זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

Assay רצועות קרבה במקום או PLA, היא טכנולוגיה המסוגלת לזהות אינטראקציות בין חלבונים, רקמות מודבקות, ותאים. הקשרים בין חלבונים ניתן לזהות ולכומת ללא צורך בביטוי מהופנט או טכנאים נוספים. הדרישה היחידה היא הזמינות של נוגדנים ספציפיים ביעילות גבוהה שניתן לשנות עם אוליגונוקלאוטידים DNA.

ברקמות MST1 ו MST2 קיימים בעיקר כמו homodimers פעיל, אבל גירויים אונקוגניים יכולים להגדיל את הרמה של MST1 MST2 הטרודימרים הטרודימרים כאלה אינם פעילים. לאחר הדגירה עם נוגדני פריימר ספציפיים נגד חלבוני העניין, נוגדנים משניים ספציפיים מיוחדים, שכל אחד מהם מקושר לגדיל DNA ייחודי, קצר ומחמיל המחובר אליו, מתווספים לחריץ כדי להיקשר לנוגדנים העיקריים. אם החלבונים בשאלות הם הטרודימרים, הן הנוגדנים העיקריים והן הנוגדנים המשניים הקשורים אליהם יהיו בסמיכות.

במצב זה, גדילי הדנ"א המצורפים על הנוגדנים השניים יכולים לקיים אינטראקציה באמצעות תוספת עוקבת של שני אוליגונוקלאוטידים דנ"א אחרים יוצרי מעגל. כמה מאות שכפול של מעגל ה- DNA יכול להתרחש לאחר תגובת הגברה ואות פלואורסצנטי נוצר על ידי בדיקות אוליגונוקלאוטיד משלימות. לכן, כל אות שזוהה הוא חזותי כנקודה פלואורסצנטי בודדת אשר ניתן להקצות למיקום תת תאי ספציפי המבוסס על תמונות מיקרוסקופ.

ביום שלפני הניסוי, מעיל 16 מגלשות היטב על ידי הוספת 50 עד 100 microliters של למינין העכבר או פולי-L-ליסין ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות להסיר פתרון קר, לפצל את התאים באמצעות טריפסין צלחת 15, 000 כדי 25, 000 תאים לכל גם לתוך 16 שקופית תאים היטב. תאי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני לח אינקובטור במשך 24 שעות.

לאחר 24 שעות, להסיר את המדיום מן בארות בעדינות לשטוף את התאים עם PBS. השתמש micropipette כדי למזער את לקיחת הסיכון של המדגם ואז לשאוב את PBS ולתקן תאים על ידי הוספת 50 microliters של 4% PFA לגם דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. אין לצנרת את הפתרון ישירות על התאים, שכן הדבר עלול לגרום לניתוק התאים.

לאחר הקיבעון, לשטוף את התאים עם TBST שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד עם תסיסה קלה. לאחר מכן לחלחל את התאים דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. לאחר permeabilization הושלם, לשטוף את התאים עם TBST שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף עם תסיסה.

לאחר הסרת TBST להוסיף טיפה אחת של פתרון חסימה לתוך כל באר הדגירה את השקופיות בתא לחות שחומם מראש במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. לדלל נוגדנים ראשוניים. הסר את פתרון החסימה באמצעות מיקרופיגט אך אל תאפשר לשקופיות להתייבש.

Vortex ולהוסיף 40 microliters של פתרון נוגדנים מדולל ל בארות המתאימות להדגיר את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס בתא לחות שחומם מראש במשך שעה אחת. במהלך הדגירה, לדלל את שתי בדיקות PLA בדילול נוגדנים. עבור כל מדגם להכין 40 microliters של בדיקה PLA.

לאחר שעה אחת של דגירה, שאפו את תסנובת הנוגדנים ושטפו שקופיות פעמיים במשך חמש דקות עם TBST בטמפרטורת החדר. הסר בעדינות את ה- TBST מהשקופיות והוסף 40 מיקרוליטרים של פתרון הבדיקה PLA לכל באר. הדגירה את המגלשות בתא לחות שחומם מראש במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.

Vortex ולדלל את הנפחים הנדרשים של מלאי קשירה 1 עד 5 במים טוהר גבוה מיד לפני השימוש. 40 מיקרוליטרים של פתרון הרצועה נדרשים עבור כל באר. לאחר הדגירה, הסר את פתרון PLA מהמגלשות ושטף אותם פעמיים ב- TBST במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה.

השתמש בלוק הקפאה בעת הסרת רצועות מהמקפיא וקצת לפני הוספתו לתאים, מערבולת לדלל אותו עם פתרון קשירה. הסר את ה- TBST מהשקופיות והוסף 40 מיקרוליטרים של פתרון רצועות הרצועה לכל באר. הדגירה מחליקה בתא לחות שחומם מראש למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה שאפו את הפתרון ושטפו פעמיים עם TBST במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה. הימנע מחשיפת באר לאור בהיר כמו reagents רגישים לאור. במהלך הכביסה האחרונה, מערבולת לדלל את כמויות הדרישה של פתרון הגברה במים טוהר גבוהה מיד לפני השימוש.

שמור את הפולימראז על קרח או בבלוק קירור וקצת לפני הוספתו למערבולת התאים ולדלל עם פתרון ההגברה. שאפו את ה- TBST מהבארים והוסיפו 40 מיקרוליטרים של פתרון הגברה לכל באר. דגירה מחליקה בתא לחות מחומם מראש כהה במשך 100 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, שאפו את פתרון הפולימראז של ההגברה מהמגלשות ושטפו פעמיים עשר דקות כל אחת ב- TBST בטמפרטורת החדר. הסר את התאים ואת הסיליקון סביב בארות מן השקופית לחלוטין. לגרד את חרוזים הנותרים של סיליקון עם סכין גילוח.

צייר רשת בשקופית המפרידה בין כל באר. הוסף כ-40 מיקרוליטרים של מדיום ההרכבה באמצעות DAPI, כדי להבטיח שאף בועות אוויר לא ייתפסו מתחת לפתק הכיסוי. השתמש לק כדי לתקן זכוכית כיסוי.

ניתוח מיקרוסקופי יכול להתבצע בתוך 20 דקות לאחר קיבעון, אבל בפועל אנו מוצאים את זה הכי נוח לבצע ניתוח תמונה למחרת. כדי לנתח את הדגימות, אנו משתמשים Leica SP8 להגדיר מיקרוסקופ סריקת לייזר. מוצגות להלן דוגמאות של חקירה של רצועות קרבה במקום המדמיין קרבה בין חלבוני MST 1 ו- MST2 בתאי כליות עובריים אנושיים בלוחות A עד D, ותאי שוואן אנושיים בלוחות E עד H.In כל גרעיני התאים של הלוחות מוכתמים בכחול על ידי DAPI ונקודות אדומות מצביעות על אותות סחיטה חיוביים של רצועות קירבה הנובעים מקרבה בין החלבונים שצוינו.

פאנל A מראה קרבה של MST1 ו MST2 ו פאנל B מראה קרבה של ERK ו phosphoERK כמו epitopes אלה נמצאים על אותו חלבון. לוח C מייצג פקד שלילי כמו תאים אלה כמו MST1 ו MST2 ו לוח D מייצג פקד שלילי שני מוכתם בנוגדנים עבור MST1 ו- ERK אשר אינם צפויים להיות בסמיכות זה לזה. לוחות E ו- F מראים קרבה של MST1 עם MST2 ו- ERK עם phosphoERK בתאי שוואן.

לוח G ו- H הם פקדים שליליים מוכתמים רק בנוגדני MST1 או בנוגדני MST1 ו- ERK. זה הכרחי להשתמש בנוגדנים ראשוניים שאינם חוצי תגובתי כי זה צריך להכיר רק חבר אחד של הטרודימר. כמו כן חשוב לזכור להשתמש בטיפים שונים כדי למנוע זיהום צולב של נוגדנים ראשוניים ובדיקות PLA, כדי למנוע נגיעה בתחתית הבאר, ולהימנע צינורות ישירות על דגימות.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה צריך הבנה טובה של איך להשתמש situ PLA ללמוד דימריזציה חלבון בתאים קבועים.