הקפאה-מקטעי רשתית, שלם-טעינות, וההכנות להערכת מבודד היפוטוניק להמחשת Immunohistochemical של Microvascular Pericytes

שיטות אלה יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום רפואת העיניים כגון התפשטות pericyte או הגירה. היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהם מספקים מגוון רחב של אפשרויות הדמיה. הדגמת ההליכים תהיה קארין דריסיג ופרנק וו.בליקסט, שני פוסט-דוקטורנטים במעבדה שלנו.

כדי להפוך את העין, תחילה להשתמש באזמל כדי להפוך את חריצים האחוריים הקדמיים של כ 0.5 ס"מ העפעף חולדה. לתפוס את העין עם מדפים להטות בזהירות לצד כדי לחשוף את הרקמה שמסביב. להנהן את העין על ידי ביצוע חתכים עם מספריים ניתוח ברקמת החיבור והשרירים.

מניחים בקצרה את העין ב-4% פורמלדהיד ותמיסת מלח עם אגירת פוספט למשך שעה עד שתי דקות. יש לשטוף בקצרה במאגר הנתרן לפני ביצוע חור בלימבוס הקרנית על ידי הפעלת לחץ קל עם קצה אזמל. חותכים לאורך לימבוס הקרנית עם מספריים ניתוח כדי להסיר את הקרנית ואת העדשה עם מדחפים.

להטביע את הרקמה הנותרת עם רשתית ב 4% פורמלדהיד ב PBS במשך שעתיים עד ארבע שעות. Cryo-להגן על הרקמה על ידי טבילה במאגר הפוספט של סורנסון המכיל 10% סוכרוז ולאחר מכן 25% סוכרוז. להעביר את הרקמה ברגע שהוא שקע לתחתית המיכל.

מטמיע במדיום Yazulla מוכן עם 3% ג'לטין מעור פורצ'ין ו 30% אלבומין מעוף ביצה לבן. לאחר מכן, חותכים 10 מיקרון קריוסקופים אנכיים של הרשתית מוטבע ג'לטין דרך לעצב הראייה. מניחים את ההקפאות על מגלשת זכוכית ומאפשרים להתייבש למשך שעה לפחות.

לאחר התייבשות, הטביעו את השקופית ב-PBS עם 0.25%Triton-X 100 למשך 15 דקות. לאחר מכן, לטפטף תערובת של 1:100 קולטן PDGF בטא ו 1:500 NG2 נוגדנים ראשוניים PBST ו 1%BSA על ההקפאה ומניחים בתא לח בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת, לשטוף את החלקים על ידי טבילת השקופית PBST פעמיים במשך 15 דקות בכל פעם.

ואז לטפטף תערובת של 1:100 נגד עכבר אלקסה פלואור 594 מקושר ו 1:100 אנטי ארנב FITC מקושר נוגדנים משניים מדולל PBST עם 3%BSA על קריוסקטים דגירה במשך שעה אחת בחושך. לאחר הדגירה, לשטוף את החלקת הזכוכית PBST פעמיים במשך 15 דקות בכל פעם. הר את ההקפאות המוכתמות עם מדיום הרכבה אנטי דהוי המכיל DAPI וכיסוי.

טכניקת הכנה שנייה של רקמת הרשתית היא הר שלם. לאחר הסרת הקרנית, השתמש בתנועות פתיחה קטנות של ממטרים כדי להפריד את הרשתית מאפיתל הפיגמנט ברשתית לכיוון עצב הראייה. לשחרר את הרשתית בעצב הראייה עם מספריים ניתוח ולעשות שלושה עד ארבעה חריצים של כמה מילימטרים באורך מהפריפריה הרשתית לכיוון ראש עצב הראייה.

מורחים את הרשתית על מגלשת זכוכית ומאפשרים להתייבש במשך חמש עד עשר דקות. מטפטף 4% פורמלדהיד על הרשתית ומתקן במשך 20 עד 30 דקות. לאחר קיבעון, לשטוף עם PBS.

לקבלת תוצאות מיטביות, יש לתפוך חיסוני ישירות לאחר שטיפה. ראשית, לטפטף PBST על כל הר הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. יוצקים את PBST, ולאחר מכן מוסיפים את פתרון הנוגדן העיקרי דגירה בתא לח בארבע מעלות צלזיוס לילה.

למחרת, לשפוך את הנוגדן העיקרי לטפטף על PBST לשטוף את הרשתית פעמיים במשך 15 דקות בכל פעם. לאחר שפיכת הכביסה השנייה, מטפטפים תטמין נוגדן משני על הרשתית ומדרגים במשך שעה בתא לח בטמפרטורת החדר בחושך. בעקבות דגירה נוגדנים משנית, לשטוף פעמיים עם PBST כמו קודם.

הר את ההרכבה כולה המוכתמת עם מדיום הרכבה נגד דהיה המכיל DAPI ותרשים כיסוי. חלופה להרכבה שלמה של הרשתית, כלי הדם ברשתית יכולים להיות מבודדים על ידי בידוד היפוטוני. ראשית, מניחים את הרשתית במיליליטר אחד של מים deionized בצלחת 24 באר לנער ב 200 סל"ד עם מסלול רטט 1.5 מילימטר במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף 200 יחידות של DNAse 1 כדי לנטרל את פסולת התא lysed מן כלי הדם הרשתית לנער עוד 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לשטוף את הרשתית במים deionized במשך שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם רועד ב 150 עד 300 סל"ד כדי להסיר פסולת תאים עצביים. הרשתית צריכה להיות שקופה יותר עם כל שטיפה, המעיד על הסרת פסולת תאית עצבית. לאחר שטיפה, לתקן את הרשתית במיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde ו PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

יש לשטוף עם PBS שלוש פעמים. אם נמשיך לכשל חיסוני, חסום את כלי הדם המבודדים ההיפוטוניים עם 500 מיקרוליטרים של סרום חמור 10%מדולל ב- PBS למשך שעה עם רעידות ב-100 סל"ד. לאחר החסימה, דגירה הרשתית לילה ב 600 microliters של פתרון נוגדנים ראשוני המורכב 1:100 PDGF-קולטן בטא ו 1:500 NG2 נוגדנים ראשוניים מדולל 10% נסיוב חמור PBS.

למחרת, לשטוף את רשת הרשתית שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות בכל פעם, ולאחר מכן דגירה 1:100 נגד העכבר Alexa Fluor 594-מקושר ו 1:100 נוגדנים משניים נגד ארנב FITC מקושר, מדולל 10% נסיוב חמור PBS עם רועד ב 100 סל"ד בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת בחושך. לאחר שטיפה של חמש דקות ב- PBST, דגירה ב- DAPI ו- PBST של 0.2 ננוגרם למיליליטר ו- PBST למשך 15 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים במשך חמש דקות באמצעות PBST בעודכם מוגנים מפני אור.

לאחר מכן, חותכים את הקצה של פיפטה פסטר פלסטיק. הסר קצוות חדים באמצעות קצה פיפטה, ולהרים את פיפטה פסטר עם PBST, ולאחר מכן שאפו את כלי הדם הרשתית לתוך פיפטה ולחלק לתוך שקופית תא זכוכית ארבע היטב. הצעד המהנה חשוב כדי למנוע את כלי הדם הרשתית דבק החלק הפנימי של פיפטה פסטר.

מקם את כלי הדם הרשתית על ידי הטיית החלקת התא קדימה ואחורה. הסר את המדיום מ בארות השקופית התאית. מתח פני השטח של הנוזל ישטח את כלי הדם לתחתית המגלשה.

במידת הצורך, טיפות טפטוף של נוזל על כלי הדם הרשתית להתפתח. ודאו שהם נפרשים נכון תחת מיקרוסקופ לפני הסרת בארות הפלסטיק ממגלשת התא. הר את כלי הדם המוכתמים עם מדיום הרכבה אנטי דהוי ותפתק כיסוי.

אימונוהיסטוכימיה NG2 מגלה כלי חיובי בתוך החלק הפנימי של הרשתית. החצים מציינים אימונואקטיביות מעגלית בצורת פרסה בכלי הדם. ראש החץ מצביע על כלי אורך חתוך.

אימונוהיסטוכימיה בטא קולטן PDGF מראה אימונואקטיביות דומה NG2. שוב החצים וראש החץ מצביעים על חוסר פעילות חיסונית בכלי הדם. תמונה זו מציגה מיזוג של NG2 בבטא ירוקה, קולטן PDGF באדום ו- DAPI בכחול.

על ידי העל-פילינג שלושת המסננים השונים, מתגלה כי בטא קולטן NG2 ו- PDGF הם מקומיים במשותף. תמונה זו מציגה הכנה כולה מוכתמת בחיסון עם כתמי NG2 באדום. אימונואקטיביות גלויה לאורך רשת כלי הדם השטחית עם כתמים עזים ב pericytes abluminal.

התאים העצביים נראים כגרעין כחול DAPI בין microvasculature מוכתם NG2. תמונה זו מציגה את רשת כלי הדם של החולדה המבודדת ההיפוטונית המוכתמת ב- NG2 בבטא ירוקה ובטא קולטן PDGF באדום. הרשת המלאה הראתה NG2-אימונואקטיביות.

אימונואקטיביות בטא קולטן PDGF נמצאה סומאס התא. בהגדלה גבוהה יותר, ברור כי כתמי בטא קולטן PDGF נראה רק somas התא ברשת כלי הדם, המציין אימונואקטיביות pericyte. כולל כתמי DAPI יחד עם בטא קולטן NG2 ו- PDGF מגלה שלושה pericytes בשני תאי קיר כלי לא מוגדרים בתמונה זו הגדלה גבוהה.

בעקבות הליכים אלה, ניתן להשתמש בכשלים חיסוניים אחרים כמו תאי שריר חלקים או כתמי אנדותל כדי לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, כיצד תאים בכלי הדם הרשתית נראים בעקבות איסקמיה?