ניתוח השטף חוץ-תאי בידוד, אפיון, תפוקה גבוהה של העכבר הראשי כליות צינורי בתאי אפיתל
20 ביוני 2018
פרוטוקול זה מספק גישה חסכונית כדי לבודד ולאפיין העכבר הראשי כליות צינורי תאים יכולים לאחר מכן להיות תת תרבותי להערכת תפקודים ביולוגיים כליות ex-vivo, כולל ביואנרגיה מיטוכונדריאלי.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי חילוף החומרים בכליות, כגון חמצון חומצות שומן, הקשור קשר הדוק להתפתחות פיברוזיס כלייתי ונפרופתיות שונות אחרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שימוש בפלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לסינון תרכובות המווסתות את הביו-אנרגטיקה המיטוכונדריאלית בתאי אפיתל צינוריים בכליות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלה מטבולית כלייתית מכיוון שהיא מאפשרת הקרנה גבוהה של תרכובות המווסתות את חילוף החומרים המיטוכונדריאלי בתאי אפיתל הכליה.
להכנת מנות הפטרי המצופות בקולגן בגודל 60 מילימטר, הוסיפו שני מיליליטר של חומצה אצטית מסוננת מראש של 20 מילי-מולרית ואחריה 35 מיקרוליטר תמיסת קולגן I לכל מנה. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה, יבשו אותה באוויר וחשפו אותה ל-UV. לאחר מכן, שטפו את שאריות החומצה האצטית באמצעות PBS. בצעו שלוש שטיפות.
לאחר מכן, אחסן את המנה בחממת תרבית תאים נטולת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הכנת העכבר לניתוח, הסר את הפרווה מהחזה והבטן באמצעות קרם אפילציה. לאחר מכן, יש לחטא את העור ביוד, ולנגב את שאריות היוד.
לאחר מכן, בצע חתך לפתיחת חלל הבטן, וחשוף את הלב והכליות. כעת, הגדר משאבת זלוף במהירות של 32 מיליליטר לדקה, והסר את כל הבועות בצינור לפני תחילת הזילוף. השתמש במחט בגודל 27 בסוף הקו.
כדי להמשיך, הכנס מחט לחדר השמאלי דרך קודקוד הלב. ברגע שהמאגר ממלא את הלב, תקעו חור בפרוזדור הימני כדי ליצור יציאה למאגר הזלוף. לאחר מכן, עברו למאגר העיכול, והפחיתו מעט את מהירות המשאבה ל-30 מיליליטר לדקה לעיכול.
לאחר 20 מיליליטר של חיץ עיכול, הסר את שתי הכליות לבידוד התאים הצינוריים. כדי לעבד את הכליות שנקטפו, ראשית, הסר את כמוסות הכליה והמדולה. לאחר מכן, טוחנים את שתי הכליות לחתיכות זעירות, ודוגרים אותן ב-10 מיליליטר של מאגר עיכול בתנור של 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין למשך חמש דקות.
לאחר העיכול, הסר את כל הרקמות הלא מעוכלות על ידי העברת המאגר דרך מסנן של 70 מיקרון. לאחר איסוף הרקמה המעוכלת, הוסף 10 מיליליטר של אמצעי תרבות כדי לעצור את העיכול. לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף הרקמה המסוננת ב-50 גרם למשך חמש דקות כדי לגלול את התאים הצינוריים.
לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש, הוסיפו חמישה מיליליטר של מצע תרבית, וחזרו על הצנטריפוגה כדי לאסוף את כל התאים הצינוריים שנותרו. כעת, השעו מחדש את הגלולה הראשונה ב-20 מיליליטר של מצע תרבית, וצנטריפוגה ב-50 גרם למשך חמש דקות כדי לטהר עוד יותר את התאים שנאספו. השלך את הסופרנטנט.
לאחר מכן, השעו מחדש את שני הכדורים ב -10 מיליליטר של מדיום תרבית. לאחר מכן, ספרו את התאים החיים באמצעות צביעה כחולה טריפאן. לאחר מכן, זרעו עד 10 מיליון תאים על צלחת מצופה קולגן בגודל 60 מילימטר, ותנו לתאים הצינוריים להיצמד למשך הלילה.
כדי להתחיל, זרעו תאים צינוריים P1 ב-40,000 תאים לבארות של מיקרו-פלטה טרייה שהוכנה עם 96 בארות מצופה בקולגן. השתמש ב 100 מיקרוליטר של מדיית תרבית לבאר. אופטימיזציה של צפיפות התאים וריכוז התרכובות בבדיקת השטף החוץ-תאי היא המפתח לניסוי מוצלח.
אנו ממליצים על ניסוי טיטרציה פיילוט כדי לזהות צפיפות תאים אופטימלית וריכוז תרכובות. לאחר מכן, הרטיבו את מחסנית החיישן. ראשית, הרם את מחסנית החיישן, ומלא כל באר של הצלחת ב-200 מיקרוליטר של תמיסת כיול.
לאחר מכן, מקם מחדש את המחסנית כדי להטביע את החיישנים, ודגר את המכלול למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, שאפו את המדיה הישנה, והחליפו אותה ב-175 מיקרוליטר של גלוקוז או חומצות שומן. לאחר מכן, המשיכו בדגירה למשך שעה ללא פחמן דו חמצני.
במהלך הדגירה בתא, טען את יציאת A של המחסנית עם 25 מיקרוליטר אוליגומיצין, את יציאת הטעינה B עם FCCP, את יציאת הטעינה C עם רוטנון/אנטימיצין A, ואת יציאת הטעינה D וכל שאר היציאות במים. כעת, אחסן את המחסנית בחממה נטולת הפחמן הדו חמצני עד שההתקנה מוכנה לכיול. המשך על ידי הפעלת מנתח השטף החוץ-תאי והבקר.
לאחר מכן, פתח את תוכנת המנתח, בחר בדיקה סטנדרטית ולחץ על אשף הבדיקה אופציה. לאחר מכן, תחת הכרטיסיה תרכובות, הקצה את התרכובות ליציאות המתאימות. תחת הכרטיסיה תיקון רקע, בחר את הבארות שאינן מכילות תאים.
לאחר מכן, השתמש בכרטיסייה קבוצות ותוויות כדי לתייג את קבוצות הניסוי. לאחר מכן, תחת הכרטיסייה פרוטוקול, הגדר את מחזורי הערבוב והמדידה המתאימים באמצעות הפקודות הזמינות. הגדרות אלה מצוינות בפרוטוקול הטקסט, ולאחר הזנתן, שמור את התבנית לשימוש עתידי.
כעת, לחץ על אשף הסיום כדי להמשיך. כעת, לחץ על התחל כדי להתחיל בכיול. לאחר מכן המנתח מוציא את מחזיק הצלחת ומבקש להכניס את לוחית המחסנית.
תהליך כיול זה אורך 20 עד 25 דקות. לאחר כיול המערכת, לחץ על פקודת ההנחיה כדי להחליף את לוחית הכיול בלוחית התא, והמשך בריצה. בסיום ההפעלה, שמור את נתוני ה-OCR והסר את הצלחת מהמנתח.
כעת, הוסיפו את הוכסט לכל אחת מבארות הבדיקה, ודגרו על הצלחת למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות עירור של 355 ננומטר ופליטה של 460 ננומטר, ונרמלו את נתוני ה-OCR לספירת התאים. בפרוטוקול זה, אוכלוסייה הטרוגנית של תאי כליה, צינוריות מעוכלות באופן לא מלא ופסולת רקמות אחרות תורבבו על צלחות מצופות קולגן.
למחרת הבידוד, אמצעי התרבות עבר צנטריפוגה כדי להסיר פסולת, והתאים הצינוריים צופו מחדש. לאחר מכן, התאים התחברו ביתר קלות, וביום החמישי בתרבית, הם היו במפגש של 80 עד 90%. לאחר מכן ה-TECs הכלייתיים עברו תת-תרבית וגדלו למפגש תוך שבוע אחד.
גידול דומה התרחש בשני הקטעים הבאים. השכבה החד-שכבתית של התאים קיבלה צורת כיפה, התרוממה מהצלחת ונשארה מחוברת בצמתים הדוקים. הנשימה המיטוכונדריאלית של TECs ראשוניים מבודדים נמדדה באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי מתואר של ה-OCR בצפיפות ציפוי שונה כמתואר.
לתאים המצופים בצפיפות גדולה יותר היו עליות פרופורציונליות ב-OCR. 40,000 תאים לבאר כיסו את פני הלוח טוב יותר מכל צפיפות ציפוי אחרת, ובכך הפכו אותו לריכוז האופטימלי לבדיקת אינטראקציות בין תאים ותרכובות. לדוגמה, מדיה המכילה מצע חומצות שומן יושמה על TECs יחד עם 2DG, מעכב גליקוליזה, כדי להעריך ישירות את חמצון חומצות השומן ב-TECs במעברים 1 ו-2.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב תמיד לתעד את הנפחים והריכוזים המדויקים בכל באר. שינויים בריכוזים הסופיים של הרכיבים עלולים לגרום לניסוי כולו להיכשל. לאחר פיתוחה, טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום הנפרולוגיה לחקור את תפקיד חילוף החומרים של חומצות שומן צינוריות בפתוגנזה של נפרופתיות שונות.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מספק גישה חסכונית לבידוד ואופיין של תאי צינוריות כלייתיות ראשוניות של עכבר שניתן לגדל אותן בתרבית נוספת להערכת תפקודים ביולוגיים כלייתיים ex vivo, כולל ביואנרגטיקה מיטוכונדריאלית.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נפרולוגיה
- ביולוגיה של תאים
- מחקר מטבולי
רקע
- שיטה זו עונה על שאלות מרכזיות לגבי מטבוליזם כלייתי.
- היא מתמקדת בחמצון חומצות שומן הקשור לפיברוזיס כלייתי ונפרופתיות.
- הטכניקה מאפשרת סינון גבוה של תרכובות.
- היא משמעותית לטיפול במחלות מטבוליות כלייתיות.
מטרת המחקר
- לבודד ולאפיין תאי צינוריות כלייתיות.
- להעריך את הביואנרגטיקה המיטוכונדריאלית בתאים אלו.
- לאפשר סינון גבוה של תרכובות המשפיעות על מטבוליזם כלייתי.
שיטות בשימוש
- הכנת צלחות מצופות קולגן לתרבית תאים.
- בידוד כירורגי של כליות עכבר לחילוץ תאי צינוריות.
- שימוש במאגרי עיכול וצנטריפוגה לטיהור תאים.
- ניתוח זרימה חוץ-תאית להערכת תפקוד מיטוכונדרי.
תוצאות עיקריות
- בידוד ותרבית מוצלחים של תאי צינוריות כלייתיות.
- התאים הגיעו ל-80-90% קונפלואי בתוך חמישה ימים.
- אפשר סינון גבוה עבור תרכובות מטבוליות מיטוכונדריאליות.
- הפרוטוקול מאפשר תוצאות שניתן לשחזר במחקרי תאים כלייתיים.
מסקנות
- הפרוטוקול יעיל לחקר תפקודי תאי צינוריות כלייתיות.
- הוא מספק תובנות לגבי מטבוליזם כלייתי וטיפולים פוטנציאליים.
- יכולות סינון גבוה משפרות את יעילות המחקר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-throughput extracellular flux analysis of primary mouse renal tubular epithelial cells enables robust interrogation of mitochondrial bioenergetics, a critical determinant in renal disease pathogenesis. This workflow supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for metabolic pathways implicated in chronic kidney disease. The protocol's scalability and reproducibility position it as a foundational capability for renal metabolism-focused drug discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of mitochondrial function in disease-relevant renal cell populations.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying fatty acid oxidation and metabolic flux.
- Facilitates functional target validation for pathways linked to renal fibrosis and nephropathies.
- Provides predictive confidence for advancing metabolic targets in renal disease pipelines.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput screening of compounds affecting mitochondrial bioenergetics.
- Optimizes assay conditions for cell density and compound concentration, ensuring reproducibility.
- Generates quantitative outputs (OCR) for reliable compound evaluation and comparison.
- Enables platform reuse for iterative screening and lead optimization cycles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ex vivo metabolic readouts with disease-relevant renal cell models.
- Supports translational biomarker development by linking mitochondrial function to renal pathology.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation of metabolic interventions.
- Reduces biological risk by enabling functional assessment prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification, supporting both target validation and compound screening in renal metabolism research.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial respiration and fatty acid oxidation to clarify metabolic pathway involvement in renal disease.
- Screening: Provides high-throughput, reproducible assay conditions for compound evaluation in primary renal cells.
- Analytics: Delivers normalized OCR measurements for robust statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Bridges ex vivo metabolic findings to preclinical models of chronic kidney disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for ongoing renal metabolism research and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in metabolic target selection and validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in renal cell-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in renal drug discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic targets and compounds for renal indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and mitochondrial functional assays.
- Needs access to high-throughput extracellular flux analyzers and compatible software.
- Demands rigorous standardization of cell density and compound concentrations for reproducibility.
- Adaptation may be needed for other species or renal cell subtypes.
- Careful tracking of assay variables is essential to avoid experimental failure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
Preparing Collagen I Plates
1:31
Perfusion, Digestion and Harvesting Kidneys from Mice
2:36
Tissue Processing and Primary Tubular Cells Isolation
4:11
Mitochondria Bioenergetics Assay
7:26
Results: Renal Tubular Epithelial Cell (TEC) Morphology and Metabolism
9:04
Conclusion
