Name: זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: למדו כיצד להשתמש ב-Proximity Ligation Assay (PLA) כדי להדגים הטרודימריזציה של MST1/MST2 בתאים קבועים. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש של אינטראקציות חלבונים במיקום תאי ללא צורך בביטוי טרנסגני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים המעבדה Chernoff כל תורם אופטימיזציה של אימות של פרוטוקול זה, מריה ראדו, גלינה Semenova מסוים. אנו מודים גם אנדריי Efimov מתקן הדמיה תא ב- Fox Chase Cancer Center. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NIH (R01 CA148805) לשם פורשים.

1. הכנת פתרונות
<ol><li>להכין מקבע פתרון: 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1 x PBS. 10 מ"ל, סעו 2.5 מ של 16% PFA ולהוסיף 7.5 mL ל- PBS 1 x. סכנות: כדורגלן הוא מסרטנים במינון נמוך. אדי במגע עם העור הם מסוכנים. חנות ב-20 ° C.</li>
	<li>להכין פתרון permeabilization: 0.1% טריטון X-100 ב 1 x PBS. עבור 100 מ של פתרון, להוסיף 100 µL של טריטון X-100 100 מ של 1 x PBS. לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>להכין מאגר שטיפת: 1 x TBST. 1 ליטר, סעו 100 מ של 10 x TBS מ"ל 890 של dH2O, 10 מ של Tween 20 (10%).</li>
	<li>להכין פתרון חסימה כפי שסופק על-ידי ערכת. לחלופין, השתמש פתרון PBS x 1, המכיל 2% BSA.</li>
	<li>הכינו את diluent נוגדנים כפי שסופק על-ידי ערכת. לחלופין, השתמש 1 x PBS פתרון המכיל 1% BSA.</li>
</ol>2. ציפוי של תאים
הערה: במחקר זה, השתמשנו מונצחים האנושי תאי שוואן (iHSC) ותאים 293 כליות עובריים אנושיים (HEK 293); עם זאת, שיטה זו יכול לשמש עבור סוגים רבים של תאים חסיד.
<ol><li>תרבות HEK 293 ב DMEM בתוספת 10% FBS, 0.2% גלוקוז, 2 מ מגלוטמין, U/mL 100 פניצילין G ו µg 100/mL סטרפטומיצין על צלחות תרביות רקמה שטופלו ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2. לשמור על iHSC ב- 10% FBS/DMEM בתוספת אפשרות למצוא עט ו forskolin 2 מיקרומטר. בודק את התאים עבור mycoplasma. בוצעה ללא אימות השורה של התא.</li>
	<li>מעיל שקופית 16-ובכן קאמרית עם 50 µL של 10 µg/mL העכבר טבעי laminin או 0.01% פולי-L-ליזין פתרון, תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2. פצל תאים באמצעות 0.04% טריפסין-EDTA.</li>
	<li>IHSC צלחת, HEK-293 ב 100 µL בינוני ב 80% הנהרות (15,000-25,000 תאים/טוב).</li>
	<li>דגירה התאים 12 עשרים וארבע שעות ב- 37 מעלות צלזיוס ב humidified, 5% CO2 מיכלים.</li>
</ol>3. קיבוע ו- Permeabilization
<ol><li>הסר את המדיום מן הבארות, לשטוף עם µL 100 ל- 1 x PBS. האחות עם micropipette כדי למזער את הסיכון של הסרת הדגימה.</li>
	<li>לתקן תאים על-ידי הוספת µL 50% 4 מחברים לכל תקופת דגירה של 10 דקות-RT, בלי עצבנות ואוהבים. תאים רגישים ניתוק, כדי להימנע pipetting את הפתרונות ישירות על גבי התאים.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 0.05% TBST שלוש פעמים במשך 5 דקות. האחות עם micropipette כדי למזער את הסיכון של הסרת הדגימה.</li>
	<li>לטיפול תאי עם פתרון permeabilization (0.1% x-100 Triton ב- 1 x PBS) למשך 10 דקות בלי עצבנות-RT.</li>
	<li>רחץ תאים עם TBST שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם עצבנות.</li>
</ol>4. חסימת
<ol><li>הקש את TBST (בעדינות עם micropipette). דמיינו את השקופית במיקרוסקופ כדי לראות אם התאים יישארו מצורפים.</li>
	<li>הוסף טיפה אחת (µL 50-60) של 1 x פתרון חסימת כל דגימה.</li>
	<li>מראש בחום תא לחות (קופסה ריקה עצה עם מים) ב 37 מעלות צלזיוס, דגירה בשקופיות זה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>5. ראשי נוגדנים
<ol><li>לדלל הנוגדנים הראשי (1: 100) ב- Diluent נוגדנים (ראה טבלה של חומרים). להכין פתרון נוגדן µL 40 לכל טוב.</li>
	<li>הסר חסימה פתרון השקופיות על-ידי הקשה את הנוזל. אל תאפשר תאים להתייבש.</li>
	<li>מערבולת ולהוסיף µL 40 של פתרונות נוגדן כל טוב.</li>
	<li>דגירה h 1 ב 37 מעלות צלזיוס בתוך תא לחות טרופה.</li>
</ol>6. הקרבה מצדו Assay הגששים
הערה: ה-PLA הגששים ניתנים כחלק ערכת (ראה טבלה של חומרים). הבחירה של הגששים תלויות המינים של נוגדנים ראשי להשתמש כדי לזהות את החלבונים של ריבית.
<ol><li>לדלל PLA שני רגשים (אנטי-העכבר מינוס, ארנב אנטי פלוס) 1:5 ב Diluent נוגדן. עבור כל דגימה, להכין µL 40 של ה-PLA בדיקה. דגירה את התערובת למשך 20 דקות ב- RT.</li>
	<li>הקש את הפתרון נוגדן ראשוני מהשקופיות. לשטוף את השקופיות פעמיים במשך חמש דקות כל עם מאגר לשטוף-RT.</li>
	<li>בעדינות הקש על המאגר שטיפת מהשקופיות ולהוסיף את הפתרון בדיקה PLA diluent וולס (40 µL טוב).</li>
	<li>דגירה השקופיות תא לחות מחומם מראש עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>7. מצדו
הערה: בחיי עיר זיהוי ריאגנטים אדום ליגאז, הפתרון מצדו ניתנים כחלק ערכת (ראה טבלה של חומרים).
<ol><li>השתמש את בחיי עיר זיהוי ריאגנטים אדום.</li>
	<li>מיד לפני השימוש, מערבולת, לדלל את אמצעי האחסון הדרושים של 5 x מצדו מלאי מים טוהר גבוהה בתוך 1:5. הערה: אל תאחסן ריאגנטים מדולל.</li>
	<li>הקש את הפתרון בדיקה PLA מהשקופיות. לשטוף את השקופיות 1 x מאגר לשטוף פעמיים במשך 5 דקות כל-RT.</li>
	<li>מיד לפני תוספת הדגימות, מערבולת, הוספת ליגאז הפתרון מצדו בשעה 1:40 דילול ו מערבולת שוב.</li>
	<li>הקש את המאגר שטיפת מהשקופיות ולהוסיף את הפתרון מצדו/ליגאז מכל קידוח (40 µL טוב).</li>
	<li>דגירה השקופיות בחדר מחומם מראש לחות למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>8. הגברה
הערה: המניה הגברה מסופק כחלק ערכת (ראה טבלה של חומרים). ריאגנטים הם רגיש אור; ובכך למנוע חשיפת שהשקופיות אור.
<ol><li>מערבולת, לדלל את אמצעי האחסון הדרושים של 5 x הגברה מניות 1:5 במים טוהר גבוהה ומערבבים.</li>
	<li>הקש את הפתרון מצדו/ליגאז מהשקופיות. לשטוף את השקופיות 1 x מאגר לשטוף פעמיים למשך 2 דקות כל-RT.</li>
	<li>מערבולת ולהוסיף את פולימראז הפתרון הגברה דילול 1:80 ו מערבולת שוב.</li>
	<li>הקש את מאגר שטיפת מהשקופיות ולהוסיף את הפתרון הגברה/פולימראז מכל קידוח (40 µL טוב). דגירה השקופיות תא לחות מחומם מראש עבור 100 דקות ב 37 º C.</li>
</ol>9. הכנה הדמיה
הערה: אלה ריאגנטים רגיש אור. שמור את השקופיות מוגן מפני אור.
<ol><li>הקש את הפתרון הגברה-פולימראז מהשקופיות ולשטוף פעמיים במשך 10 דקות כל ב 1 x שטיפת מאגר-RT.</li>
	<li>להסיר את תאי סיליקון מסביב הבארות משקופית לחלוטין. לגרד את הסיביות הנותרות של סיליקון עם סכין גילוח. לצייר רשת בשקופית הפרדת כל טוב.</li>
	<li>להוסיף ~ 40 µL של המדיום הרכבה עם דאפי. להיות זהירים כדי למנוע השמנה בועות אוויר תחת תגית כיסוי. הקצוות של תגית הכיסוי ניתן לחתום עם לק.</li>
	<li>להמתין לפחות 20 דקות לפני ביצוע ניתוח התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה.</li>
	<li>לאחר דימות, לאחסן את השקופיות ב-20 ° C בחושך.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nore1B%2FMst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na%C3%AFve+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li>
<li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOBKL1A%2FMOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li>
<li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1%2FMst2Heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li>
<li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20-like+protein+kinase%2C+Mst1%2C+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li>
<li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li>
<li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

מצאנו את זה שימושי כדי להשתמש זכוכית קאמרית שקופיות עבור הניסוי זה מאוד נוח לבצע ניסוי עם מספר שורות תאים (14-16), אין צורך לשנות את הדגימה בכל פעם במהלך ניתוח מיקרוסקופ. כמה סיבוכים שעלולים להתעורר, כגון סיכון מוגבר זיהום, עם נוגדנים. לכן, אנו ממליצים לשטוף כל טוב בנפרד במקום להשתמש צנצנת Coplin, למרות משך מוגברת של הניסוי. בנוסף, הסרת סיליקון הוספה הוא רומן עדין, חייב להיעשות עם טיפול וסבלנות. אפילו עם טכניקה מוקפד, זה לפעמים ניתן לראות כמויות קטנות של סיליקון פסולת לאחר הסרת תותב. מסיבה זו, אחד עליך להסיר את תותב סילי...

שיבוש MST1/היפו איתות חובר ל הפרעות התפתחותיות carcinogenesis1. ביונקים, להפעיל kinases MST1 ו- MST2 (phosphorylate) MOB1 ו- LATS1/2, הצופות על phosphorylates ואז חלבונית תעתיק שיתוף activator חלבונים הקשורים כן (הפה)2. (Unphosphorylated) בצורתו הפעילה, הפה יש פעילות oncogenic, שיפור שעתוק של גנים התפשטות תאים; לעומת זאת, כאשר הפה הוא מומת על ידי השביל היפו, התפשטות תאים מדוכא, אפופטוזיס בדרגה3. ברקמות, MST1 ו- MST2 קיים בעיקר בתור homodimers פעיל, אבל גירויים oncogenic יכול להגביר את רמות של MST1/MST2 heterodimers, ויש כאלה heterodimers לא פעיל4. עם זאת, כמה heterodimerization MST1/MST2 מוסדר נשאר ממעטים להבין. גם הומו - וגם heterodimers הם בתיווך דרך אינטראקציות בין C-מסוף סליל מפותל מחוזות MST1 MST2 הידועה בשם שרה תחומים5. באמצעות יישום בחיי עיר PLA הפגינו במאמר זה, נוכל להציג את הנוכחות של MST1/MST2 heterodimers בתאים תאי שוואן אנושי (HSC) וכליות עובריים אנושיים (HEK-293). PLA יש יתרון על פני אחרים/חלבון עצבו זיהוי משום שהיא מאפשרת הגילוי של אינטראקציות חלבון אנדוגני, אשר ניתן לזהות לכמת ללא הצורך של ביטוי transgene או את השימוש epitope תגיות 6.
התמרה חושית איתות המסלולים נשלטים במידה רבה על ידי האגודה מותנה של רכיב חלבונים. לדוגמה, גירוי של רוב קולטן טירוזין kinases מוביל שלהם הומו - או הטרו-dimerization הבאים שיוך נוספים חלבונים איתות תאיים, אשר עצמם מתחמי טופס נוסף. המטרה של שיטת ה-PLA היא להמחיש את הקרבה בין סוגי החלבונים בתאים, ובלבד החלבונים נמצאים פחות מ 30-40 ננומטר בנפרד. חלבון קרבה לרוב מאותרים על ידי הראשון המקננת התאים עם נוגדנים הראשי המתאים העולות מינים שונים (למשל., ראביט, עכבר) נגד כל חלבון אינטראקציה, ואז הוספת נוגדנים תלויי מין משניים, DNA מראש בשילוב כדי קצר רגשים. אם הגששים DNA בסמיכות, oligonucleotide דנ א קישור ספציפי באפשרותך לאגוד בו זמנית הן של אלה הגששים, ויצרו פלטפורמה עבור הגברה באמצעות בחיי עיר PCR או על ידי גלגול מנגנון מעגל. תגיות פלורסנט נוספו התגובה הגברה לאפשר ויזואליזציה של החלבונים אינטראקציה, אשר מופיעים כנקודות פלורסנט שניתן בקלות לכמת או מקומית אזורים מסוימים ב-7,תא8, 9 , 10.

<table><tbody><tr><td>מגלשות תא</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>178599</td><td>16 באר, שקופיות זכוכית</td></tr><tr><td>בדיקת PLA נגד עכבר מינוס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>DUO92004</td><td>מכיל תמיסת חסימה 1x, 1x נוגדן</td></tr><tr><td>מדלל PLA בדיקה אנטי-ארנב PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>מכיל 1x תמיסת חסימה, 1x נוגדנים מאגרי כביסה מדללים</td></tr><tr><td>, Flurescence</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>מכיל מאגר כביסה A ומאגר כביסה B</td></tr><tr><td>מדיום הרכבה עם ריאגנטים לזיהוי</td><td>DUO82040</td><td></td>DAPI <td>סיגמא-אולדריץ</td></tr>' <tr><td>אדום</td><td></td><td>DUO92008</td><td>מכיל 5x קשירה, 1x ליגאז, 5x אמיליפיקציה אדום, 1x פולימראז</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) איתות תאי נוגדנים</td><td></td><td>9102s</td><td></td></tr><tr><td>פוספו-p44/42 MAPK (erk1) (tyr204)/(erk2) (Tyr187)תא</td><td> איתות</td><td>5726s</td><td>pERK נוגדן</td></tr><tr><td>MST2</td><td>איתות תאים</td><td>3952s</td><td></td></tr><tr><td>Krs-2 (RJ-5)</td> <td>סנטה קרוז</td><td>sc-100449</td><td>MST1 נוגדן</td></tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד</td><td>מיקרוסקופ אלקטרונים מדעי</td><td>15710</td><td>לדלל ל -4% PFA ב- PBS לקיבוע תמיסה</td></tr><tr><td>טריטון x100</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP 151-500</td><td>להכנת 0.1% Triton x-100 ב-1xPBS לפתרון פרמביליזציה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה קונפוקלית</td><td>Leica TCS SP8, ניתוח תמונה 63x</td><td></td><td>עם תוכנת ImageJ</td></tr></tbody></table>

זיהוי של heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

אינטראקציות חלבון מוסדר כעיקרון המנחה לאירועים איתות רבים, זיהוי אירועים כאלה הוא מרכיב חשוב בהבנת כמה מסלולים כאלה מאורגנים, כיצד הן פועלות. ישנן שיטות רבות לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים, אבל יחסית מעטים ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציות בין חלבונים אנדוגני. אחד שיטה כזו, הקרבה מצדו וזמינותו (PLA), יש מספר יתרונות להמליץ על השימוש בו. לעומת שיטות נפוצות אחרות של ניתוח אינטראקציית חלבון-חלבון, פלה יש רגישות גבוהה יחסית, ניתן לבצע עם מניפולציה תא מינימלי, ו, ב פרוטוקול המתוארים בזאת, מחייב רק שני במטרה נוגדנים נגזר מינים שונים (למשל., עכבר, ארנב), ריאגנט מתמחה אחד: ערכה של נוגדנים משניים שאינם oligonucleotides covalently מקושר ספציפי זה, הביאה בסמיכות אחד לשני, ליצור פלטפורמת amplifiable בחיי עיר PCR או מתגלגל מעגל ההגברה. במצגת זו, אנו מציגים כיצד ליישם את הטכניקה PLA להמחיש שינויים בסמיכות MST1 ו- MST2 בתאים קבוע. בטכניקה המתוארת בכתב היד ישימה במיוחד לניתוח של התא איתות מחקרים.

השתמשנו וזמינותו PLA לבחון את האינטראקציה בין MST1 לבין MST2 HEK-293, iHSC. התאים היו קבועים, permeabilized, מוכתם נוגדנים שונים, ואחריו בחיי עיר הגברה לפי הפרוטוקול פלה (איור 1). לתעד את רמת heterodimerization MST1/MST2, התאים היו מוכתמים נוגדנים MST1 ו- MST2 (איור 1 א', 1 ג, 1 G). כפקד חיובית, השתמשנו גם טיפשה, נוגדנים ההטבות צפויים להיות בסמיכות בתאים עם הפעלת טיפשה (איור 1B</stro...

כאן, אנו מראים כיצד להשתמש Assay מצדו קרבה (PLA) כדי להמחיש את MST1/MST2 heterodimerization בתאים קבוע עם רגישות גבוהה.

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Assay רצועות קרבה במקום או PLA, היא טכנולוגיה המסוגלת לזהות אינטראקציות בין חלבונים, רקמות מודבקות, ותאים. הקשרים בין חלבונים ניתן לזהות ולכומת ללא צורך בביטוי מהופנט או טכנאים נוספים. הדרישה היחידה היא הזמינות של נוגדנים ספציפיים ביעילות גבוהה שניתן לשנות עם אוליגונוקלאוטידים DNA.ברקמות MST1 ו MST2 קיימים בעיקר כמו homodimers פעיל, אבל גירויים אונקוגניים יכולים להגדיל את הרמה של MST1 MST2 הטרודימרים הטרודימרים כאלה אינם פעילים. לאחר הדגירה עם נוגדני פריימר ספציפיים נגד חלבוני העניין, נוגדנים משניים ספציפיים מיוחדים, שכל אחד מהם מקושר לגדיל DNA ייחודי, קצר ומחמיל המחובר אליו, מתווספים לחריץ כדי להיקשר לנוגדנים העיקריים. אם החלבונים בשאלות הם הטרודימרים, הן הנוגדנים העיקריים והן הנוגדנים המשניים הקשורים אליהם יהיו בסמיכות.במצב זה, גדילי הדנ"א המצורפים על הנוגדנים השניים יכולים לקיים אינטראקציה באמצעות תוספת עוקבת של שני אוליגונוקלאוטידים דנ"א אחרים יוצרי מעגל. כמה מאות שכפול של מעגל ה- DNA יכול להתרחש לאחר תגובת הגברה ואות פלואורסצנטי נוצר על ידי בדיקות אוליגונוקלאוטיד משלימות. לכן, כל אות שזוהה הוא חזותי כנקודה פלואורסצנטי בודדת אשר ניתן להקצות למיקום תת תאי ספציפי המבוסס על תמונות מיקרוסקופ.ביום שלפני הניסוי, מעיל 16 מגלשות היטב על ידי הוספת 50 עד 100 microliters של למינין העכבר או פולי-L-ליסין ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות להסיר פתרון קר, לפצל את התאים באמצעות טריפסין צלחת 15, 000 כדי 25, 000 תאים לכל גם לתוך 16 שקופית תאים היטב. תאי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני לח אינקובטור במשך 24 שעות.לאחר 24 שעות, להסיר את המדיום מן בארות בעדינות לשטוף את התאים עם PBS. השתמש micropipette כדי למזער את לקיחת הסיכון של המדגם ואז לשאוב את PBS ולתקן תאים על ידי הוספת 50 microliters של 4% PFA לגם דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. אין לצנרת את הפתרון ישירות על התאים, שכן הדבר עלול לגרום לניתוק התאים.לאחר הקיבעון, לשטוף את התאים עם TBST שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם תסיסה קלה. לאחר מכן לחלחל את התאים דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. לאחר permeabilization הושלם, לשטוף את התאים עם TBST שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף עם תסיסה.לאחר הסרת TBST להוסיף טיפה אחת של פתרון חסימה לתוך כל באר הדגירה את השקופיות בתא לחות שחומם מראש במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. לדלל נוגדנים ראשוניים. הסר את פתרון החסימה באמצעות מיקרופיגט אך אל תאפשר לשקופיות להתייבש.Vortex ולהוסיף 40 microliters של פתרון נוגדנים מדולל ל בארות המתאימות להדגיר את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס בתא לחות שחומם מראש במשך שעה אחת. במהלך הדגירה, לדלל את שתי בדיקות PLA בדילול נוגדנים. עבור כל מדגם להכין 40 microliters של בדיקה PLA.לאחר שעה אחת של דגירה, שאפו את תסנובת הנוגדנים ושטפו שקופיות פעמיים במשך חמש דקות עם TBST בטמפרטורת החדר. הסר בעדינות את ה- TBST מהשקופיות והוסף 40 מיקרוליטרים של פתרון הבדיקה PLA לכל באר. הדגירה את המגלשות בתא לחות שחומם מראש במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.Vortex ולדלל את הנפחים הנדרשים של מלאי קשירה 1 עד 5 במים טוהר גבוה מיד לפני השימוש. 40 מיקרוליטרים של פתרון הרצועה נדרשים עבור כל באר. לאחר הדגירה, הסר את פתרון PLA מהמגלשות ושטף אותם פעמיים ב- TBST במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה.השתמש בלוק הקפאה בעת הסרת רצועות מהמקפיא וקצת לפני הוספתו לתאים, מערבולת לדלל אותו עם פתרון קשירה. הסר את ה- TBST מהשקופיות והוסף 40 מיקרוליטרים של פתרון רצועות הרצועה לכל באר. הדגירה מחליקה בתא לחות שחומם מראש למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה שאפו את הפתרון ושטפו פעמיים עם TBST במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה. הימנע מחשיפת באר לאור בהיר כמו reagents רגישים לאור. במהלך הכביסה האחרונה, מערבולת לדלל את כמויות הדרישה של פתרון הגברה במים טוהר גבוהה מיד לפני השימוש.שמור את הפולימראז על קרח או בבלוק קירור וקצת לפני הוספתו למערבולת התאים ולדלל עם פתרון ההגברה. שאפו את ה- TBST מהבארים והוסיפו 40 מיקרוליטרים של פתרון הגברה לכל באר. דגירה מחליקה בתא לחות מחומם מראש כהה במשך 100 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, שאפו את פתרון הפולימראז של ההגברה מהמגלשות ושטפו פעמיים עשר דקות כל אחת ב- TBST בטמפרטורת החדר. הסר את התאים ואת הסיליקון סביב בארות מן השקופית לחלוטין. לגרד את חרוזים הנותרים של סיליקון עם סכין גילוח.צייר רשת בשקופית המפרידה בין כל באר. הוסף כ-40 מיקרוליטרים של מדיום ההרכבה באמצעות DAPI, כדי להבטיח שאף בועות אוויר לא ייתפסו מתחת לפתק הכיסוי. השתמש לק כדי לתקן זכוכית כיסוי.ניתוח מיקרוסקופי יכול להתבצע בתוך 20 דקות לאחר קיבעון, אבל בפועל אנו מוצאים את זה הכי נוח לבצע ניתוח תמונה למחרת. כדי לנתח את הדגימות, אנו משתמשים Leica SP8 להגדיר מיקרוסקופ סריקת לייזר. מוצגות להלן דוגמאות של חקירה של רצועות קרבה במקום המדמיין קרבה בין חלבוני MST 1 ו- MST2 בתאי כליות עובריים אנושיים בלוחות A עד D, ותאי שוואן אנושיים בלוחות E עד H.In כל גרעיני התאים של הלוחות מוכתמים בכחול על ידי DAPI ונקודות אדומות מצביעות על אותות סחיטה חיוביים של רצועות קירבה הנובעים מקרבה בין החלבונים שצוינו.פאנל A מראה קרבה של MST1 ו MST2 ו פאנל B מראה קרבה של ERK ו phosphoERK כמו epitopes אלה נמצאים על אותו חלבון. לוח C מייצג פקד שלילי כמו תאים אלה כמו MST1 ו MST2 ו לוח D מייצג פקד שלילי שני מוכתם בנוגדנים עבור MST1 ו- ERK אשר אינם צפויים להיות בסמיכות זה לזה. לוחות E ו- F מראים קרבה של MST1 עם MST2 ו- ERK עם phosphoERK בתאי שוואן.לוח G ו- H הם פקדים שליליים מוכתמים רק בנוגדני MST1 או בנוגדני MST1 ו- ERK. זה הכרחי להשתמש בנוגדנים ראשוניים שאינם חוצי תגובתי כי זה צריך להכיר רק חבר אחד של הטרודימר. כמו כן חשוב לזכור להשתמש בטיפים שונים כדי למנוע זיהום צולב של נוגדנים ראשוניים ובדיקות PLA, כדי למנוע נגיעה בתחתית הבאר, ולהימנע צינורות ישירות על דגימות.לאחר צפייה בסרטון זה אתה צריך הבנה טובה של איך להשתמש situ PLA ללמוד דימריזציה חלבון בתאים קבועים.

detection-heterodimerization-protein-isoforms-using-an-situ-proximity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כאן אנו מראים כיצד להשתמש קשירת הסמיכות Assay (PLA), עם שילוב של נוגדנים לדמיין המוךפו"גנטי שהולך עצם חלבון (BMP) איתות תאים קבוע. טכניקה זו אפשרה לנו לעקוב אחר הצטברות הגרעין של BMP אנדוגני מופעל מפעיל, מתחמי ולכמת רמות שלהם לאורך זמן תחת גירוי BMP4.

איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות

סרטון זה מתאר את בדיקת קשירת הקרבה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון באתרן בתאי נמטודה. הקרבה של החלבונים המעניינים יוצרת את תבנית הדנ"א המעגלית בעזרת גשושית PLA המחוברת לנוגדן משני. הגשושית מוגברת עוד יותר באמצעות תמיסת ההגברה, המייצרת DNA חד גדילי ארוך ואחריו הכלאה של הגשושית הגלאי, המאפשרת לוקליזציה של אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים.

בדיקת קשירת קרבה ללימוד אינטראקציות חלבון-חלבון באתרו

פרוטוקול זה מדגים כיצד סמיכות קשירת Assay יכול לשמש כדי לזהות באינטראקציות חלבון-חלבון אתרו בצומת העצבית-שרירית זחל תסיסנית. בעזרת טכניקה זו, שאו טאי גדול והו-לי דיסקים מוצגים בצורה מורכבת באזור postsynaptic, עמותה זוהתה בעבר באמצעות שיתוף immunoprecipitation.

זיהוי של באתר מכלולי חלבון-חלבון ב דרוזופילה הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

אינטראקציות חלבון-חלבון יכולות להתרחש הן בגרעין והן בציטופלזמה של התא. כדי לחקור אינטראקציות אלה, מיושמים קו-אימונו-משקעים מסורתיים ובדיקת קשירת קרבה מודרנית. במחקר זה, אנו משווים את שתי השיטות הללו כדי לדמיין את התפלגות האינטראקציות של NF90-RBM3 בגרעין ובציטופלזמה.

ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

פרוטוקול זה מתאר גישה ללא כיול עבור לכימות חלבון ההומו-oligomerization במבחנה מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה באמצעות סריקה מיקרוסקופ אור מסחרי. שיטות ניתוח וההגדרות רכישה נכונה מוצגים.

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Cognate J-דומיין חלבונים לשתף פעולה עם המלווה Hsp70 לסייע במגוון של תהליכים ביולוגיים החל קיפול חלבון להשפלה. כאן, אנו מתארים את הקירבה באתרו בתוך הסמיכות, אשר מאפשר את הניטור של המלווה האלה בmachineries בלתי מלווה בחיידקים, שמרים ובתאי אדם.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

מבחני לכידת לולאת D (DLC) והרחבת לולאת D (DLE) משתמשים בעקרון קשירת הקרבה יחד עם PCR כמותי כדי לכמת היווצרות לולאת D, הרחבת לולאת D והיווצרות מוצרים באתר של שבר דו-גדילי אינדוקטיבי ב- Saccharomyces cerevisiae.

איתור מתווכי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות קשירת קרבה ו-PCR כמותי ב-Saccharomyces cerevisiae

למדו כיצד להשתמש ב-Proximity Ligation Assay (PLA) כדי להדגים הטרודימריזציה של MST1/MST2 בתאים קבועים. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגיש של אינטראקציות חלבונים במיקום תאי ללא צורך בביטוי טרנסגני.

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

גלה סרטונים נוספים