Name: מיפוי החומרים: פיקוח על פעילות לקטט דהידרוגנאז ישירות בתוך הרקמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: למדו לזהות פעילות לקטט דהידרוגנאז ישירות ברקמות עכברים בשיטת מיפוי אנזימטי מרחבי. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מדויקת של פעילות NAD(P)H בתאי גזע של זקיקי שיער וביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HAC היה המלומד במילטון אי קסל של קרן אלן ריטה (http://www.ritaallenfoundation.org). עבודה זו מומן על ידי מענקים כדי HAC מן הלאומית המכון של R01 מדעי רפואי כללי GM081686, R01 AR070245, המכון הלאומי של כללי רפואי (מדעי R01 GM0866465, אלי & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר בתאי גזע רוז והרי האל גאבא פרסים), הבריאות מרכז/UCLA CTSI NIH גרנט UL1TR000124, לוקמיה לימפומה החברה, השפעת איריס חזן הנשים פרסים של Jonsson מקיף במרכז לחקר הסרטן אל טוב ואל -חאק. מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר P50CA092131. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. HAC הוא חבר של אלי את & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר תאי גזע, המכון לביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת UCLA, התוכנית באצירת לביואינפורמטיקה באוניברסיטת UCLA.

כל הניסויים המתוארים אושרו על ידי ועדת אכפת לי חיה ב אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס.
1. ליצור שקופיות של העור העכבר קפוא
<ol><li>המתת חסד עכברים בהתאם למדיניות המוסד. הערה: בצע את מדיניות מוסדית עבור ביגוד מגן. כל הפרוטוקולים המערבות בעלי חיים תאושר ע י הוועדה המוסדית אכפת לי בעל חיים.</li>
	<li>להסיר השיער של העכבר עם טרימר שיער בעלי חיים.</li>
	<li>לעשות חתכים בעור באמצעות מספריים. באמצעות מלקחיים, הרם את העור מן העכבר. בעזרת מספריים, לחתוך את המקטע העור.</li>
	<li>למלא את cryomold עם מקפיא ריאגנט מורכבים (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>במקום סעיפים העור לתוך cryomolds מלא באמצעות מלקחיים שפיץ. אוריינט העור כך רקמות פרוסות יפיק חתך רוחב של העור מכל האפידרמיס הדרמיס, ובהיפודרמיס, שרירים (איור 2). הערה: אם הדבר אפשרי, הר ניסיוני ושליטה עכברים יחד ב cryomold אותו אז הם ניתן למחלקה אותן לשקופית באותה ולעבד יחד. לטפל לא כדי ליצור בועות.</li>
	<li>במקום cryomold על משטח שטוח של גוש קרח יבש ב דלי קרח ואפשר להקפיא. ממשיכים לבחון את הכיוון של העור. התאם במידת הצורך. הערה: ללבוש כפפות קריוגני בעת טיפול בקרח יבש.</li>
	<li>העברת cryomolds בפריזר-80 ° C עבור אחסון. דוגמאות יכול להישמר במקרר כ 3 חודשים ללא אובדן משמעותי של פעילות אנזימטיות. אל תתנו מקטעים קפוא להתייבש.</li>
	<li>שימוש cryostat ב-20 ° C, פרוסה רקמות כדי ליצור מקטעים 7-10 מיקרומטר עבה מורפולוגיה העור הטוב ביותר21.</li>
</ol>2. הכנת את שקופיות עבור צביעת
<ol><li>להקים את קבוצת שקופיות להיבדק. לכלול שקופית הפקד שעליו יתעכב NAD והחלק פקד אחר שבו המצע, לקטט, תמנע. לכלול שקופית בקרה חיובית של בלוק קפוא רקמות בעבר חקרו.</li>
	<li>בקצרה לתקן שקופיות המכילה סעיפים העור עם 4% פורמלין במשך 5 דקות או על ידי pipetting 1 מ"ל של 4% פורמלין אותן לשקופית, או בעת עיבוד שקופיות מרובות, בטבילת מגלשות לתוך מיכל המכיל 4% פורמלין. הערה: הקיבעון יבטיח שהעור ואינה מתקלפת מהשקופיות במהלך ההליכים הבאים לשמר המורפולוגיה העור. זהירות: פורמלין היא גורם מסרטן ו מסוכנים; יש ללבוש כפפות, לא לתת לזה לגעת בעור שלך ולבצע שלב זה בשכונה fume כימי.</li>
	<li>שקופיות תשטוף לפחות 1 mL פוספט buffered תמיסת מלח, pH 7.4, לכל שקופית על-ידי pipetting או טבילה.</li>
</ol>3. הכנת מכתים פתרון
<ol><li>מערבולת יחד ריאגנטים עבור צביעת פעילות לקטט דהידרוגנאז (50 מ מ טריס pH 7.4, 750 NADP מיקרומטר, 80 methosulfate phenazine מיקרומטר (PMS), 600 כלוריד nitrotetrazolium כחול מיקרומטר ו לקטט 30 מ מ) בצינור בגודל מתאים בהתאם לכמות מכתים הפתרון הנדרש. הערה: 1 מ"ל מספיקה לכסות לגמרי את שקופית אחת.</li>
	<li>להכין פתרון השני שבו כל ריאגנטים קיימים מלבד NAD. להכין פתרון השלישי שבו כל ריאגנטים קיימים מלבד לקטט.</li>
</ol>4. דגירה את השקופיות ב מכתים פתרון
<ol><li>בעדינות pipet הפתרון מכתימים או פתרונות בקרה על גבי שקופיות שהוכנו מראש המכסה הסעיף בשלמותו (1 מ"ל הוא מספיק עבור שקופית אחת). אם מספר שקופיות המעובדות יחד, טובלים כל השקופיות בתוך תמיסת מכתימים באותו זמן (ודא המכולה יש מספיק הפתרון לכסות לגמרי את סעיף הרקמה).</li>
	<li>דגירה השקופיות בסביבה humidified ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. אם צביעת פתרון נמצאת מעל לשקופית, למקם את השקופית בסביבה humidified כדי למנוע אידוי.</li>
</ol>5. הצג השקופיות
<ol><li>לפקח על ההמרה של הפתרון מכתימים שקוף כחול על ידי בדיקה חזותית. כאשר הדגימות הגיעו את הרמה הרצויה של מתפרצים, להפסיק את התגובה על ידי הסרת הפתרון מוכתמים. הערה: לעור, 10 דקות היא מספקת. הזמן תלוי האיבר ועל הפעילות האנזימטית מתרחשת.</li>
	<li>לשטוף שקופיות עם תמיסת מלח פוספט buffered מאת pipetting (1 מ"ל מספיקה עבור כל שקופית) או טבילה. הערה: דוגמיות תיערך השוואה בין אחד לשני. זה חייב להישמר בפתרון מכתימים עבור אותה כמות של זמן</li>
</ol>6. counterstain והר
<ol><li>Pipet counterstain על השקופיות כאשר השקופיות הגיעו רמה מתאימה של מתפרצים. הערה: Counterstains שהופכים את הגרעינים אדום או ירוק יעניק קונטרסט טוב הכחול שנוצר formazan precipitant.</li>
	<li>הר עם מימית או הלא-מימית הרכבה בינונית22. שנה עד שלוש טיפות (40-50 µL) של הרכבה בינונית מספיקה בהתאם לגודל של תגית כיסוי.</li>
</ol>7. תמונה שקופיות ולכמת
<ol><li>תמונות שקופיות תחת מיקרוסקופ אור. קח תמונות של הניסוי, ודוגמאות שליטה כל הפקדים שלילי-10 X 20 X, 40 X הגדלה.</li>
	<li>קבע את עוצמת כתם כחול באזורים שונים עם תוכנת ניתוח התמונה.</li>
</ol>

<ol><li>Boonacker, E., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+cytochemical+techniques+for+metabolic+mapping+in+living+cells%2C+with+special+reference+to+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme cytochemical techniques for metabolic mapping in living cells, with special reference to proteolysis.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1473-1486 (2001).</li>
<li>Seidler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetrazolium-formazan+system%3A+Design+and+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The tetrazolium-formazan system: Design and histochemistry.</a> Prog Histochem Cytochem. 24, 1-86 (1991).</li>
<li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Noorden%2C+CJF+%22Enzyme+Histochemistry%3A+A+Laboratory+Manual+of+Current+Methods%22">Enzyme Histochemistry: A Laboratory Manual of Current Methods</a>. , Bios. (1992).</li>
<li>Winzer, K., Van Noorden, C. J., Kohler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cytochemical+analysis+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+living+isolated+hepatocytes+of+European+flounder+for+rapid+analysis+of+xenobiotic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative cytochemical analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in living isolated hepatocytes of European flounder for rapid analysis of xenobiotic effects.</a> J Histochem Cytochem. 49, 1025-1032 (2001).</li>
<li>Negi, D. S., Stephens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+histochemical+localization+of+glucose-6-phoshate+dehydrogenase+in+animal+and+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for the histochemical localization of glucose-6-phoshate dehydrogenase in animal and plant tissues.</a> J Histochem Cytochem. 25, 149-154 (1977).</li>
<li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+transketolase+activity+in+epithelial+cells+of+different+rat+tissues+and+subcellularly+in+liver+parenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ localization of transketolase activity in epithelial cells of different rat tissues and subcellularly in liver parenchymal cells.</a> J Histochem Cytochem. 54, 191-199 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+metabolic+configurations+of+single+cells+within+complex+tissue+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Exploring metabolic configurations of single cells within complex tissue microenvironments.</a> Cell Metab. , (2017).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+serum+lactate+dehydrogenase+in+renal+cell+carcinoma%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of serum lactate dehydrogenase in renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis.</a> PLoS One. 11, e0166482(2016).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+serum+LDH+in+small+cell+lung+cancer%3A+A+systematic+review+with+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of serum LDH in small cell lung cancer: A systematic review with meta-analysis.</a> Cancer Biomark. 16, 415-423 (2016).</li>
<li>Petrelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+role+of+lactate+dehydrogenase+in+solid+tumors%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+76+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic role of lactate dehydrogenase in solid tumors: a systematic review and meta-analysis of 76 studies.</a> Acta Oncol. 54, 961-970 (2015).</li>
<li>Valvona, C. J., Fillmore, H. L., Nunn, P. B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+and+function+of+lactate+dehydrogenase+A%3A+Therapeutic+potential+in+brain+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">The regulation and function of lactate dehydrogenase A: Therapeutic potential in brain tumor.</a> Brain Pathol. 26, 3-17 (2016).</li>
<li>Markert, C. L., Shaklee, J. B., Whitt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+gene%3A+Multiple+genes+for+LDH+isozymes+provide+a+model+of+the+evolution+of+gene+structure%2C+function+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of a gene: Multiple genes for LDH isozymes provide a model of the evolution of gene structure, function and regulation.</a> Science. 189, 102-114 (1975).</li>
<li>Read, J. A., Winter, V. J., Eszes, C. M., Sessions, R. B., Brady, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+altered+activity+of+M-+and+H-isozyme+forms+of+human+lactate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase.</a> Proteins. 43, 175-185 (2001).</li>
<li>Holness, M. J., Sugden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pyruvate+dehydrogenase+complex+activity+by+reversible+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation.</a> Biochem Soc Trans. 31, 1143-1151 (2003).</li>
<li>Yi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphofructokinase+1+glycosylation+regulates+cell+growth+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phosphofructokinase 1 glycosylation regulates cell growth and metabolism.</a> Science. 337, 975-980 (2012).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+lactate+dehydrogenase+A+is+important+for+NADH%2FNAD%28%2B%29+redox+homeostasis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 31, 4938-4950 (2011).</li>
<li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine-5+acetylation+negatively+regulates+lactate+dehydrogenase+A+and+is+decreased+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Lysine-5 acetylation negatively regulates lactate dehydrogenase A and is decreased in pancreatic cancer.</a> Cancer Cell. 23, 464-476 (2013).</li>
<li>Vanderlinde, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+total+lactate+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">Measurement of total lactate dehydrogenase activity.</a> Ann Clin Lab Sci. 15, 13-31 (1985).</li>
<li>Nelson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+imaging+of+patients+with+prostate+cancer+using+hyperpolarized+%5B1-%281%29%283%29C%5Dpyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-(1)(3)C]pyruvate.</a> Sci Transl Med. 5, 198ra108(2013).</li>
<li>Flores, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactate+dehydrogenase+activity+drives+hair+follicle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lactate dehydrogenase activity drives hair follicle stem cell activation.</a> Nat Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, pdb prot4991 (2008).</li>
<li>Espada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-aqueous+permanent+mounting+for+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-aqueous permanent mounting for immunofluorescence microscopy.</a> Histochem Cell Biol. 123, 329-334 (2005).</li>
<li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+A+photochemically+stable+electron+mediator+between+NADH+and+various+electron+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. A photochemically stable electron mediator between NADH and various electron acceptors.</a> J Biochem. 82, 1469-1473 (1977).</li>
</ol>

המחברים יש אינטרסים מתחרים לא לחשוף.

השיטה המתוארת כאן יכול לשמש כדי לפקח על הפעילות של לקטט דהידרוגנאז או אחרים אנזימים מטבוליים הפקת NADH או nadph ל, סוגי תאים שונים בתוך רקמה או חלקים שונים של רקמה לאורך זמן. לקטט דהידרוגנאז הוא אנזים חשוב להבנת הביולוגיה של תאי גזע, גידולים, היכולת לעקוב אחר פעילות לקטט דהידרוגנאז בתאים בודדים סביר לספק תובנות חשובות הפונקציה של אנזים זה.
אחד יתרון חשוב של פרוטוקול זה לעומת שיטות אחרות זה היכולת צג פעילות אנזימטיות, ולא רק חלבון שפע, יכול לגרום יותר חד משמעיות מידע אודות לא רק איפה אנזימים לק...

הבנה של המיקומים בתוך הרקמות שבו אנזימים יש פעילות גבוהה או נמוכה חיוני עבור פיתוח הבנה ופיזיולוגיה. רמות חלבון או תעתיק משמשים כתחליף לפעילות אנזימטיות. בעוד מחקרים כאלה יכולים להיות אינפורמטיבי, הם אינם מספקים מידע יכול להיות קריטי לקביעת הפעילות של אנזים, כגון שינויים post-translational, הנוכחות של חלבון מתחמי או הלוקליזציה של האנזים subcellular. כאשר פעילות אנזימטי נמדד באופן ישיר, הוא לעתים קרובות מנוטר ב lysates חלבון הומוגני יותר המכילים מידע אודות תאים בודדים בתוך התערובת או את התפוצה המרחבית של התאים עם פעילות גבוה או נמוך בתוך רקמה.
אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט עבור מיפוי את התפוצה המרחבית של פעילות אנזימטי בתוך דגימת רקמה. המתודולוגיה מבוססת על מחקרים מוקדמים יותר הוכחת כי מלחי tetrazolium ניתן למקם את הפעילות של dehydrogenases, reductases ו oxidases רקמות קפוא1. באמצעות שיטות אלה, formazan לא מסיס-מים נוצר כאשר פרוטונים מועברים מלח2,tetrazolium3. גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז מחוללת nadph של פרוטון, זוהתה עם פעילות tetrazolium. גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז נמצא במעקב ב התלבט האירופית hepatocytes4, מכתשי מסוג 2 תאים של הריאות5 ו nephrons של כליות5. מלחי Tetrazolium שימשו גם לעקוב אחר פעילות transketolase רקמות קפואים6. בגישה דומה שימש לאחרונה כדי לפקח על הפעילות של dehydrogenases מרובות בתוך הרקמה זהה על שקופיות סמוכים7.
נתאר כאן שיטה לשימוש tetrazolium מלחי כדי לנטר את התפוצה המרחבית של פעילות לקטט דהידרוגנאז (איור 1). לקטט דהידרוגנאז ניתן להמיר פירובט שנוצרו על-ידי גליקוליזה בלי חולצה, ואת התגובה הפוכה. לקטט דהידרוגנאז פעילות היא אפוא דטרמיננטה חשוב של פירובט הכניסה לתוך מחזור חומצה tricarboxylic לעומת שלה הפרשת כפי לקטט. רמת חומצת החלב בדם משמשים לעתים קרובות כדי לאבחן מגוון של מחלות, כולל סרטן8,9,10, כי זה יכול לאותת כי מחלה או פציעה יש התאים הפגועים, האנזים שוחררה.
ישנם ארבעה גנים לקטט דהידרוגנאז: LDHA, LDHB, LDHC ו- LDHD11. LDHA ו- LDHB הם חשבו שהתעוררו כתוצאה לכפל ג'ין מוקדם LDHA12. LDH פעיל כמו tetramer, LDHA, LDHB יכול ליצור homotetramers ו- heterotetramers אחד עם השני. LDHA הוא דיווח יש זיקה גבוהה יותר עבור פירובט, בעוד LDHB הוא דיווח יש זיקה גבוהה יותר עבור לקטט, מעדיפים להמיר לקטט פירובט13. האמרגן LDHA מכיל אתרי קישור HIF1α, cMYC ו FOXM1 שעתוק גורמים11. בנוסף, כמו רבים אחרים אנזימים glycolytic14,15, LDH יכול להיות שונה על-ידי שינויים post-translational. קולטן גורם הצמיחה פיברובלסט 1 יכול phosphorylate LDHA Y10, המקדם גיבוש tetramer, או Y83, אשר מקדם NADH המצע איגוד16. LDHA יכול להיות גם acetylated17. מסיבות אלו, הבנה מלאה של פעילות LDH דורש ניטור רמות החלבון LDH אלא גם הפעילות של האנזים.
בנוסף השיטה שאנו מציגים כאן, גישות אחרות שימשו כדי לעקוב אחר פעילות לקטט דהידרוגנאז. ניתן לנטר פעילות לקטט דהידרוגנאז spectrophotometrically הומוגני חלבון lysate. הדור של NADH כפי מומר לקטט פירובט ניתן למדוד בהתבסס על ספיגת-340 nm, בעוד ניתן לנטר את היעלמותו של NADH כפי פירובט מומר לקטט18. לקטט דהידרוגנאז פעילות גם נמצא במעקב עם תהודה מגנטית (MRI). 13 C-פירובט יכול להינתן ו ניתן לנטר את ההמרה של פירובט תניקי כיחס בין [1 -13C] לקטט / [1 -13C] פירובט. גבוה יחסי של [1 -13C] לקטט / [1 -13C] פירובט נצפו סרטן רקמות19. בעוד גישות MRI יכול לספק מידע על פעילות לקטט דהידרוגנאז רגילה ורקמות המחלה, למתודולוגיות אין רזולוציה צריך לקבוע את רמת פעילות תאים מסוימים. המתודולוגיה שסופק כאן יכול לספק מידע על פעילות לקטט דהידרוגנאז באזורים רקמות, אפילו בתאים בודדים.
שימוש בבאתרו פעילות מבחני, מצאנו כי הפעילות של לקטט דהידרוגנאז גבוה בתאי גזע זקיק השיער העכבר העור20. השתמשנו גם השיטה כדי לפקח על הפעילות של לקטט דהידרוגנאז ב בתרבית תאי גזע עובריים ומצא שהפעילות הוא גבוה בתאי גזע יותר בשכבה מזין. לבסוף אנחנו במעקב את הפעילות של לקטט דהידרוגנאז העכבר טרי לאבי העורקים, נצפתה צביעת תאי שריר חלק. נתאר כאן פרוטוקול מפורט עבור ניטור פעילות לקטט דהידרוגנאז בעור העכבר קפוא.

<table><tbody><tr>מכשירים <td></td><td></td><td>כירורגיים</td><td>לאיסוף עור מעכברים שעברו המתת חסד</td></tr><tr><td>Tissue-tek cryomold 25 מ"מ x 20 מ"מ x 5 מ"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td>להקפאת עור עכבר</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. תרכובת</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9638938</td><td>להרכבת תבניות cryomoulds</td></tr><tr><td>דלי קרח</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-106</td><td></td></tr><tr><td>קרח יבש</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקופית הידבקות פוליזין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-545-78</td><td></td></tr><tr><td>4% פורמלין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-245-684</td><td>מדולל במים</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח, pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערבולת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריס בסיס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-245-684</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Phenazine methosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazolium blue chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום L-לקטט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2250</td><td>מצע</td></tr><tr><td>37&deg; חממת C (או חממת תרבית רקמות)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ברזילאי! כתם נגד</td><td>Anatech</td><td>861</td><td>כתם נגד</td></tr><tr><td>הרכבה בינונית</td><td>מעבדות וקטור</td><td>H-5000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פתקי כיסוי לשקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td> אור</tr></tbody></table>

מיפוי החומרים: פיקוח על פעילות לקטט דהידרוגנאז ישירות בתוך הרקמה

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

מיפוי פעילות אנזימטי במרחב ובזמן חיוני להבנת הבסיס המולקולרי של התנהגות התא בתוך הרקמות ומחלות. בחיי עיר פעילות חילוף החומרים מבחני יכול לספק מידע על חלוקת מרחבי פעילות חילוף החומרים בתוך רקמה. אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט עבור ניטור פעילות האנזים לקטט דהידרוגנאז ישירות בדגימות רקמה. לקטט דהידרוגנאז הוא דטרמיננטה חשוב של אם נצרך גלוקוז יומרו האנרגיה דרך גליקוליזה אירובי או אנאירובי. פתרון המכיל NAD ו לקטט מסופק על קטע רקמה קפוא. תאים עם פעילות גבוהה לקטט דהידרוגנאז יהיה להמיר את לקטט שסופקו פירובט, בעוד בו-זמנית המרת nicotinamide אדנין dinucleotide (NAD) NADH ו פרוטון, אשר ניתן לאתרם מבוסס על הפחתת nitrotetrazolium כחול formazan, אשר הוא מדמיין כמו התמיסה כחול. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור ניטור פעילות לקטט דהידרוגנאז בעור העכבר. יישום פרוטוקול זה, מצאנו כי פעילות לקטט דהידרוגנאז גבוה בתאי גזע השבתה הדרגתית זקיק השיער בתוך העור. החלת הפרוטוקול בתאי גזע עובריים בעכבר בתרבית חשף מכתים גבוה יותר ב בתרבית תאי גזע עובריים מאשר fibroblasts עובריים בעכבר. ניתוח של אבי העורקים העכבר טרי מבודד גילה מכתים בתאי השריר החלק בניצב אבי העורקים. המתודולוגיה המסופקים ניתן למפות במרחב הפעילות של אנזימים המייצרים פרוטון ברקמת קפואים או טריים.

אנחנו דיווחו בעבר כי תוצאות בחיי עיר פעילות מבחני העור העכבר20. כפי שמוצג באיור3, נצפו רמות גבוהות של לקטט דהידרוגנאז פעילות תאי גזע זקיק השיער בבסיס זקיק השיער כאשר ההליכים המתוארים לעיל עקבו. ממצאים אלה אומתו תא פלורסצנטיות מופעל מיון של עור תאי גזע זקיק השיער ולאשר גבוהה לקטט דהידרוגנאז פעילות בתוך התא בתאי גזע עם פעילות מבחני על תאים ממוינים.
בהתבסס על הממצאים של...

אנו מתארים פרוטוקול זמן התגובה. ממפה את התפוצה המרחבית של אנזימטי לפעילות אנזימים המייצרים nicotinatmide אדנין dinucleotide פוספט (NAD(P)H) + H + ישירות בדגימות רקמה.

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה כגון פעילות אנזימים במקומות שונים בתוך הרקמות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לחוקר לזהות פעילות אנזימטית ישירות בדגימות הרקמה. כדי להתחיל בהליך זה, הסר את שיער העכבר בעזרת גוזם שיער של בעלי חיים.בצע חתך בעור הגב בעזרת מספריים. לאחר מכן, הרם את העור וחתוך אותו. לאחר מכן, מלאו את ה-Cryomold בתרכובת ריאגנטים מקפיאה.בעזרת מלקחיים לאף מחט, הנח את חלקי העור לתוך ה-Cryomold של השדה. כוון את קטעי העור כך שחתך העור מהאפידרמיס לדרמיס, ההיפודרמיס והשריר יהיה גלוי. במידת האפשר, הרכיבו את עכברי הניסוי והביקורת יחד באותה Cryomold, כך שניתן יהיה לחתוך אותם לאותה שקופית ולעבד אותם יחד.הקפד לא ליצור בועות. הנח את ה-Cryomold על משטח ישר של גוש קרח יבש בדלי קרח. לאחסון, העבירו את ה-Cryomold למקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס.ניתן לשמור דגימות במקפיא כשלושה חודשים ללא אובדן משמעותי של פעילות אנזימטית. לצורך חיתוך, באמצעות קריוסטט המוגדר בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס, פורסים את הרקמה ליצירת חלקים בעובי שבעה עד 10 מיקרומטר לקבלת המורפולוגיה הטובה ביותר של העור. בהליך זה, קבע את מערך השקופיות לבדיקה, הכולל שקופית בקרה שעליה יימנע NAD, שקופית בקרה נוספת שעליה יימנע המצע לקטט, ושקופית בקרה חיובית מגוש רקמה קפוא שנחקר בעבר.תקן בקצרה

mapping-metabolism-monitoring-lactate-dehydrogenase-activity-directly

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון וידאו זה מתאר בדיקה קולורימטרית למדידת לקטט בליזטים של תאים באמצעות האנזים לקטט דהידרוגנאז. אנזים זה ממיר לקטט לפירובט, יחד עם המרה של NAD ל-NADH שמגיב עם צבעי טטרזוליום ונותן תוצר צבעוני שניתן למדוד ספקטרופוטומטרית כדי לכמת את הלקטט.

בדיקה קולורימטרית לכימות לקטט בדגימות בדיקה

סרטון זה מדגים את בדיקת הלקטט דהידרוגנאז, LDH למדידת ההשפעה ציטוטוקסית של חומר בדיקה והשפעתו על שלמות הממברנה בפרוסות ריאה חתוכות בדייקנות אנושית. הבדיקה מספקת מדד כמותי של מוות או נזק של תאים בדגימה.

הערכת ציטוטוקסיות ותקינות הממברנה בפרוסות ריאה באמצעות בדיקת לקטט דהידרוגנאז

קיטוב גרעיני דינמי עם פירוק הדגימה שלאחר מכן איפשר מחקרים בזמן אמת של חילוף חומרים במערכות ביולוגיות. היפרפולריזציה [1-13C] פירובט שימשה לחקר פעילות לקטט דהידרוגנאז בקו תאי קרצינומה של הערמונית במבחנה.

Hyperpolarized 13 ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית מטבולית C והדמיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להמחיש ולכמת פעילות של dehydrogenases, תאים, רקמות, קינטיקה, הפונקציה והאטרקציות לוקליזציה subcellular ברמה המיקרוסקופית.

מיפוי מטבולית: אנזים כמותית Cytochemistry ו להסטולוגיה כדי לקבוע את הפעילות של Dehydrogenases של תאים ורקמות

כאן מתואר פרוטוקול המאומת היטב ופשוט למדידת נפח פעילות פחמיות autophagic בתרבית של תאים. השיטה מבוססת על לכימות שחלקן של לקטט דהידרוגנאז (LDH) בחלקים תא sedimentable, לעומת סה כ רמות LDH הסלולר.

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

כאן, אנו חולקים שיטות למדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי, הגדרת המושג של energetics תזונתי, פרוטון הנזילה, הגורם העיקרי של חוסר היעילות בדור מיטוכונדריאלי של ATP. תוצאות אלו יכול להסביר 30% מהאנרגיה שקוע ניצול מזין כדי לעזור להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי.

מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי הכבד ואת פרוטון הדליפה קינטיקה להעריך נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר לחלב הולשטיין

במאמר זה אנו מציגים אוסף של בדיקות למדידה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים ללא תלות ביכולתם לצרוך חמצן מולקולרי.

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לדמיין את ההובלה של מונוקרבוקסילטים, גלוקוז ו- ATP בתאי גלייה ונוירונים באמצעות חיישנים מבוססי העברת אנרגיה בתהודה Förster המקודדים גנטית בהכנת מוח זחל דרוזופילה ex-vivo .

הדמיה של מונוקרבוקסילטים ומטבוליטים רלוונטיים אחרים במוח הזחל לשעבר Vivo Drosophila באמצעות חיישנים מקודדים גנטית

כאן, אנו מתארים בפירוט שיטות לחילוץ מקרופאגים ממח העצם, הטחול והלב האוטם, ולאחר מכן הערכת שטף מטבולי בתאים חיים.

ניתוח שטף מטבולי ex vivo במקרופאגים של הטחול והלב, ומונוציטים של מח העצם

פרוטוקול זה משלב מערכת ביו-ריאקטור שנבנתה בהתאמה אישית עם ספקטרוסקופיה של ¹³C NMR היפרפולרית כדי למדוד מטבוליזם פירובט בזמן אמת בתאים חיים, ולשפר את יכולת השחזור והדיוק הקינטי עבור מחקרים מטבוליים ויישומי סינון תרופות.

זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי 13C

למדו לזהות פעילות לקטט דהידרוגנאז ישירות ברקמות עכברים בשיטת מיפוי אנזימטי מרחבי. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מדויקת של פעילות NAD(P)H בתאי גזע של זקיקי שיער וביולוגיה התפתחותית.

מיפוי החומרים: פיקוח על פעילות לקטט דהידרוגנאז ישירות בתוך הרקמה

גלה סרטונים נוספים