אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית
8 באוגוסט 2018
כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להסתכל על התאים בזמן אמת במיקרוסקופ האופטי האוטומטי. ההשלכות של טיפול זה משתרעות על טיפול בפצעים כרוניים או סרטן שבו ההגירה ממלאת תפקיד מכריע במחלות אלה. התחל בשטיפת תרבית משולבת של תאי HaCaT פעמיים עם חמישה מיליליטר מגנזיום סטרילי ו-PBS ללא סידן בכל שטיפה.
לאחר מכן, דגרו על התאים עם מיליליטר אחד של טריפסין באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד שמונה דקות. לאחר אישור הניתוק במיקרוסקופ אור, עצור את התגובה האנזימטית עם תשעה מיליליטר של מדיום תרבית בתוספת FBS. ולדלל את התאים ל-7.5 פעמים 10 לתאים הרביעיים לכל 250 מיקרוליטר של ריכוז בינוני בתוספת FBS.
לאחר מכן, זרעו 250 מיקרוליטר תאים לכל באר של צלחת תרבית רקמות עם תחתית עגולה של 48 בארות, והחליקו בעדינות את הצלחת מצד לצד כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן שווה על פני תחתית הבאר. לאחר מכן העבירו את הצלחת לחממת תרבית תאים. כאשר התרביות הגיעו למפגש של 90 עד 95%, החלף את הסופרנטנט בכל באר ב -250 מיקרוליטר של מדיום טרי שהוכן בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר מיטומיצין C, והחזיר את הצלחת לחממה למשך שעתיים נוספות.
בתום הדגירה יש לשטוף את התאים ב -250 מיקרוליטר PBS ולהוסיף 250 מיקרוליטר PBS טרי לכל באר. לאחר מכן השתמש בקצה מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר כדי ליצור שריטה אנכית אחת בכל חד-שכבת תא. כאשר כל החד-שכבות נשרטו, החלף את ה-PBS בכל באר ב-250 מיקרוליטר עם גירוי הפפטיד המעניין והרכיב את הצלחת למערכת מצלמה אופטית כשהמכסה שלם.
כדי להגדיר את המצלמה האופטית, פתח את חלון הרכישה ובחר ריפוי פצעים. בחר את סוג הצלחת ובטל את הבחירה בבארות שאינן בשימוש. לאחר מכן לחץ על הפעל ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אחת הבארות כדי להתאים את המיקוד כך שיתאים למיקום התאים.
הגדר את פרק הזמן עבור התמונות תחת מרווח תמונה והגדר את מספר החזרות כך שיתאים לתקופה הרצויה. לאחר מכן בחר את סוג הניתוח המתאים. לאחר מכן לחץ על התחל כדי להתחיל בהדמיית התאים.
כאשר מתרחש פצע תאי העור מתחילים להתרבות ולנדוד על פני מצע הפצע כדי לסגור את הפצע, תהליך שניתן לראות דרך המצלמה האופטית. לאחר דגירה של 48 שעות, טיפול בגורם גדילה אנדותל גורם לסגירת הפצע בכמעט 95%, בהשוואה לסגירה של 38% בבארות הביקורת הלא מטופלות, ו-33% ו-62% סגירה בתרביות לקטופרין ולקטופריצין, בהתאמה. ניתן לשרטט גם את אחוז סגירת הפצע שנקבע משינויים ברוחב הפער מהשריטה הראשונית עבור כל גירוי גדילה.
סרטון זה מתאר פרוטוקול פשוט ויעיל לחקר נדידת קרטינוציטים על פני שריטה שנוצרה בשכבה אחת של תאים בריאים. למרות שהתאים המשמשים בבדיקה זו הם תאי HaCaT, ניתן ליישם את השיטה גם על קווי תאים אחרים, פטריות או אפילו חיידקים, כל עוד הם נצמדים לתחתית לוחית המיקרוטיטר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לבדיקת נדידת תאים in vitro באמצעות מיקרוסקופ עם מצלמה אופטית אוטומטית. בדיקת השריטה (scratch assay) מוצגת כשיטה מהימנה לצפייה בנדידת תאים לאורך זמן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה
- טכניקות In Vitro
רקע
- בדיקת שריטה (scratch assay) היא טכניקה נפוצה לחקר נדידת תאים.
- מיקרוסקופים אופטיים אוטומטיים מאפשרים תצפית על תאים בזמן אמת.
- הבנת נדידת תאים היא קריטית לטיפולים בפצעים כרוניים ובסרטן.
- שיטה זו היא חסכונית ואמינה לזיהוי תנועת תאים.
מטרת המחקר
- להדגמת שיטה מהימנה להערכת נדידת תאים.
- לבחינת ההשלכות של נדידת תאים בטיפול בפצעים כרוניים ובטיפול בסרטן.
- לשימוש במיקרוסקופיה אופטית אוטומטית לצורך ניתוח בזמן אמת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שטיפת תרביות תאים של HaCaT שהגיעו למצב של התלכדות (confluence) באמצעות PBS.
- דגירה של התאים עם טריפסין לצורך ניתוק.
- עצירת התגובה האנזימטית באמצעות מצע גידול.
- דילול התאים לריכוז ספציפי לצורך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- הושגה תצפית בזמן אמת על נדידת תאים.
- השיטה הוכחה כיעילה לניטור סגירת שריטה.
- התוצאות עשויות לספק מידע לאסטרטגיות טיפוליות עבור פצעים כרוניים וסרטן.
- מיקרוסקופיה אוטומטית משפרת את מהימנות הערכות הנדידה.
מסקנות
- המיקרוסקופ האופטי האוטומטי הוא כלי בעל ערך לחקר נדידת תאים.
- טכניקה זו עשויה לקדם מחקרים בריפוי פצעים כרוניים ובטיפולים בסרטן.
- מחקרים נוספים עשויים להרחיב את יישומיה בהקשרים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות נדידת תאים הן קריטיות להערכת מועמדים טיפוליים בריפוי פצעים ובאונקולוגיה, אך בדיקות שריטה (scratch assays) מסורתיות סובלות מארטפקטים של קצוות וממגבלות של ניתוח ידני. פרוטוקול מותאם זה נותן מענה לאתגרי השחזור על ידי ביטול הצטברות תאים המתווכת על ידי קטיונים ושילוב של דימוג אוטומטי, מה שמאפשר קבלת נתוני נדידה כמותיים ועקביים. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת נתונים אמינים בזמן אמת על תרכובות מעודדות נדידה או מעכבות נדידה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות שינויים בנדידה בתגובה לגירויים כגון lactoferrin או גורמי גדילה.
- ערך תפעולי: מפחית שונות הנובעת מניתוח ידני של שריטות ומתנודות בטמפרטורה באמצעות דימות אופטי אוטומטי.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר מדדים כמותיים וסטנדרטיים של סגירת פצע מאותם חתכי שריטה לאורך זמן.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך במחזוריות של דגימה וניתוח תמונות עתירת עבודה, ובכך משפר את התפוקה עבור סריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שימוש בתאי keratinocytes מסוג HaCaT הרלוונטיים למחלה למידול נדידה אפיתליאלית, התומך בהתאמה של ביומרקרים תרגומיים.
- ערך תפעולי: הבטחת רציפות של הבדיקה משלב הגילוי ועד להערכה פרה-קלינית באמצעות תהליכי עבודה אוטומטיים הניתנים לשחזור.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
השיטה משתלבת ברצף התגליות, תומכת בבחינת השערות בשלבי הגילוי המוקדמים ומאפשרת זיהוי כמותי של תרכובות מובילות (leads) באמצעות עיכוב או עידוד מדידים של נדידה.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבירור מסלולים ביולוגיים על ידי בידוד הנדידה כמשתנה תלוי בתגובה לטיפולים בפפטידים או בציטוקינים.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור (למשל, % סגירת פצע) המאפשרות השוואה בין ספריות תרכובות או וריאנטים של חלבונים.
- אנליטיקה: מייצר נתוני נדידה בסדרות זמן המתאימים להשוואה סטטיסטית ולמידול תגובה למינון.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר לרלוונטיות פרה-קלינית באמצעות שימוש בתאי קרטינוציטים אנושיים ובהקשר של ריפוי פצעים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה אוטומטית וניתנת לשימוש חוזר לבדיקות נדידה במגוון פרויקטים וסוגי תאים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במבדקי נדידה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והסביליות (scalability) באמצעות דימות אוטומטי והכנה עקבית של השריטה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתוני נדידה כמותיים ואמינים בשלב מוקדם של התהליך.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות מותאם-סיכון על בסיס השפעות נדידה מאומתות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים ובטכניקה סטרילית להכנת שכבה אחת (monolayer).
- תלוי במערכות מצלמה אופטיות אוטומטיות עם יכולות צילום במרווחי זמן (time-lapse) וניתוח נתונים.
- מחייב סטנדרטיזציה של רוחב השריטה והתזמון בין הבארות לצורך קבלת נתונים ברי השוואה.
- כולל אופטימיזציה של שלבי השטיפה ב-PBS למניעת ארטיפקטים בשוליים בסוגי תאים שונים.
- מוגבל לתאים נצמדים התואמים להצמדה לתחתית של פלטת מיקרוטיטר.
