אפיון של Glycoproteins עם הקיפול בנוגדנים על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן וטכניקות ביופיזיקלי

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגליקופרוטאין. מתן תובנה לגבי תפקוד החלבון, תפקידם של גליקנים המקושרים ל-N, והמנגנון והפעולה של אנטיביוטיקה המכוונת לגליקופרוטאין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליישם אותה על כל גליקופרוטאין מעניין.

הקלה על אפיון מבני וביופיזי של מגוון רחב של מטרות גליקופרוטאין. מי שידגים את ההליך הזה יהיה הונג קוי, מתאם פרויקט מחקר במעבדה שלנו. כדי להתחיל, הכן והעבר תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 6, 371 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שמור את ה-supernatant ולאחר מכן השתמש במסנן של 0.22 מיקרון כדי לסנן אותו. טען את הסופרנטנט המסונן במהירות של ארבעה מיליליטר לדקה על עמוד Ni-NTA במערכת כרומטוגרפיה עליונה.

לאחר מכן שטפו את העמוד עם שלושה עד ארבעה נפחים של מאגר כביסה. לדלל את הגליקופרוטאין המטוהר מהעמודה באמצעות שיפוע חיץ פליטה, תוך איסוף שברים. משוך את השברים המכילים את השיא החמקמק במכשיר סינון צנטריפוגלי עם מגבלת משקל מולקולרית נומינלית של 10 קילודלטון.

לאחר מכן מתרכזים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 4, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות או עד שהדגימה מגיעה לנפח של 500 מיקרוליטר. הזרקו את הגליקופרוטאין המרוכז ללולאת דגימה של 500 מיקרוליטר. טען את הגליקופרוטאין על עמודת אי הכללה בגודל בעל ביצועים גבוהים מאוזנת מראש במערכת FPLC בארבע מעלות צלזיוס תוך איסוף שברים.

לאחר מכן הפעל ג'ל SDS-PAGE כדי לזהות אילו שברים חמקמקים מכילים את הגליקופרוטאין ולמשוך את אלה שכן מכילים. באמצעות מכשיר סינון צנטריפוגלי עם מגבלת משקל מולקולרית נומינלית של 10 קילודלטון, יש לרכז ECD טהור נטול גליקוזיל ב-4,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס עד לקבלת הריכוז הרצוי. לאחר קביעת ריכוז החלבון צנטריפוגה הדגימה ב 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, להסרת אבק ומזהמים אחרים.

לאחר מכן, הוסף 80 מיקרוליטר של תמיסת התגבשות ממסך התגבשות מסחרי לכל באר מאגר בצלחת התגבשות טיפה של 96 באר. השתמש ברובוט התגבשות כדי להוציא טיפות חלבון לבארות של צלחת ההתגבשות. שימוש בנפח טיפה כולל של 200 ננוליטר ביחס של אחד לאחד של חלבון מטוהר לתמיסת התגבשות.

לאחר מכן, אטמו את הצלחת בעזרת סרט. העבירו את הצלחת האטומה לצלחת Imager לבדיקה על ידי אור נראה ואולטרה סגול. זהה את התנאים הנותנים ראשי גבישי גליקופרוטאין ראשוניים ובצע אופטימיזציה נוספת של גבישים אלה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הגן על הגבישים בהקפאה על ידי השרייתם בתמיסה של משקה אם בתוספת 20% גליצרול. לאחר מכן הרכיבו את הגבישים ב-CryoLoops. באמצעות חנקן נוזלי, הקפאת בזק את הגבישים המותקנים לפני איסוף הנתונים.

לאחר ייצור גבישים עקיפה היטב בצלחת התגבשות של 24 בארות, הכינו תמיסת מלאי של 50 מילימולרית ליגנד ו-20 מילי-מולרית טריס ב-pH 9.0 עם 150 מילי-מולרי נתרן כלורי. הוסף ריכוזים שונים של תמיסת ליגנד זו לטיפה שהוכנה קודם לכן המכילה את גבישי ה-ECD. אטמו את הטיפה לאורכי זמן הדגירה הנעים בין חמש דקות לחמישה ימים.

באמצעות מיקרוסקופ אור, עקוב חזותית אחר הגבישים כדי לזהות שינויים אפשריים במורפולוגיה. לאחר הדגירה, הרכיבו את הגבישים באמצעות CryoLoops והגנו עליהם בהקפאה בתמיסת משקאות אם בתוספת 20% גליצרול. כדי להתחיל באינטרפרומטריה ביו-שכבתית, הכן 50 מילימטרים של מאגר קינטיקה 1X ממאגר קינטיקה 10X כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר זה לצלחת הרטבה מראש. העבירו שישה חיישנים ביולוגיים של Ni-NTA לצלחת ותנו להם להתייבש במאגר למשך 10 דקות. לאחר מכן, יש לדלל את ה-ECD המתויג במיליליטר אחד של 1X Kinetics Buffer בריכוז סופי של 25 ננוגרם למיקרוליטר.

והכינו דילולים סדרתיים של ה-FAB המטוהר. כעת יש לשטוף את הריאגנטים בצלחת מיקרו של 96 בארות, כפי שניתן לראות כאן. כאשר B מייצג 1X Kinetics Buffer, L מייצג את טעינת הגליקופרוטאין המתויג His, הערכים המספריים מייצגים את ריכוזי ה-FAB המדוללים, ו-R מייצג את מאגר ההתחדשות.

העבירו את החיישנים הביולוגיים המיובשים לבארות המכילות 1X Kinetics Buffer למשך 60 שניות כדי לבסס אותם. לאחר מכן, טען גליקופרוטאין בריכוז של 25 ננוגרם למיקרוליטר למשך 240 שניות ב-1,000 סל"ד. הכנס את החיישנים הביולוגיים בחזרה לבארות המכילות 1X Kinetics Buffer למשך 60 שניות לקו בסיס שני.

העבירו את החיישנים לבארות המכילות את הדילולים הסדרתיים של FAB למשך 180 שניות. לאחר שלב אסוציאציה זה, העבירו את החיישנים הביולוגיים בחזרה ל-1X Kinetics Buffer לשלב דיסוציאציה של 180 שניות. לאחר מכן, פתח את תוכנת הניתוח.

תחת כרטיסיה אחת, ייבא ולאחר מכן בחר את הנתונים. תחת כרטיסיה שנייה, שלב ראשון בחירת נתונים, בחר בחירת חיישן. סמן את בארות הייחוס ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להגדיר את באר הייחוס.

בשלב השני, חיסור, בחר בארות ייחוס. לאחר מכן, תחת שלב שלישי יישור ציר Y, בחר קו בסיס והגדר טווח זמן בין 0.1 שניות ל- 59.8 שניות. בשלב הרביעי בחר תיקון בין-שלבי והתיישר לדיסוציאציה.

לאחר מכן, בשלב החמישי, עבד את סינון סביצקי-גולאי ולחץ על נתוני תהליך. השער לכרטיסייה שלוש. תחת שלב שני ניתוח עם מודל אחד לאחד, בחר שיוך ודיסוציאציה, בחר התאמה כללית וקבץ לפי צבע.

לחץ לחיצה ימנית על העקומות, לחץ על הגדר צבע והגדר את כל העקומות לצבעים הרצויים. לאחר מכן, בחר עקומות התאמה. אם הנתונים מותאמים היטב, ייצא את התוצאה על-ידי לחיצה על שמור דוח.

חזור על הניסוי עבור כל התנאים הרצויים. במחקר זה מספר מבנים של התחום החוץ-תאי CD22 משובטים בהצלחה לווקטור הביטוי pHL-sec. מבנים אלה באים לידי ביטוי יתר על המידה בשורות התאים של היונקים HEK293-F ו-HEK293-S.

בעוד שהתרביות המכילות כמיליון וחצי מיליון תאים למיליליטר, ביטאו רמות דומות מאוד של גליקופרוטאינים. תרביות של חצי מיליון תאים בלבד למיליליטר ביטאו פחות באופן ניכר. לאחר מכן, תרביות נקצרות וגליקופרוטאין ECD מבודד על ידי כרומטוגרפיה של זיקה ואי הכללת גודל כדי לטהר את כל המבנים להומוגניות בגודל.

מניב דגימה טהורה ביותר להתגבשות ומחקרים ביופיזיקליים. בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים של חלקיק יחיד על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי המבנה התלת מימדי של התחום החוץ-תאי באורך מלא או קומפלקסים חלבונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבטא, לטהר ולאפיין מבנית וביופיזית גליקופרוטאינים, הליגנדים שלהם ונוגדני מטרה.