויה.
מניחים את שקופיות הרקמה בצלחת זכוכית הדגירה תוך הימנעות טבילה בחומצה פורמית ולטפל במשך שש דקות. צלם תמונה אופטית של הדגימות באמצעות סורק סרטים, סורק ג'ל או מיקרוסקופ דיגיטלי. בצע שלב זה בטמפרטורת החדר.
היישור של התמונה האופטית של הדגימות נחוץ כאשר יעד המדגם ממוקם בתוך המכשיר. בדרך כלל, לא ניתן יהיה לזהות את קטע הרקמה מתחת לשכבת המטריצה. כדי לתאם את התמונות האופטיות עם הדגימות, צור סימוני קו מנחה הנראים הן בתמונה האופטית והן מתחת לשכבת המטריצה במצלמה האופטית.
הדרך הקלה ביותר היא לזהות לפחות שלושה סימוני נוזל תיקון סביב המדגם לפני לקיחת התמונה האופטית. כדי לרסס את המטריצה עם מרסס קולי, להסיר את הרקמה להיות מרוסס מן desiccator ולמקם אותו בתא. תוודא שהרקמות לא מכסות את חלון החיישן.
התחל את ההכנה על-ידי לחיצה על לחצן התחל. בדרך כלל, זמן ההכנה הוא סביב 90 דקות. ההכנה תוסדר באופן אוטומטי באמצעות ניטור עובי שכבת המטריצה ורטיבות.
לחלופין, כדי לרסס את פתרון המטריצה על משטח הרקמה עם מרסס אוטומטי, השתמש במערכת משאבת ממס להגדיר ב 10 psi ו 0.15 מיליליטר לדקה כדי לספק את פתרון המטריצה. זרימה מתמדת של גז נדן מחומם תימסר בנפרד עם תרסיס פתרון המטריצה. בצע ניסויי דימות בתפוקה גבוהה וברזולוציה מרחבית גבוהה באמצעות MALDI-IMS.
למדידת ספקטרומטריית מסה, הגדר את אזורי הרקמה באמצעות תוכנת הבקרה וניתוח הנתונים של MALDI. רכוש ספקטרום במצב ליניארי חיובי עם טווח יחס מסה לטעינה של 2, 000 עד 20, 000 ורזולוציה מרחבית של 20 ו - 100 מיקרון. כדי להפוך את תקן הכיול, ממיסים את תקן כיול הפפטיד ואת תקן כיול החלבון ביחס של 1 עד 4 עם פתרון CHCA ו- TA30 ולאחר מכן מדללים אותו פי 10.
מקם מיקרוליטר אחד של תקן כיול בשקופית בארבעה מיקומים שונים. באמצעות תוכנת היסטולוגיה מולקולרית, כיסוי תמונות אות מרובות כדי למצוא את המתאם המרחבי של אותות שונים כגון פפטידים עמילואיד בטא שונים colocalizing בלוחות סניליים וקירות עורקים. אנגיופתיה עמילואיד מוחית או פנוטיפים CAA של חולה מספר שלוש היו הבולטים ביותר במחקר זה.
MALDI-IMS של רקמת המוח של המטופל הזה דמיינו בבירור כי עמילואיד בטא 1-42 ו עמילואיד בטא 1-43 הופקדו באופן מועדף כמו לוחות סניליים בפרנצ'ימה המוחית. לעומת זאת, בטא עמילואיד קצר יותר כגון עמילואיד בטא 1-36 כדי 1-41 הופקדו באופן מועדף על אזורי כלי הדם leptomeningeal. לא היו אותות משמעותיים בשליטה הלא פתולוגית.
הפצות של עמילואיד בטא 1-40 ו עמילואיד בטא 1-42 אומתו עוד יותר עם אימונוהיסטוכימיה באמצעות חלקים קפואים סמוכים של הרקמות. נוגדן בטא נגד עמילואיד 1-40 שכותרתו CAA וחשף עמילואיד בטא 1-40 מופקד עדיף בכלי דם leptomeningeal, וזה בניגוד ברור להפצה של עמילואיד בטא 1-42 בפרנצ'ימה המוחית כמו לוחות סניליים. מוצגת כאן מפת פילוח המתקבלת עם ניתוח k-אמצעים חציה להחיל על אותו סעיף ממטופל מספר שלוש.
שיטת קיבוץ באשכולות זו זיהתה בהצלחה מבנים דמויי פלאק במבנים הפרנצ'ימה וסקולרית בחלל התת-ארכיה. מעניין למצוא אזור עגול קטן בפרנצ'ימה אשר מזוהה רק סביב עורק קטן ב parenchyma, כמו גם בחלל תת-ארכיה. זה מאומת על ידי תמונות יון יחיד של אלה פפטידים עמילואיד בטא בודדים.
יש גבול להתחקות אחר מגוון רחב של בטא עמילואיד בו זמנית גם אם משתמשים בנוגדנים הספציפיים. כאן, אנו מראים את ההפצה של עמילואיד בטא במוח האדם באמצעות שיטה חדשנית MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה. אנו מאמינים כי תרומה זו עושה פריצת דרך במחקר מחלת אלצהיימר כי דו"ח זה מציע את האפיון של קבוצה מלאה של חלבוני עמילואיד בטא במוחות נתיחה שלאחר המוות אנושי.
הממצא המרשים ביותר הוא שרק שינוי אחד בחומצת אמינו במסוף C של חלבון עמילואיד בטא עושה שינוי דרסטי בתפוצה שלהם. צעדי הכנת הרקמה הם קריטיים כדי להשיג יינון יעיל של חלבונים מצטברים ברקמת המוח האנושית. cocrystallization הומוגני של analyte עם מטריצות חיוני עבור רגישות גבוהה הדמיה ללא חפץ.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לזיהוי ולהדמיה של חלבון amyloid β ברקמות מוח של חולי אלצהיימר ושל פתולוגיה של amyloid angiopathy במוח באמצעות MALDI-IMS (ספקטרומטריית מסות עם הדמיה המבוססת על דסורפציה/יוניזציה בלייזר בסיוע מטריצה). הפרוטוקול נועד לשפר את הרזולוציה המרחבית ואת הזיהוי של פתולוגיית עמילואיד בדגימות של רקמת מוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- דימוי ביולוגי
- מחקר על מחלת אלצהיימר
רקע
- פתולוגיה של Amyloid β היא סימן היכר של מחלת האלצהיימר.
- המחקר עושה שימוש ב-MALDI-IMS לצורך מיפוי מפורט של חלבוני amyloid β.
- טיפול מקדים בחומצה פורמית משפר את היינוני של חלבוני המטרה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול ממוקד להדמיה טובה יותר של amyloid β ברקמת מוח.
- זיהוי חלבונים או פפטידים המסמנים פלאקים של amyloid.
- הבנת ההתפלגות המרחבית של חלבוני amyloid בפתולוגיה של מחלת האלצהיימר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- MALDI-IMS שימשה כפלטפורמת הדימוי עבור ספקטרומטריית מסות.
- דגימות קורטקס אנושי מחולי אלצהיימר וממקבוצות ביקורת נדגמו.
- הדגימות עברו שלבי קדם-טיפול ספציפיים, כולל חשיפה לאדי חומצה פורמית.
- מפות פילוח ושיטות קיבץ (clustering) שימשו לניתוח ההתפלגות המרחבית של amyloid β.
תוצאות עיקריות
- המחקר חשף דפוסי השקעה דיפרנציאליים של פפטידי amyloid β שונים.
- Amyloid β 1-42 ו-1-43 נמצאו בעיקר בלוחיות סניליות בתוך parenchyme המוחי.
- ממצא מרכזי היה השקעה מועדפת של פפטידי amyloid β קצרים יותר בקרבת כלי דם.
מסקנות
- מחקר זה מספק גישה מתודולוגית מעודנת לבחינת פתולוגיה עמילואידית במחלת אלצהיימר.
- התובנות שהושגו משפרות את הבנתנו לגבי הדינמיקה המרחבית של התפלגות amyloid β ברקמות המוח.
- לממצאים אלו יש השלכות על מחקרים עתידיים המתמקדים במנגנונים הקשורים לעמילואיד במחלות ניווניות של מערכת העצבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
MALDI-IMS מאפשר מיפוי מרחבי ברזולוציה גבוהה של איזופורמים של amyloid β ברקמת מוח אנושית, ומספק תובנה מכניסטית לגבי הפתולוגיה של מחלת אלצהיימר ואנגיופתיה עורקית עמילואידית מוחית. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות על ידי חשיפת דפוסי שקיעה דיפרנציאליים של פפטידים של amyloid β, ובכך מסייעת בבחינת היפותזות טיפוליות ובגילוי סממנים ביולוגיים. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי קישור ההפצה המולקולרית לפנוטיפים נוירופתולוגיים ללא הסתמכות על גששים ספציפיים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של amyloid β 1-42 ו-1-43 בפלאקים סניליים ושל איזופורמים קצרים יותר במשקעים וסקולריים.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על מעורבות המטרה ברקמה אנושית רלוונטית למחלה.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי זיהוי מיני amyloid β בעלי לוקליזציה פתולוגית מובחנת.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה המשכיים באמצעות טיפול מקדים בחומצה פורמית וסגמנטציה ב-MALDI-IMS.
- ערך תפעולי: התייחסות לסטנדרטיזציה של הבדיקה וליכולת השחזור באמצעות ריסוס אוטומטי של מטריצה ובקרת רזולוציה מרחבית.
- מוכנות לסריקה: הדגשת יכולת ההרחבה (scalability) והשימוש החוזר בפלטפורמה לצורך פרופיל כמותי של amyloid β בחתכי רקמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה באמצעות מיפוי של איזופורמים של amyloid β לכלי דם הלפטומנינגיאלים ולפרנכימה המוחית ב-AD וב-CAA.
- ערך תפעולי: מתאר את הרצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות קורלציה מרחבית של אותות פפטידיים.
- קידום מותאם סיכון: מתמקד בהפחתת סיכונים חזויה על ידי תיקוף של שיקוע ספציפי לאיזופורמים באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
MALDI-IMS משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לעבודות פרה-קליניות, על ידי מתן אפשרות לבחינת השערות, הבהרת מסלולים והתאמת ביומרקרים ברקמת מוח אנושית.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים באמצעות מיפוי מרחבי של פפטידים של amyloid β ברקמות חולות וברקמות ביקורת.
- סריקה: מתארת את מוכנות הבדיקה באמצעות הכנה רב-שחזור של רקמות, יישום מטריצה ודימוי ברזולוציה מרחבית של 20 µm.
- אנליטיקה: מדגישה מדידות כמותיות של איזופורמים של amyloid β ואנליזת קולוקליזציה באמצעות תוכנה להיסטולוגיה מולקולרית.
- מחקר תרגומי: מקשרת את השיטה להמשכיות פרה-קלינית על ידי תיקוף דפוסי שיקוע וסקולריים ופרנכימטליים באמצעות אימונוהיסטוכימיה סמוכה.
- שימוש חוזר ארגוני: ממצבת את MALDI-IMS כיכולת ניתנת לשימוש חוזר למיפוי חלבוני מולטיפלקס במחקר של מחלות נוירודגנרטיביות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרה, צמצום עמימות מכניסטית בפתולוגיה של amyloid β.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של תהליכי הכנת רקמות ודימות.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון וצמצום סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות תובנות על מטרות ספציפיות לאיסופורמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על שיקוע דיפרנציאלי של amyloid β בפארנכימה לעומת כלי הדם.
שיקולי יישום
- מומחיות מדעית נדרשת בספקטרומטריית מסות, היסטולוגיה ונוירופתולוגיה.
- צורך בתשתיות אנליטיות ובמכשור, כולל מערכת MALDI, קריוסטט, מרסס אולטרסוני ותוכנה להיסטולוגיה מולקולרית.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים לטיפול ברקמות, טיפול באדי חומצה פורמית ופרוטוקולים לניתוח נתונים.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודלים, בייחוד עבור רקמות מנשפח אנושי לעומת מודלים טרנסגניים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך ביישום אופטימלי של המטריקס ואפשרות לחפיפת אותות בסביבות רקמה מורכבות.
