בידוד של בלוטת Mandibular תוכן המאגר של אפור פרווה "פיצוץ של הנמלים (Formicidae) לניתוח Volatilome על ידי GC-MS ו- MetaboliteDetector

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במטבולומיקה של חרקים. ניתן להשתמש בגישת פרופיל המטבוליטים כדי לחקור את האקולוגיה הכימית של נמלים על ידי הבהרת תפקידם של החומרים הנדיפים באינטראקציה עם אורגניזמים אחרים. היתרון העיקרי של זרימת העבודה המוצגת הוא: שהיא מורכבת משני חלקים נפרדים הניתנים ליישום באופן עצמאי.

ראשית, הבידוד הפיזי של מאגר בלוטת הלסת התחתונה ותכולתו, ושנית, פרופיל לא ממוקד וזיהוי של מרכיבים אורגניים נדיפים, בדגימה הביולוגית המעניינת. מי שתדגים את ההליך תהיה מיכאלה הוניגסברגר, דוקטורנטית מוכשרת מהמעבדה שלי. לפני ניתוח הנמלים, במכסה אדים, נקו צלחת פטרי מזכוכית ואת מכשירי החיתוך באמצעות ממחטות נייר ותערובת אחת ועוד אחת בנפח של מתנול ומים.

אחסן את המנה במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, קח את המסה של בקבוקוני חוט קצרים בנפח 1.5 מיליליטר כולל מכסי הברגים שלהם המכילים סיליקון PTFE Septa. אחסן את הבקבוקונים על קרח.

לאחר מכן, הניחו חבילה קרה קפואה וגמישה לקופסת קצף פוליסטירן. לאחר מכן העמיסו את צלחת הפטרי על גבי החבילה הקרה והכניסו נמלה קפואה לתבשיל. כעת, בחנו את הנמלה במיקרוסקופ סטריאו.

בדוק את תקינות תאי הקיבה שלו. לנמלה חייב להיות אזור גסטר שלם. אל תשתמש בנמלים עם גסטרים שטוחים או עקבות של תכולת מאגר בלוטות הלסת התחתונה על משטחי גופן.

כעת, בודדו את תכולת מאגר בלוטת הלסת התחתונה מהנמלה. השתמשו במלקחיים כדי לאחוז בפרופודיום ובפטוטרת, ואז משכו בעדינות את חלקי הגוף הללו. לאחר מכן, אחזו בגסטר בטרגיט ארבע באמצעות מלקחיים עדינים.

בעזרת זוג מלקחיים נוסף, תפסו טרגיט אחד והסירו בעדינות את הטרגיט על ידי קילוף שלו. חזור על תהליך זה כדי לקרוע טרגיטים שניים ושלושה, כך שהחלק הגסטרולי של מאגרי בלוטת הלסת התחתונה נראה לרוב. מאגרי בלוטות הלסת התחתונה הם בצבע צהוב בנמלים פועלות C.Explodens, אך הצבע יכול לנוע בין לבן על צהוב, לאדום במינים אחרים.

לאחר מכן, בעזרת מחט דיסקציה, הסר בעדינות את התוכן דמוי השעווה של מאגרי בלוטת הלסת התחתונה הזוגיים על ידי גירודם מתא הקיבה. הסר רק את אותם חלקים מתכולת מאגר בלוטת הלסת התחתונה שניתן לבודד מבלי להפעיל לחץ על הבלוטות ומבני הגוף האחרים הקיימים בגסטר הנמלים. אין צורך לאסוף את כל תכולת מאגר בלוטת הלסת

כעת, הרם את תוכן מאגר בלוטת הלסת התחתונה על ידי נגיעה עדינה בקצה מחט הדיסקציה עד שהם נדבקים אליו. לאחר מכן העבירו את תכולת הבלוטה לבקבוקון חוט קצר קר של 1.5 מיליליטר. ייתכן שיהיה צורך להזיז את קצה המחט לאורך דופן הבקבוקון ולמרוח את תכולת הבלוטה על דופן הבקבוקון.

שמור את האוסף מכוסה ומונח על קרח עד שניתן יהיה לנתח אותו. בין נתיחות, נקו מחדש את המכשירים ואת הכלי עם תערובת המתנול והמים. כדי ליצור דגימה אנליטית אחת, שלבו את תכולת מאגר הבלוטות של מספר נמלים.

במקרה זה, תכולת הבלוטה מחמש נמלים עובדות C.blastns מאוגדת. לצורך ביקורת, אסוף דגימות המורכבות מבלוטת דופור הסמוכה למאגרי בלוטת הלסת התחתונה. לפני חילוץ תכולת הבלוטות, קבע את המסות של הדגימות האנליטיות.

לאחר מכן, הוסף 14 חלקים של אתיל אצטט קר קר בטוהר גבוה לפי נפח, לחלק אחד רקמה אחר מסה. מערבולת את התכשיר למשך חמש דקות בתנאים מקוררים. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות למשך 10 דקות ואספו את הסופרנטנטים.

כ-55 עד 75 מיקרוליטר של סופרנטנט צפויים מדגימת חמש נמלים. העבירו כל סופרנטנט לבקבוקון חוט קצר מקורר מראש של 1.5 מיליליטר עם מיקרו-אינספר של 0.1 מיליליטר, ואטמו היטב את הבקבוקונים באמצעות פקקי הברגה המכילים חורים וגומי אדום PTFE Septa. לרצף מדידה שלם של GCMS, הכינו בקבוקון חוט קצר של 1.5 מיליליטר עם תערובת כיול אינדקס שמירה, המיוצרת על ידי דילול תמיסות סטנדרטיות של אלקנים זמינות מסחרית בהקסאן, לשמונה מיליגרם למיליליטר לתרכובת.

לאחר מכן, הכינו בקבוקון נוסף של אתיל אצטט טהור שישמש כריק הממס. על מגש הדגימה האוטומטית המקורר של כרומטוגרף הגז, טען תחילה את ריק הממס, שנית, את תערובת הקליברנט של אינדקס השמירה, שלישית, תמצית תכולת מאגר בלוטת הלסת התחתונה, ורביעית, תמצית תכולת בלוטת הדופור. שים את הדגימות עם המגש על קרח להובלה לכרומטוגרף הגז.

הכנס את המגש לדגימה האוטומטית שהתקררה. עבור כל דגימה, הזריק אליקווט מיקרוליטר אחד למפרט המסה של GC להפרדה כרומטוגרפית על עמודה המתאימה לתרכובות היעד. כגון עמודת ממשק משתמש HP-5MS.

לאחר מכן, הגדר את פרמטרי ה- GC המתאימים. לדוגמא, השתמש בהליום בגז המוביל עם זרימת עמודה קבועה של מיליליטר אחד לדקה. השתמש ברמפה של טמפרטורת תנור החל מ-40 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ולאחר מכן רמפה של 10 מעלות צלזיוס לדקה עד 330 מעלות צלזיוס.

ואחריו שבע דקות. בעזרת פרמטרים אלה, הגדר את טמפרטורת הכניסה ל -270 מעלות צלזיוס. כעת, במידת הצורך, התאם את יחסי הפיצול עבור מפרט המסה של GC.

הזרקה כך שיספקו צורות ועוצמות שיא נאותות לתרכובות המעניינות. הגדר את טמפרטורת העזר ל-350 מעלות צלזיוס. למפרט ההמוני.

השתמש בפרמטרים הבאים. טמפרטורת מקור MS של 230 מעלות צלזיוס, טמפרטורת מרובע MS של 150 מעלות צלזיוס, טווח סריקה בין מסה נמוכה 30 למסה גבוהה 500, כדי לגרום לקצב סריקה של כשלוש סריקות בשנייה. ועיכוב ממס של 4.1 דקות עבור ריק הממס ודגימות הניסוי, או עיכוב ממס של 6.1 דקות עבור תערובת הקליברנט של אינדקס השמירה.

לאחר השלמת המדידות, פתח את תוכנת ניתוח הנתונים GCMS, וייצא את הנתונים כקובץ פרויקט AIA, להתקן אחסון נייד כדי להקל על העברת הנתונים למחשב עם מערכת הפעלה מבוססת לינוקס 64 סיביות. כדי לנתח את הנתונים, עקוב אחר תיאור טקסט הפרוטוקול של השימוש בתוכנת גלאי המטבוליטים. בשטח נאספו והוקפאו נמלים במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך יומיים, ולאחר מכן אוחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוחן.

תכולת מאגר בלוטות הלסת התחתונה מחמש נמלים עובדות C.blastns נאספה ונמדדה על ידי GCMS. ניתוח הנתונים חשף עשרות תרכובות משוערות של תכולת הבלוטות. שני המטבוליטים הדומיננטיים בתמצית תכולת מאגר בלוטת הלסת התחתונה גרמו לעומס יתר של העמודות.

זו הסיבה שאותו מדגם נותח שוב ביחס פיצול גבוה יותר של 50 לאחד. זיהום צולב של תכולת מאגר בלוטת הלסת התחתונה על ידי מרכיב של בלוטת דופור נחקר על ידי בדיקת דגימות בלוטת דופור. מזהמים כאלה הפגינו זמני שמירה מאוחרים, החל מ-29 דקות.

מטבוליטים של תכולת מאגר בלוטת הלסת התחתונה שזוהו זוהו על סמך שילוב של דמיון ספקטרום ומדד שמירה לספרייה פנימית. כך ניתן היה לאשר את זהותם של כ-10% מהמטבוליטים שזוהו, שחלקם רשומים כתרכובות אחת עד חמש. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד, לחלץ ולקבוע, אחד בכל פעם, מטבוליטים על ידי בחירה במדידת טרשת נפוצה.

לאחר השליטה, הבידוד, מיצוי הממס ורכישת הנתונים, של אותה דגימה, יכולים להיעשות תוך כשעתיים אם זה מבוצע כראוי. בהתאם למורכבות פרופיל התרכובות האורגניות הנדיפה, הזמן הדרוש להערכת הנתונים ישתנה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הדגימה מקוררת לצמיתות, מהאיסוף ועד הניתוח.

יתר על כן, לפני הקטע, יש לוודא שהגסטר של הנמלה שלם פיזית. ניתן לשלב הליך זה גם עם כימות השוואתי או מוחלט של המטבוליטים, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו ההרכב המטבולי, ותנאי הסביבה השונים, או כמויות מוחלטות של שימורים. באופן נוח, ניתן ליישם את שלבי המיצוי, המדידה והערכת הנתונים של פרוטוקול זה, גם על מערכות ביולוגיות מרובות, כגון חרקים אחרים, מיקרואורגניזמים או צמחים.