אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להסתכל על התאים בזמן אמת במיקרוסקופ האופטי האוטומטי. ההשלכות של טיפול זה משתרעות על טיפול בפצעים כרוניים או סרטן שבו ההגירה ממלאת תפקיד מכריע במחלות אלה. התחל בשטיפת תרבית משולבת של תאי HaCaT פעמיים עם חמישה מיליליטר מגנזיום סטרילי ו-PBS ללא סידן בכל שטיפה.

לאחר מכן, דגרו על התאים עם מיליליטר אחד של טריפסין באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד שמונה דקות. לאחר אישור הניתוק במיקרוסקופ אור, עצור את התגובה האנזימטית עם תשעה מיליליטר של מדיום תרבית בתוספת FBS. ולדלל את התאים ל-7.5 פעמים 10 לתאים הרביעיים לכל 250 מיקרוליטר של ריכוז בינוני בתוספת FBS.

לאחר מכן, זרעו 250 מיקרוליטר תאים לכל באר של צלחת תרבית רקמות עם תחתית עגולה של 48 בארות, והחליקו בעדינות את הצלחת מצד לצד כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן שווה על פני תחתית הבאר. לאחר מכן העבירו את הצלחת לחממת תרבית תאים. כאשר התרביות הגיעו למפגש של 90 עד 95%, החלף את הסופרנטנט בכל באר ב -250 מיקרוליטר של מדיום טרי שהוכן בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר מיטומיצין C, והחזיר את הצלחת לחממה למשך שעתיים נוספות.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים ב -250 מיקרוליטר PBS ולהוסיף 250 מיקרוליטר PBS טרי לכל באר. לאחר מכן השתמש בקצה מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר כדי ליצור שריטה אנכית אחת בכל חד-שכבת תא. כאשר כל החד-שכבות נשרטו, החלף את ה-PBS בכל באר ב-250 מיקרוליטר עם גירוי הפפטיד המעניין והרכיב את הצלחת למערכת מצלמה אופטית כשהמכסה שלם.

כדי להגדיר את המצלמה האופטית, פתח את חלון הרכישה ובחר ריפוי פצעים. בחר את סוג הצלחת ובטל את הבחירה בבארות שאינן בשימוש. לאחר מכן לחץ על הפעל ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אחת הבארות כדי להתאים את המיקוד כך שיתאים למיקום התאים.

הגדר את פרק הזמן עבור התמונות תחת מרווח תמונה והגדר את מספר החזרות כך שיתאים לתקופה הרצויה. לאחר מכן בחר את סוג הניתוח המתאים. לאחר מכן לחץ על התחל כדי להתחיל בהדמיית התאים.

כאשר מתרחש פצע תאי העור מתחילים להתרבות ולנדוד על פני מצע הפצע כדי לסגור את הפצע, תהליך שניתן לראות דרך המצלמה האופטית. לאחר דגירה של 48 שעות, טיפול בגורם גדילה אנדותל גורם לסגירת הפצע בכמעט 95%, בהשוואה לסגירה של 38% בבארות הביקורת הלא מטופלות, ו-33% ו-62% סגירה בתרביות לקטופרין ולקטופריצין, בהתאמה. ניתן לשרטט גם את אחוז סגירת הפצע שנקבע משינויים ברוחב הפער מהשריטה הראשונית עבור כל גירוי גדילה.

סרטון זה מתאר פרוטוקול פשוט ויעיל לחקר נדידת קרטינוציטים על פני שריטה שנוצרה בשכבה אחת של תאים בריאים. למרות שהתאים המשמשים בבדיקה זו הם תאי HaCaT, ניתן ליישם את השיטה גם על קווי תאים אחרים, פטריות או אפילו חיידקים, כל עוד הם נצמדים לתחתית לוחית המיקרוטיטר.