זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

Rho GTPase הקטן הוא חלבון של superfamily עם פונקציה תאית מגוונת. לדוגמה, חלבונים אלה מעורבים בוויסות גורל התא, תגובה תאית ללחץ, תנועתיות תאית ומחזור התא. הפעילות של חלבון Rho GTPase קטן מוסדר על ידי שינוי שלאחר התרגום.

שינויים אלה מעורבים ברגולציה הדוקה של פעילותם. לדוגמה, טרום נתילציה של חלבון וקשר GTP הם השינוי החשוב ביותר לאחר התרגום של חלבונים אלה. המעבדה שלי שינתה לאחרונה ופיתחה שיטה פשוטה לחקור את השינוי שלאחר התרגום של חלבונים אלה superfamily.

לשם כך, השתמשנו 251 קווי תא גליובלסטומה, ומיקוד אותם עם simvastatin, ו נמדד לאחר שינוי תרגום של חלבונים אלה. השיטה כוללת שבר תת-תאי וחלבון כרוך GTP לחלבון זה superfamily. לשם כך, השתמשנו לוקליזציה של RhoA, ו GTP קשור RhoA כדי למדוד את השינוי שלאחר התרגום של חלבון זה.

הסר תאים מהאינקובטור של 37 מעלות. תסתכל על התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר את הקונפדרציה. התאים צריכים להיות ב 70 עד 80 אחוז confluent.

לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS קר. מוסיפים חמישה מיליליטר של EDTA, ומחזרים את התאים לאנקובטור של 37 מעלות למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות של דגירה, לאסוף EDTA עם תאים לתוך צינור 15 מיליון.

מניחים את הצינור בקופסת קרח, ולהמשיך לצנטריפוגה. הגדר את הצנטריפוגה ל 1500g בארבע מעלות, ולסובב את התאים במשך חמש דקות. לאחר הספין, להסיר את supernate, ולהוסיף מיליליטר אחד של PBS קר.

טרייטוראט התאים היטב. מעבירים את תערובת התאים לצינור חדש שכותרתו 1.5 מיליליטר. לאחר ההעברה, המשיכו לצנטריפוגה.

הגדר את הצנטריפוגה ל 1500g בארבע מעלות, ולסובב את התאים במשך חמש דקות. תבדוק את גודל גלולה. שים את הדגימות על קרח.

להשליך את supernate לחלוטין, מבלי להפריע את גלולה. הוסף מאגר אחד. מערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה.

המשך לניקציה. הגדר את sonicator במשך חמישה מחזורים, חמש שניות כל אחד, ולחזור שלוש פעמים. Sonication צריך להמשיך על קרח, אבל לא מוצג בסרטון, להמחשה.

המשך לאולטרהצנטריפוגה. השתמש אולטרהצנטריפוגה כדי להפריד את homogenates התא לתוך שברי ציטופלסמי קרום. הגדר את הצנטריפוגה ל 100, 000g במשך 35 דקות, בארבע מעלות.

תבדוק את גודל גלולה. הפרד את העל-טבעי. לאסוף את supernate לחלוטין, נזהר לא להפריע גלולה.

ה-supernate הוא השבר הציטוסולי. מניחים את ה-supernate בצינור חדש שכותרתו. הוסף את מאגר 2 לכדור.

זה שבר הממברנה. מערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה. המשך קביעת חלבון והכנת דגימת כתם מערבית.

טען את הדגימות לדף SDS באמצעות 15% ג'ל. אשר העברת חלבון על ידי הדמיה של סמן המשקל המולקולרי, או באמצעות כתם פונסאו. הוסף נוגדנים ראשוניים לניתוח אימונובלוט.

אנו משתמשים ב-Rac1/2/3, CDC42 ו-RhoA. מוציאים את צלחות התרבות מהחמה. תסתכל על התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר את הקונפדרציה.

התאים צריכים להיות 70 עד 80%confluent. מניחים את צלחת התרבות על קרח. שאפו את התקשורת ושטפו את התאים עם PBS קר כקרח pH'd ל 7.2.

שאף PBS. להטות את הצלחות על קרח במשך דקה נוספת כדי להסיר את כל שרידי PBS. שיורית PBS משפיעה לרעה על ההבטחה הזו.

Lyse התאים בנפח המתאים של חיץ תריס קר קרח המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז. תא הקציר lysate עם מגרד התא. שיפוע צלחת התרבות לטכניקה זו.

מעבירים את ה"ליט" לצינור קריו קר כקרח, ולשמור על קרח. מערבבים היטב באמצעות מערבולת. יש לשמור 10 מיקרוליטרים של ה-lysate לצורך בדיקה של חלבונים.

הצמד להקפיא את התא הנותר lysate בחנקן נוזלי. מעבירים את ההקפאה הקפואה למקפיא מינוס 80. אחסן את הדגימות האלה.

הערה, אין לאחסן דגימות יותר מ- 14 יום. הכן lysates התא מן לוחות התרבות האחרים על ידי חזרה על צעדים אחד עד שמונה, אחד אחד. לעבוד במהירות, ולעולם לא להשאיר את הדגימות על קרח במשך יותר מ 10 דקות.

לעולם אל תטפל בכל לוחות התרבות בו זמנית. למדוד את ריכוז החלבון. לחשב את נפח חיץ תזה כדי לנרמל את ריכוז החלבון בין הדגימות.

הערה: מיליגרם אחד למיליליטר הוא בדרך כלל הטוב ביותר, עם זאת, 0.3 עד שני מיליגרם למיליליטר ניתן לזהות. הכן פקד ריק על-ידי הוספת 60 מיקרוליטרים של מאגר תיזה ו- 60 מיקרוליטרים של מאגר מחייב למיקרו-צינור. הכן שליטה חיובית על-ידי הוספת 12 מיקרוליטרים של חלבון בקרה של Rho, 48 מיקרוליטרים של מאגר תיזה ו-60 מיקרוליטרים של מאגר מחייב.

מוציאים את צלחת הזיקה של הרו מהתיק ומ מניחים על קרח. ממיסים את האבקה בארות עם 100 מיקרוליטרים של מים מזוקקים קרים כקרח. שמור את הצלחת על קרח.

להפשיר את התא הקפוא הצמד lysates באמבט מים להגדיר 25 מעלות צלזיוס. מוסיפים את הנפח המחושב של חיץ תות קרה כקרח לכל דגימה כדי לנרמל את ריכוז החלבון. העבר 60 מיקרוליטרים של דגימות קרות קרח מנורמלות למיקרו-צינורות, והוסף 60 מיקרוליטרים של חיץ מחייב.

מערבבים היטב, ולשמור על קרח. הסר לחלוטין את המים מהמיקרופלסטיק על ידי הבהוב נמרץ, ואחריו חמישה עד שבעה ברזים קשים על מחצלת מעבדה. הוסף 50 מיקרוליטרים של הדגימות המנורמלות, פקד ריק ושליטה חיובית בארות כפולות.

מניחים את הצלחת על שייקר מסלולי במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הערה: יש להגדיר את מהירות השייקר ל- 300 סל"ד. נקה את הדגימות מהצלחת על ידי הבהוב, ולשטוף פעמיים עם 200 microliters של מאגר כביסה בטמפרטורת החדר.

מוציאים במרץ את חיץ הכביסה מה בארות לאחר כל שטיפה על ידי הבהוב, ואחריו הקשה, ולשמור את הצלחת על הספסל בטמפרטורת החדר. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מאגר אנטיגן בטמפרטורת החדר לכל באר, והדגירה בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. תעיף את הפתרון מה בארות, ולשטוף שלוש פעמים עם 200 microliters של חיץ כביסה בטמפרטורת החדר.

הוסיפו 50 מיקרוליטרים של נוגדן ראשוני טרי אחד עד 250 אנטי-רוה לכל באר. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 45 דקות ב 300 סל"ד, להגדיר 25 מעלות צלזיוס. להעיף את הפתרון מן בארות, ולשטוף שלוש פעמים עם 200 microliters של חיץ כביסה בטמפרטורת החדר.

הוסיפו 50 מיקרוליטרים של נוגדן משני אנטי-RhoA שהוכן טרי לכל באר. מניחים את הצלחת על גבי שייקר מסלולית במשך 45 דקות, ב 300 סל"ד, להגדיר 25 מעלות צלזיוס. הכן את הריג'נט לזיהוי HRP על-ידי ערבוב כמויות שוות של Reagent A ו- Reagent B.Flick החוצה את הפתרון מכל באר, ושטף שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטרים של מאגר כביסה בטמפרטורת החדר.

הוסיפו 50 מיקרוליטרים של רגנט לזיהוי HRP שהוכן טרי לכל באר. קרא את אות האלוהות בתוך שלוש עד חמש דקות כדי לקבל אות מקסימלי. נתח את התוצאות באמצעות חבילת תוכנה מתאימה.

התוצאות שלנו מראות שסימבסטטין הפחית את לוקליזציה של RhoA בשבר הממברנה. מה שהגדיל הוא הצטברות בשבר הציטוסולי. מעניין, סימבאסטטין גדל GTP מאוגד RhoA.Why?

אנו צופים סימבאסטטין להקטין פעילות זו. חשוב מאוד שהם מודדים לוקליזציה תת-תאית של חלבון זה, ומודדים את קשירה GTP לחלבון זה כדי לקבל הערכה סופית של הפעילות של ה- Rho GTPases הקטנים.