Name: אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: למדו שיטת scratch assay לבדיקת נדידת תאים במיקרוסקופ אופטי אוטומטי. השיטה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחרי תאי HaCaT ותורמת למחקר פצעים כרוניים וסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המועצה הדנית למען מחקר עצמאי, טכנולוגיה, ייצור, להעניק #4005-00029

הגדרת הניסוי נערך מסכים עם אוניברסיטת רוסקילדה, ויש אין מגבלה אתית ומשפטית. סקירה כללית של הסידור ניסיוני ניתן לראות באיור 1 ואת המנגנונים של המצלמה אופטי באיור2.
1. הכנה
<ol><li>לבצע את כל הצעדים זרימה שכבתית-ספסל סטרילי על-ידי ניקוי הספסל, חסכון כל עם 70% אתנול לפני התחלת הניסוי.</li>
	<li>מקם את המצלמה אופטי חממה קונבנציונאלי ב 37 ° C עם 5% CO2 ליצירת תנאים אופטימליים עבור התאים.</li>
	<li>לגדל תאים HaCaT בתקשורת DMEM עם 10% FBS ואנטיביוטיקה 1 x (פניצילין, סטרפטומיצין) בבקבוקון T75.</li>
	<li>השתמש טריפסין 1 x 1 מ"ל כדי לנתק את התאים ואת תת מטפח אותן כל 3-4 ימים, על ידי פיזור זה מעל השכבה הסלולר. מחממים מראש לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
</ol>2. יצירת של טפט של HaCaT תאים בצלחת Microtiter 48-ולס
<ol><li>הסר את המדיום של הבקבוק T75 עם פיפטה פסטר.</li>
	<li>רחץ התאים חסיד הבקבוק על-ידי הוספת מ ל 1 x PBS עקר הבקבוקון T75. הערה: ודא PBS חינם של סידן ומגנזיום.</li>
	<li>הפיצו את PBS ולהסיר אותו עם פיפטה פסטר.</li>
	<li>חזור על שלב 2.2-2.3.</li>
	<li>להוסיף הבקבוקון טריפסין 1 x 1 מ"ל ומעוררים אותה לאורך השכבה התא.</li>
	<li>דגירה. הבקבוק ב- 37 מעלות צלזיוס חממה קונבנציונאלי עד התאים הם צמודי קרקע (5-8 דקות מספיקה עבור מרבית שורות תאים).</li>
	<li>להציג במיקרוסקופ אם התאים הם צמודי קרקע. ברגע התאים מנותקים, להוסיף 9 מ של התקשורת תרבות קבוע עם 10% FBS כדי להשבית את טריפסין 1 x.</li>
	<li>לספור את התא עם, או hemocytometer קולטר-מונה או דומה. הערה: Trypan blue יכול לשמש כדי להציג תאים מתים. עם זאת, טריפסין 1 x HaCaT תאים הם לגמרי בסיבוב כאשר בחיים.</li>
	<li>העברה 7.5 x 104 תאים/טוב בתקשורת FBS 10% µL 250 צלחת תרביות רקמה של 48-ובכן להטלטל עגול (צלחת רגילה). הערה: Assay גם ניתן להגדיר ב- 6-, 12-, 24- או צלחות 96-ובכן, אשר כולם יכולים להיות לבדיקה במיקרוסקופ אופטי.</li>
	<li>להניע בעדינות את הצלחת מצד לצד כדי להבטיח שהתאים מתפשטים באופן שווה בתוך הבארות, או התאים אנקה במרכז הבארות. לבדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהתא מופצת באופן שווה בתקשורת</li>
	<li>לשים את הצלחת חממה2 CO קונבנציונאלי ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד התאים יש דבקה בתחתית הבארות.</li>
</ol>3. תוספת של גירויים לאפקטים ההעברה
<ol><li>בדוק אם הבארות הן 90-95% confluent תחת מיקרוסקופ אור.</li>
	<li>הכינו 10 µg/mL של מיטומיצין C בהכמות המתאימה של המדיום. הערה: במחקר זה, מיטומיצין C נשמרת ב 4 ° C בפתרון מניות ב 1 מ"ג/מ"ל. מיטומיצין C בתמיסה ניתן לאחסן שבוע בחושך ב 2-8 ° c</li>
	<li>הסר את המדיה בילה עם פיפטה פסטר מכל קידוח.</li>
	<li>להוסיף 250 µL של µg/mL 5 של מיטומיצין C בכל טוב.</li>
	<li>דגירה את הצלחת. בשביל 2 h-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
	<li>הכן גירויים של פפטידים על ידי דילול אותם בסכום המתאים של המדיום. הערה: במחקר זה, נבדקו שור ואנושי לקטופרין והן Lactoferricin-µg/mL 25 בנפח של 250 µL</li>
	<li>הסר את המדיום עם מיטומיצין C עם פיפטה פסטר.</li>
	<li>לשטוף את הבארות x 1 עם µL 250 1 x PBS (טמפרטורת החדר) ולהסיר לשטוף עם פסטר פיפטה.</li>
	<li>להוסיף µL 250 ל- 1 x PBS ותגרד באופן ידני את הבארות אנכית עם טיפ פיפטה µL 200. השתמש טיפ פיפטה חדש עבור כל טוב.</li>
	<li>להסיר את PBS ולהוסיף 250 µL פפטיד גירויים.</li>
	<li>לטעון את הצלחת במערכת אופטי מצלמה על-ידי התאמת את הברגים משני צידי הלוח. להשאיר את המכסה הצלחת microtiter. הערה: המצלמה יכולה לפעול עם מכסה פתוח במידת הצורך.</li>
</ol>4. להגדיר את התוכנית עבור המצלמה אופטי במחשב
<ol><li>לחץ על לחצן ייבוא בשורת המשימות בצד השמאל.</li>
	<li>בחר בפונקציה ריפוי פצעים בשורת המשימות בצד השמאל.</li>
	<li>בחר את סוג הלוח על ידי לחיצה מתחת לצלחת איור.</li>
	<li>ביטול בחירה של וולס, לא נעשה בו שימוש, על-ידי סימונן ולחץ לאפשר בצד השמאלי העליון על המסך. הערה: וולס כל נבחרות כברירת מחדל.</li>
	<li>התאם את המוקד של העדשה על הבארות כדי להתאים את המיקום של התאים על-ידי לחיצה ימנית על אחת הבארות. הערה: פוקוס אוטומטי יכול גם להיות מותאם באופן ידני על-ידי הזזת הסרגל בצד ימין של האיור צלחת.</li>
	<li>הגדר את תקופת הזמן לתמונות תחת התמונות מרווח (למשל (00: 30:00)).</li>
	<li>להגדיר את מספר החזרות שיתאימו תקופת הרצוי (למשל 97 חזרות).</li>
	<li>התחל ההפעלה על ידי לחיצה על לחצן ' התחל ' בפינה הימנית התחתונה.</li>
</ol>

<ol><li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+wound+care%22%5BJournal%5D)">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li>
<li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+biological+therapy%22%5BJournal%5D)">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li>
<li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li>
<li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+motility%3A+lessons+from+migration+in+confined+spaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li>
<li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li>
<li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+journal+of+dermatology%22%5BJournal%5D)">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li>
<li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li>
<li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells%3A+toxicity%2C+wound+healing%2C+uptake+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li>
<li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li>
<li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput%2C+interactive+imaging%2C+bright-field+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li>
<li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Räsänen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives%2C+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign%2C+not+in+malignant+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li>
<li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fructose-1%2C6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li>
<li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C%3A+small%2C+fast+and+deadly+%28but+very+selective%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li>
<li>Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="https://www.degruyter.com/view/j/biomat.2016.17.issue-1-2/bnm-2016-0002/bnm-2016-0002.xml">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li>
<li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li>
<li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li>
<li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li>
<li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin%2Flactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein%2Fpeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li>
<li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+properties+of+lactoferrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li>
<li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+desmosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li>
<li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li>
<li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCanali%2C+C+%22Whitepaper+a+Digital+Time-Lapse+Bright+Field+Technology+To+Drive+Faster%2C+Higher+Throughput+Bioanalysis%22">Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis</a>. , (2016).</li>
<li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li>
<li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

החשיבות של ההגירה במחקרים של פיתוח, ריפוי פצעים, אימונולוגיה, וסרטן הוביל מספר שיטות שונות ללמוד ההעברה. ההעברה יכול להיות ביטוי של ההתרחבות או סגירת הפער על ידי התאים. לרוב הסגר על השריטה נבדק, כפי שהוא קל יותר לגדל תאים חד שכבתי ולאחר מכן לבצע שריטה יותר גוברת התאים לטופס מסוים8. המחקר שלנו מדגים שיטת אופטימיזציה עבור מגרד ידנית, כמו השיטה אינה קלה ועלות נמוכה. הצגנו את מיטומיצין מעכב סינתזה של דנ א ג, ושטוף נוספת כדי למטב את השריטה לעומת שיטות שפורסמו18ולאחר השימוש של מצ...

ההעברה היא תהליך חשוב המשפיע מספר היבטים פיזיולוגיים. בריפוי הפצע, העברת מקל epithelization מחדש של העור. הפצעים ללא ריפוי, כגון לפצעים כרוניים, חיידקים הזדמנותית לגרום לזיהום הפצע, פצעים פתוחים הם אידיאליים עבור גידול חיידקים ועל היווצרות biofilm1,2. Biofilm הוא אחד הגורמים להתפתחות חיידקים עמידים, אשר הוא אחד האיומים הגדולים ביותר שלנו בחברה המודרנית3. בריפוי הפצע, תאים חיסוניים לא יכול לחדור את biofilm. ב סרטן, העברה של תאים סרטניים הוא צעד מכריע של גרורות, שהוא הגורם העיקרי למוות אצל חולים עם גידולים מוצקים4,5. לכן, זה הכרחי להיות מסוגל ללמוד ההעברה.
גירוד וזמינותו משמש לעתים קרובות כדי לבדוק את נדידת תאים כי זה זול וקל לביצוע על שורות תאים חסיד, כגון פיברובלסט, אנדותל, ותא אפיתל קווים6,7. כיום, קיימות מספר שיטות לביצוע שריטות8, חומרים שונים דווח לשמש, לרבות קיסמים9, מגרדים תא10, לייזרים11זרמים חשמליים12. כל אחת מהשיטות יש והחסרונות השונים, השיטה צריכה להיות החליט על פי הכלי סוג תקציב, ניתוח התא. לדוגמה, אם סוג התא בשימוש דורש ציפוי, הסרת לחץ ידני, למשל עם טיפ קיסם או פיפטה, ישפיע הדבר על הגירה בתוך האזור, יש להשתמש בשיטה שונה. במחקר זה, אנו נתמקד גירוד ידנית.
חסרון עבור גירוד ידני הוא וריאציה של גודל, צורות של השריטות, הצטברות של תאים בקצוות של השריטה. קיימים פרוטוקולים רבים, ומייעץ מאמר מצוטט מאוד מהירות מוגברת ו/או שטיפה לאחר גירוד13. בנוסף, מספר שיטות השתמשו כדי לצמצם את התפשטות, כיוון התפשטות התאים ניתן להבחין בין הגירה ולכן עלולה להחזיר תוצאות חיוביות שגויות של הגירה. כמה דיווח שיטות הרעבה סרום שקדמו מאפס14 ולאחר הפחתת כמות הנסיוב15. עם זאת, אף אחת מהשיטות האלה תוכל להבטיח שיש אין התפשטות. לכן, אנחנו מדווחים על טיפול טרום התאים עם מיטומיצין C כדי להבטיח תוצאות אמת של הגירה. מיטומיצין C הוא אנטיביוטיקה כי מעכב סינתזת ה-DNA על ידי יצירת של קשר קוולנטי עם ה-DNA, ומונע את הדנ א של הפרדת16. על ידי טיפול מראש עם מיטומיצין C ושטיפת תסיים לפני גירוד, הסגר שזוהו על הפער מדגים את ההעברה נכון של התאים (איור 1).
מאפיין של כל השיטות הוא הצורך עבור מערכת לנתח את תהליך ההעברה17. נפוצה שיטה זולה כדי לנתח את ההתקדמות הוא להשתמש במיקרוסקופ אור-השדה לקחת תמונות של השריטה בנקודות זמן שנקבע מראש, ואחריו ניתוח של סגירת הפער התמונה תוכנה18,19. שיטה זו גוזלת זמן, אמין לגבי לצלם באותו מקום, מיקוד, התנועה מן החממה המצלמה כוחות מחזורים של שינויי טמפרטורה בזמן מצולמות התמונות. פותחו שיטות אחרות כדי לזהות ההעברה על ידי מדידת הזרם הנוכחי. השינויים הנוכחיים, כתאי לכסות יותר שטח על הצלחת, אשר קרא כמו עלייה עכבה20. על ידי מדידת התנגדות, הסביבה של התאים אינו מושפע, השיטה ולכן היא נחשבת לא פולשנית. שיטה זו מסתמכת על צלחות מיוחדות עם אלקטרודות זהב, אשר יקר, אבל הם מאפשרים זיהוי של תהליכים רבים, כגון הדבקות הסלולר, הפצה, העברה מוות של תאים. חיסרון גדול של שיטה זו הוא כי המדידה עכבה לא ישירות מצביעות על ההעברה, כמו גורמים כמו טמפרטורה יש השפעה רבה על עכבה. שינויים עכבה יכולה להיגרם על ידי מספר גורמים אשר לא נבדקות על ידי התוכנה, יותר מקשה על הניתוח של הנתונים. לפיכך, היעדר ויזואליזציה דורש מיקרוסקופ אור קונבנציונלי כדי לוודא העברה.
כדי להתגבר על רוב המגרעות של טכניקות זמינים, אנו משתמשים במצלמה אופטית אוטומטית בזמן אמת. המצלמה אופטי היא מערכת זיהוי עם מיקרוסקופ תפוקה גבוהה ב פלטפורמה קטן עם עדשה, יחידת תאורה של מצלמה דיגיטלית. יש תוכנה מובנית, אשר ניתן לבחון ההגירה והתפשטות בין היתר. כדי לזהות את ההעברה, שני אלגוריתמים משמשים כדי לנתח את הצמיחה וקינטיקה ההעברה של תאים, אשר נקראים ההתפשטות ו הפצע ריפוי ניתוח, בהתאמה. ניתוח התפשטות הוא מבוסס על אלגוריתם פילוח תמונה בשני שלבים שחל במרקם ניתוח כדי לזהות את ההבדל בין שטחים מכוסי תא (מוצג בצהוב) וריק רקע אזורים על-ידי ניתוח ההיסטוגרמה מתקדם. הפצע ריפוי ניתוח מבוססת על אלגוריתם שלושה שלבים מזהה את טפט תא, מאתרת את הפער הפצע, והוא קובע את רוחב המרווח. השלבים נערכים אצל המוגדרות על-ידי המשתמש בזמן נקודות, הנתונים מוצג באזור מקורה, רוחב המרווח ואזור הפער. אחד היתרונות הגדולים של מחשב זה הוא כי הוא מאפשר הדמיה של תאים חסיד דרך נוזלי בגלל זווית המצלמה21. תמונות lenstakes בעת הטיית המצלמה מוקרנים אל ערימה-z של z-מטוס בודד ליצור כדי להבטיח כי התמונות בפוקוס (איור 2). z-במחסן נוצרות על-ידי מיזוג הסדרה של תמונות (למשל 40) שצולמו בניצב לקצה הפצע, ועל -פני כל הפצע. Z-הערימות מאפשר לכידה של העומק של השכבה תא, כמו גם מטוס בפוקוס על פני הפצע. יתר על כן, הסדרה של תמונות שאפשר להרכיב על אוסף וידאו של התמונות, בלחיצה על כפתור.
נדגים פרוטוקול ממוטבת גילוי של ההעברה בקו תא תקין HaCaT. בדקנו לקטופרין, שלה N-מסוף פפטיד, Lactoferricin, בני האדם, פרות, כדי לנתח את השפעתם על הגירה כמו מולקולות אלה הוכחו יש יישומים רבים מיקרוביאלית ו החיסונית להתכוונן מולקולות22 , 23. תרכובות ארבע, לעומת תאים HaCaT אינו מטופל, גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) שימש פקד חיובי.

<table><tbody><tr><td>oCelloScope</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>מצלמה אופטית</td></tr><tr><td>תוכנת UniExplorer&nbsp;</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>(8.0.0.7144 (RL3))</td></tr><tr>תא <td></td><td></td><td>HaCaT</td><td>נתרם מבית החולים Bispebjerg</td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>מדיום עבור HaCaT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>סרום בקר עוברי</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>D837</td><td>ללא Mg+ ו-Ca2+</td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>טריפסין (10x)</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>מיטומיצין C</td><td>Tocris</td><td>3258</td><td>מעכב התפשטות</td></tr><tr><td>צלחת מיקרוטיטר</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>677 180</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור</td><td>פנסוניק</td><td></td><td>37&deg; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>מסייע</td><td></td><td>T&uuml; rk (0.1 מ"מ)</td></tr><tr><td>Pipet boy</td><td>Accu-Jet pro</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אופטימיזציה assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

נדידת תאים הוא תהליך חשוב זה משפיע על היבטים רבים של בריאות, כגון ריפוי הפצע סרטן, וזה, לפיכך, חיוני לפיתוח שיטות ללמוד את ההעברה. וזמינותו מאפס כבר זמן רב השיטה הנפוצה ביותר במבחנה לבדיקת תרכובות בעלות מאפיינים migration נגד פרו בגלל הליך שלו זולה ופשוטה. אולם, לבעיית וזמינותו מדווחים לעתים קרובות היא ההצטברות של תאי מעבר לקצה של השריטה. יתר על כן, כדי להשיג מידע וזמינותו, תמונות של חשיפות שונות חייב להילקח על פני תקופה של זמן, באותו מקום בדיוק כדי להשוות את התנועות של ההעברה. ניתן להשתמש בתוכניות ניתוח שונים כדי לתאר את הסגר מאפס, אך הם עבודה אינטנסיבית, אינו מדויק, ואת כוחות מחזורים של שינויי טמפרטורה. במחקר זה, נדגים שיטה ממוטב עבור בדיקת ההשפעה ההעברה, למשל עם החלבונים המתרחשים באופן טבעי האדם - ו שור-לקטופרין, שלהם פפטיד N-מסוף Lactoferricin על הקו תאים אפיתל HaCaT. אופטימיזציה מכריע היא לשטוף את לגרד ב- PBS, מה שמבטל את הצטברות תאים לאורך הקצה הנ. זו יכולה להיות מוסברת על ידי ההסרה של קטיונים, אשר הוכחו יש השפעה על חיבור תאים תאים תקין. כדי להבטיח זיהוי נכון של הגירה, בטיפול מראש עם מיטומיצין C, מעכב סינתזת ה-DNA, נוספה לפרוטוקול. לבסוף, נדגים אוטומטיות אופטי למצלמה, מה שמבטל מחזורי בטמפרטורה הקיצונית, כפיים עם ניתוח סגירת מאפס, תוך שהיא משפרת על הפארמצבטית להבטיח ניתוח קטעים זהים של השריטה לאורך זמן.

HaCaT הוא קו תא תקין, אחד הסוגים התא הנפוץ ביותר של העור. כאשר פצע, תאי העור מתחיל להתרבות ולהעביר מעל למיטה הפצע כדי לסגור את הפצע (איור 3). שני התהליכים הם, לכן, חשיבות עליונה עבור ריפוי תקין.
המצלמה אופטי יכול לעקוב אחר שני תהליכים בזמן אמת. עבור העברה, המערכת נותנת שלוש ערכות נתונים: תא מכוסה באזור, רוחב המרווח ואזור הפער. כאשר ניטור שריטות שטופלו לקטופרין, Lactoferricin או EGF, מיקרוסקופ אופטי ...

כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.

אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להסתכל על התאים בזמן אמת במיקרוסקופ האופטי האוטומטי. ההשלכות של טיפול זה משתרעות על טיפול בפצעים כרוניים או סרטן שבו ההגירה ממלאת תפקיד מכריע במחלות אלה. התחל בשטיפת תרבית משולבת של תאי HaCaT פעמיים עם חמישה מיליליטר מגנזיום סטרילי ו-PBS ללא סידן בכל שטיפה.לאחר מכן, דגרו על התאים עם מיליליטר אחד של טריפסין באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד שמונה דקות. לאחר אישור הניתוק במיקרוסקופ אור, עצור את התגובה האנזימטית עם תשעה מיליליטר של מדיום תרבית בתוספת FBS. ולדלל את התאים ל-7.5 פעמים 10 לתאים הרביעיים לכל 250 מיקרוליטר של ריכוז בינוני בתוספת FBS.לאחר מכן, זרעו 250 מיקרוליטר תאים לכל באר של צלחת תרבית רקמות עם תחתית עגולה של 48 בארות, והחליקו בעדינות את הצלחת מצד לצד כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן שווה על פני תחתית הבאר. לאחר מכן העבירו את הצלחת לחממת תרבית תאים. כאשר התרביות הגיעו למפגש של 90 עד 95%, החלף את הסופרנטנט בכל באר ב -250 מיקרוליטר של מדיום טרי שהוכן בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר מיטומיצין C, והחזיר את הצלחת לחממה למשך שעתיים נוספות.בתום הדגירה יש לשטוף את התאים ב -250 מיקרוליטר PBS ולהוסיף 250 מיקרוליטר PBS טרי לכל באר. לאחר מכן השתמש בקצה מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר כדי ליצור שריטה אנכית אחת בכל חד-שכבת תא. כאשר כל החד-שכבות נשרטו, החלף את ה-PBS בכל באר ב-250 מיקרוליטר עם גירוי הפפטיד המעניין והרכיב את הצלחת למערכת מצלמה אופטית כשהמכסה שלם.כדי להגדיר את המצלמה האופטית, פתח את חלון הרכישה ובחר ריפוי פצעים. בחר את סוג הצלחת ובטל את הבחירה בבארות שאינן בשימוש. לאחר מכן לחץ על הפעל ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אחת הבארות כדי להתאים את המיקוד כך שיתאים למיקום התאים.הגדר את פרק הזמן עבור התמונות תחת מרווח תמונה והגדר את מספר החזרות כך שיתאים לתקופה הרצויה. לאחר מכן בחר את סוג הניתוח המתאים. לאחר מכן לחץ על התחל כדי להתחיל בהדמיית התאים.כאשר מתרחש פצע תאי העור מתחילים להתרבות ולנדוד על פני מצע הפצע כדי לסגור את הפצע, תהליך שניתן לראות דרך המצלמה האופטית. לאחר דגירה של 48 שעות, טיפול בגורם גדילה אנדותל גורם לסגירת הפצע בכמעט 95%, בהשוואה לסגירה של 38% בבארות הביקורת הלא מטופלות, ו-33% ו-62% סגירה בתרביות לקטופרין ולקטופריצין, בהתאמה. ניתן לשרטט גם את אחוז סגירת הפצע שנקבע משינויים ברוחב הפער מהשריטה הראשונית עבור כל גירוי גדילה.סרטון זה מתאר פרוטוקול פשוט ויעיל לחקר נדידת קרטינוציטים על פני שריטה שנוצרה בשכבה אחת של תאים בריאים. למרות שהתאים המשמשים בבדיקה זו הם תאי HaCaT, ניתן ליישם את השיטה גם על קווי תאים אחרים, פטריות או אפילו חיידקים, כל עוד הם נצמדים לתחתית לוחית המיקרוטיטר.

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

היכולת לנדוד היא פונקציה מרכזית של סוגי תאים רבים ושונים, כולל תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). עם זאת, כימות שינויים ביכולת הנדידה לאחר נזק הוא מאתגר. פרוטוקול זה מתאר בדיקת הגירה הניתנת להתאמה בקלות המשתמשת בסטטיסטיקה קפדנית כדי לכמת שינויים ביכולת הנדידה של MSC לאחר נזק.

אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

נדידת תאים הוא חיוני עבור פיתוח, רקמות תחזוקה ותיקון, ו tumorigenesis, מוסדר על ידי גורמי גדילה, נוגדנים, ציטוקינים. פרוטוקול זה מתאר נקודה וזמינותו, העברה דו מימדי, ולמשחקי הנועד להעריך את פנוטיפ הנדידה של גיליונות המצורפת, מלוכדת תא בתגובה רמזים microenvironmental.

באמצעות וזמינותו נקודה כדי לנתח את ההעברה של גיליונות תא

כתב יד זה מתאר איך חתך דמוי נגעים על monolayers בתרבית תאים אפיתל בנוחות דגם פצע ריפוי במבחנה, ומאפשר הדמיה על ידי קונאפוקלית או סריקה מיקרוסקופ לייזר, אשר יכול לספק באיכות גבוהה נתונים כמותיים ואיכותיים ללמוד בהתנהגות התא והן את המנגנונים המעורבים בהעברה.

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

מחקר זה מתמקד מודל במבחנה של הפצע הריפוי (גירוד assay) בתור מנגנון לקביעת מזהמים סביבתיים איך כגון ארסן השפעה הסלולר ההעברה. התוצאות מדגימים כי assay חוץ גופית בתוך זה מספק אינדיקציות מהיר ולא מוקדם של שינויים ההעברה הסלולר לפני ניסויים ויוו .

במבחנה לגרד Assay כדי להדגים את השפעת הרעל על נדידת תאים בעור

בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משולבת חוקרים נדידת תאים סרטן ופלישה על פלטפורמה אחת בזמן אמת, מתן אפשרות היעילה הדירים בקלות ללמוד ניידות תא ו מורפולוגיה.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור התיקון שריטות מבחנה באמצעות הפיברוכדורים העיקריים עבור vivo העור הפצע הריפוי הטיפול בעכברים. שניהם מספר שיטות ברורות כדי להעריך בתוך מבחנה וריפוי פצעים vivo.

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

אנו מציגים שיטה חסכונית לגיירת השריטות המספקת גישה חדשה לקביעת העברת תאים ללא שימוש בשיטות עתירות ציוד. בעוד פיברובלסטים שימשו בפרוטוקול זה, זה יכול להיות מותאם ומנוצל כדי ללמוד סוגי תאים נוספים והשפעות על העברת תאים.

תס"א של העברת שריטות חסכונית ותואמה

פרוטוקול זה מספק שיטה של בידוד תאי T ראשוניים ומיקרוסקופ בהילוך מהיר של נדידת תאי T בתנאים סביבתיים ספציפיים עם ניתוח כמותי.

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

למדו שיטת scratch assay לבדיקת נדידת תאים במיקרוסקופ אופטי אוטומטי. השיטה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחרי תאי HaCaT ותורמת למחקר פצעים כרוניים וסרטן.

אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

גלה סרטונים נוספים